专利名称：一种分离培养人脑膜瘤细胞的方法据报道，脑膜瘤 为常见的颅内肿瘤，约占颅内肿瘤总数的20%，其中，女性发病率更高。研究显示，脑膜瘤多数为良性，其病程长，分布大致与蛛网膜粒的分布情况相似，通常以大脑半球矢状窦旁为最多。手术切除是首选的临床治疗方法，治疗实践显示，部分脑膜瘤切除之后5年复发率较高；而部分肿瘤因部位较深或邻近重要脑部结构，术中很难做到手术全切，其中不能切除的、部分切除、或术后复发的常以放射治疗为主。目前临床不能做手术的和放射治疗的病人，其他治疗选择余地很小，已成为神经外科医师治疗脑膜瘤的一大难题。脑膜瘤细胞的体外培养是研究其发病及药物治疗的基础，但原代及传代培养人脑膜瘤细胞要比其它肿瘤细胞困难得多，迄今尚未建立起稳定高效的脑膜瘤培养方法。然而，脑膜瘤的临床前研究依赖于体外细胞模型和体内肿瘤模型的建立，体内模型的建立又依赖于高效率的体外细胞模型的建立，因此建立高效的脑膜瘤体外细胞模型成为研究脑膜瘤的必要手段。据研究报道，脑膜瘤组织细胞在体外很难长期传代培养，国内外许多学者所进行的脑膜瘤细胞的研究大都以原代细胞为主。国外有研究建立了几株脑膜瘤细胞株，但其中除了恶性者外，大都进行了基因干预才达到永生化，这样势必改变肿瘤细胞原有的特性，故而在这种细胞上研究所获得的结论不能准确反应体内的信息。因此建立高效的脑膜瘤细胞原代培养和传代培养体系，对研究其发病机制及开发新的药物治疗方法具有重要意义。目前，导致难以大量获得脑膜瘤原代细胞和传代培养细胞的因素有以下几方面:(I)脑膜瘤组织细胞间质包括基质/纤维多，采用机械分离或单一酶的方法难以消化脑膜瘤组织，硬性机械分离或酶长时间消化，导致细胞破碎，因此自组织中不能获得大量活细胞；(2)由于脑膜瘤大多数为良性，细胞生长缓慢，不能爬行到离组织块较远的无细胞区生长，只能在组织块周边爬出生长。所以细胞很难长满培养瓶底；(3)由于细胞生长速度较慢，单层细胞贴壁培养时，以常规细胞接种密度接种传代培养，难以长期传代下去；(4)未建立一种适合脑膜瘤细胞的培养系统，能促进脑膜瘤细胞增殖的生长因子或激素尚不清楚。本发明针对上述问题，建立了一套高效分离和传代培养人脑膜瘤的方法，获得了大量脑膜瘤细胞，经脑膜瘤特征性标志物波形蛋白(Vimentin)、上皮膜抗原(EMA)表达鉴定，证明所获得的细胞均为脑膜瘤细胞。
本发明的目的 是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种脑膜瘤细胞分离与培养的方法，尤其是一种从人脑膜瘤组织高效分离培养脑膜瘤原代细胞的方法。本发明进一步目的是提供一种稳定传代培养脑膜瘤细胞的方法。本发明提供了脑膜瘤细胞原代大规模培养及传代培养的方法，采用鸡尾酒式组合酶将人脑膜瘤组织经分步消化法，获得脑膜瘤细胞悬液，然后在特定的培养液中低氧培养，获得大量的原代脑膜瘤细胞；这些原代脑膜瘤细胞能在特定培养液及低氧条件下，悬浮培养至15代以上。本发明中，所述的组合酶包括中性蛋白酶(dispase)、胶原酶(collagenase)、DNA酶(DNase)，所述的组合酶以鸡尾酒式配方组成酶消化液；本发明中，所述的人脑膜瘤组织源于离体的病人脑膜瘤组织；本发明中，所述的分步消化法包括四步消化，每步消化后独立收集消化的悬液进行离心收集细胞；本发明中，所述的特定培养液包括下述组分:DMEM-F12，按1: 50添加B27补剂，20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，20ng/ml表皮生长因子(EGF)，10ng/ml白血病抑制因子(LIF)、5 μ g/ml 肝素(Heparin), 20nM 孕丽(Progesterone), IOOmM 雄稀二丽(Androstenedione)，50U/ml 青霉素-链霉素(penici 11 in-streptomycin)。