缺失gG,TK和gE基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒制作方法

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一种缺失gG,TK和gE基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒制作方法

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一种缺失gG,TK和gE基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒制作方法
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gG TK gE 缺失基因
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本发明属于动物病毒学和基因工程
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本发明的目的在于获得ー种免疫原性更好和安全性更强的牛传染性鼻气管炎病毒基因工程弱毒株本发明的第二个目的是利用上述牛传染性鼻气管炎病毒基因工程毒株制备牛传染性鼻气管炎基因エ程重组毒株和基因工程疫苗本发明通过以下技术方案实现申请人前期构建了双基因缺失的一种重组牛传染性鼻气管炎(InfectiousBovineRhinotracheitis，IBR)基因工程毒株，其命名为IBRVAgG/ATK株，于2010年10月23日保藏在湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号CCTCCN0V200915该毒株已经获得中国发明专利授权，其专利号200910273357.6本发明是已构建的亲本株IBRV八86/八!1((保藏编号0^0勵￥200915)基础上，继续将gE基因缺失实现本发明的主要思路是，首先构建gE基因的重组质粒pAZ1005，该质粒含有EGFP表达盒以便筛选将质粒pAZ1005和IBRVAgG/ATK基因组共转染于MDBK(牛肾细胞)细胞，以报告基因为标识，挑取发绿色荧光的空斑，体外研究本毒株的生物学特性，体内研究它的安全性和保护力，最终获得命名为牛传染性鼻气管炎病毒IBRVAgG/TK/gE/EGFP+基因工程毒株申请人将该基因工程毒株于2010年10月29日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCN0V201023本发明的主要优点是I、本发明通过同源重组的方法将IBRVAgG/ATK的gE基因完整缺失，国内外首次获得IBRVAgG/TK/gE/EGFP+毒株2、该病毒与针对gE蛋白和先前缺失的gG蛋白，可建立一或两种可区分野毒感染和疫苗免疫的鉴别诊断方法，为牛传染性鼻气管炎的预防、浄化提供了技术支撑3、本发明构建的gG，TK和gE三基因缺失株，比其亲本毒株安全性更好，因为缺失的基因多，病毒返祖的能力就会将大大降低，在疫苗开发方面具有更加广泛的前途更详细的发明方案见《具体实施方式》所述序列表SEQIDNO1是gE基因上游同源臂，报告基因EGFP和gE下游同源臂拼接的核苷酸序列，序列全长为483Ibp序列表SEQIDNO2是gE基因全长核苷酸序列(该片段在SEQIDNO1中已经缺失，其位置被EGFP所取代)，序列全长为1728bp图I是本发明的基本流程示意图图2是重组转移质粒AZ1005的构建流程图图3gE基因上、下游同源臂PCR扩增結果图中LaneMDL2000DNAMarker；LaneIgE基因上、下游同源臂大小分别为1160bp和1120bp图4是本发明的重组转移质粒转移质粒AZ1005酶切鉴定图MDL15000DNAMarker；1用HindIIIandEcoRI双酶切，结果可见两条带，大小分别为5.4kband4.3kb；图5是本发构建明时共转染后荧光显微镜下观察结果和筛斑图其中A和B为病毒基因组和转移质粒PAZ1005共转染后，自然光和绿色荧光显微镜下观察结果；C和D为筛斑第四次荧光显微镜下观察結果图6是鉴定本发明IBRVAgG/TK/gE/EGFP+PCR引物设计策略图图中的标注指明了四对引物的位置图I是鉴定本发明IBRVAgG/TK/gE/EGFP+PCR扩增图图中LineMDL2000DNAMarkerLinel-4IBRVAgG/TK/gE/EGFP+为模板，以p5，p6，p7，p8，p9，plO，pll，pl2(见具体实施方式)，为鉴定引物扩增出的片段Line5-8阴性对照图8本发明IBRVAgG/TK/gE/EGFP+与其他IBRV空斑比较結果横坐标代表感染的不同的IBRV，纵坐标表示感染IBRV后形成空斑的直径(Pm)图9是犊牛免疫IBRVAgG/TK/gE/EGFP+缺失株后的体温变化图10是犊牛免疫IBRVAgG/