本发明中，培养过程是采用1-5% O2, 5% CO2的低氧二氧化碳培养系统。具体而言，本发明的一种分离培养人脑膜瘤细胞的方法，其特征在于，其包括步骤:(I)人脑膜瘤原代细胞的分离:采用三种酶成分(dispase、collagenase、DNase)组成的鸡尾酒式酶消化液结合机械吹打，分步消化脑膜瘤组织以收集脑膜瘤细胞；(2)人脑膜瘤原代细胞的接种培养:配制特定的脑膜瘤细胞培养液以5X IO5个/ml接种进行原代细胞悬浮培养； 所述的特定的脑膜瘤细胞培养液含:DMEM-F12，添加B27 (I: 50)，20ng/mlbFGF,20ng/ml EGF,10ng/ml LIF>5 μ g/ml Heparin,20nM Progesterone ,IOOmMAndrostenedione ；(3)人脑膜瘤原代细胞的条件性培养:当培养液变黄，更换新鲜培养液时，每次更换一半新鲜培养液，以对脑膜瘤细胞实施条件性培养，该一半新鲜培养液与一半旧的培养液组成的配方称为条件性培养液；培养条件为37°C，5% CO2,1-5% O2 ；(4):人脑膜瘤细胞的传代培养a.人脑膜瘤细胞的悬浮传代培养:当细胞球直径大于200 μ m时，用TrypLE Express ( 一种改良胰酶)消化为单细胞后1: 2传代，培养液为条件性培养液，培养条件为 37°C，5% CO2,1-5% O2 ；b.人脑膜瘤细胞的贴壁传代培养:当细胞球直径大于200 μ m时，用TrypLE Express消化为单细胞后1: 2传代，培养液为条件性培养液添加10% FBS，培养条件为37°C，5% CO2,1-5% O2 ;细胞消化传代采用0.05%的Trypsin (胰酶)，消化后以1: 2传代接种。(5):人脑膜瘤细胞的鉴定对脑膜瘤细胞进行体外特征鉴定，包括vimentin、EMA> nestin(巢蛋白)、β -tublin(微管蛋白)、GFAP(神经胶质纤维酸性蛋白)、⑶31、⑶34、⑶45免疫荧光染色等指标检测；(6):人脑膜瘤细胞的冻存与复苏采用10% DMS0+90% FBS冻存人脑膜瘤细胞，采用常规复苏方法复苏脑膜瘤细胞。本发明所提供的鸡尾酒式组合酶及分步消化法有利于保存细胞活力，使消化所得的细胞基本为活细胞，为脑膜瘤细胞原代培养提供了细胞来源。该方法提供的鸡尾酒式组合酶、酶分步消化法、特定培养液体系及低氧培养系统有利于脑膜瘤细胞的分离及增殖，为进一步开展脑膜瘤机制及药物筛选研究提供了细胞来源。本发明的方法具有如下优点，1、有助于获取到大量可用于基础研究的脑膜瘤细胞。在本发明中，采用数种酶的鸡尾酒式配方消化液，有助于消化细胞间质及纤维；四步消化法有利于保存细胞活力，使消化所得的细胞基本为活细胞，为脑膜瘤细胞原代培养提供了细胞来源。2、提供了一种能促进人脑膜瘤细胞体外增殖的培养液。有证据表明约60% -90%的脑膜瘤表达孕酮受体，60%的脑膜瘤表达雄激素受体。为了促进脑膜瘤细胞的增殖，本发明所采用的培养液为 DMEM-F12，添加 B27 (I: 50)，20ng/mlbFGF, 20ng/ml EGF, 10ng/mlLIF>5 μ g/ml heparin, 50U/ml penicillin-streptomycin,以及 20nM Progesterone, IOOmMAndrostenedione 两种激素。3、本发明还提供了一种相对高效的脑膜瘤体外培养系统，培养条件为37°C，5%CO2,1-5% O20
4、本发明还检测了人脑膜瘤细胞的生物学特征和功能，为所述脑膜瘤发病机制的研究和药物筛选应用提供了可靠的数据，采用本发明获得的人脑膜瘤细胞不需经过基因干预即能传代培养至15代以上，为开展脑膜瘤发病机制提供了大量的细胞来源。


图1.显示了自脑膜瘤组织消化后接种的单细胞悬液，其中仍含有未完全消化的组织块。图2.显示了原代长成的细胞球。图3.显示了原代细胞球消化传代后长成的细胞球。图4.显示了原代细胞球消化传代后呈单层培养的细胞。图5.普通荧光显微镜显示视野中的细胞均表达脑膜瘤细胞标志物vimentin。图6.共聚焦显微镜显示细胞表达脑膜瘤细胞标志物vimentin。图7.共聚焦显微镜显示了脑膜瘤细胞标志物vimentin与EMA共标记突光鉴定结果O图8.共聚焦显微镜显示了脑膜瘤细胞标志物vimentin与VEGF共标记突光鉴定结果。图9.显示了脑膜瘤细胞标志物western-blot鉴定结果。

1.1试剂均为细胞培养级试剂，除另有说明外均为GIBCO产品。1.2材料来自复旦大学附属华山医院神经外科脑膜瘤患者手术切除的离体的脑膜瘤组织,共6例。1.3 方法(I)人脑膜瘤原代细胞的分离:a.无菌收集离体人脑膜瘤组织，将手术切除的脑膜瘤组织在冰预冷的HBSS中洗涤5次以上。b.用剪刀剪碎组织，将组织在含Dispase/Collegnase和0.04%的DNase的PBS中于37°C孵育30分钟，巴斯德吸管吹吸十次以上，然后垂直静止离心管5分钟，收集上层消化悬液，离心收集消化下来的细胞；c.添加适量酶于下层未消化完全的组织，放入培养箱消化15分钟，巴斯德吸管吹吸十次以上，然后垂直静止离心管5分钟，收集上层消化悬液，离心收集消化下来的细胞；d.重复步骤c两次(2)人脑膜瘤原代细胞的接种培养:以5X IO5个/ml接种在培养瓶中，培养液为DMEM-F12，添加 B27(l: 50)，20ng/ml bFGF, 20ng/ml EGF, 10ng/ml LIF,5y g/ml Heparin,20nM Progesterone, IOOmM Androstenedione。培养条件为 371,5% CO2, 3% 02。(3)人脑膜瘤原代细胞的条件性培养:当培养液变黄，更换新鲜培养液时，每次更换一半新鲜培养液，以对脑膜瘤细胞实施条件性培养，该一半新鲜培养液与一半老的培养液组成的配方称为条件性培养液。培养条件为37°C，5% CO2, 3% 02。
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(4):人脑膜瘤细胞的传代培养对所有离体人脑膜瘤组织的脑膜瘤细胞实施两种传代培养方式:a.人脑膜瘤细胞的条件性悬浮传代培养:当细胞球直径大于200μπι时，用TrypLE Express消化为单细胞后1: 2传代。培养液为条件性培养液。培养条件为37°C，5% CO2, 3% O20b.人脑膜瘤细胞的贴壁传代培养:当细胞球直径大于200 μ m时，用TrypLETMEXpreSS消化为单细胞后1: 2传代。培养液为条件性培养液添加10% FBS。培养条件为37°C，5% C02，3% 02。待细胞完全长满后，0.05%的Trypsin消化后以1: 2传代接种。(5):人脑膜瘤细胞的鉴定a.细胞免疫突光鉴定脑膜瘤标志物表达:检测的标记物包括vimentin、EMA、nestin、β _tublin、GFAP、CD31、CD34、CD45免疫荧光染色等指标检测。细胞经PBS清洗，室温下4%多聚甲醛中固定10分钟。于含0.2% Triton X-100的PBS中室温下孵育5分钟后，经PBS清洗两次，细胞于含4% BSA、10% FBS的PBS中室温下封闭60分钟。所用的一抗、二抗均以含4% BSAUO % FBS的PBS稀释。一抗孵育过夜，经PBS洗涤三次后，加入相应的二抗于室温孵育3小时，PBS洗涤三次。用含DAPI的抗荧光淬灭剂复染后，封片观察。b.western-blot鉴定脑膜瘤标志物表达:检测的蛋白包括vimentin、EMA>nestin、β-tublin、GFAP、⑶31、⑶34、⑶45免疫荧光染色等指标检测。离心收集细胞后，用蛋白裂解液裂解细胞，蛋白定量后，上样电泳、转膜。然后经一抗、二抗依次孵育标记，化学发光，显影，定影，观察拍照。
(6):人脑膜瘤细胞的冻存与复苏500g离心收集细胞，吸去上清，加入细胞冻存液(10% DMS0+90% FBS)，分装于细胞冻存管，每管500μ 1，放入冻存盒于-80°c冰箱中过夜。第二天转移入液氮中长期保存。将细胞在37°C水浴中解冻，然后300g离心去除冷冻液，加入人脑膜瘤细胞培养液，放入37°C，5% CO2, 3% O2进行培养。2.结果显示2.1.细胞分离与传代培养概况采用三种酶的鸡尾酒式配方消化液消化脑膜瘤组织，结合机械吹打的方法，自每位患者的脑膜瘤组织均获得了大量的单细胞(如图1所示)。这些细胞在特定的培养液(DMEM-F12，添加 B27(l: 50)，20ng/ml bFGF, 20ng/ml EGF，10ng/mlLIF、5 μ g/ml heparin,50U/ml penicillin-streptomycin,20nM Progesterone,IOOmMAndrostenedione0 )中，37°C,5% CO2, 3% O2低氧培养系统中能形成细胞球生长。细胞球消化后可继续呈细胞球或单层细胞生长(如图2、3所示)，但细胞增殖较慢，一般需8-9天可传代一次；本发明中的条件性特定培养液能促进脑膜瘤细胞呈细胞球或单层细胞增殖，传代达15代以上。细胞在10% DMS0,90% FBS中冻存后，可复苏继续培养增殖。2.2.免疫荧光鉴定脑膜瘤细胞标志物

免疫荧光分析结果显示6位患者的离体脑膜瘤组织培养的脑膜瘤细胞均表达vimentin,图5显示在普通突光显微镜下(低倍)，视野中的细胞均表达vimentin,证明所获得的细胞均为脑膜瘤细胞；荧光共聚焦显微镜进一步显示vimentin的表达特征(呈丝状微观分布，如图6所示)、以及其与EMA的共表达(如图7所示)；鉴定结果还发现脑膜瘤细胞表达VEGF(如图8所示)，提示脑膜瘤细胞具备潜在的血管生成能力；鉴定结果显示所获得的细胞均不表达神经细胞的标志物nestin、β -tubI in,GFAP,以及⑶31、⑶34、⑶45等膜抗原；所有结果证实，本发明获得的细胞为脑膜瘤组织来源的脑膜瘤细胞。2.3.western-blot鉴定脑膜瘤细胞蛋白表达western-blot结果显示6位患者的离体脑膜瘤组织培养的脑膜瘤细胞均表达vimentin、EMA，VEGF(如图 8 所示)，不表达 nestin、β _tublin、GFAP、CD31、CD34、CD45，结果证明获得的细胞均为脑膜瘤细胞。


本发明属于生物医学领域，涉及脑膜瘤细胞分离与培养的方法，尤其涉及一种从离体的人脑膜瘤组织分离和传代培养脑膜瘤细胞的方法。本发明方法采用鸡尾酒式组合酶将离体的人脑膜瘤组织进行分步消化，获得脑膜瘤细胞悬液，在特定的培养液中低氧培养，获得原代脑膜瘤细胞；获得的原代脑膜瘤细胞在特定的培养液及低氧条件下，悬浮培养至15代以上。本发明的鸡尾酒式组合酶及分步消化法有利于保存细胞活力，使消化所得的细胞基本为活细胞，为脑膜瘤细胞原代培养提供了细胞来源。该方法有利于脑膜瘤细胞的分离及增殖，为进一步开展脑膜瘤机制及药物筛选研究提供了细胞来源。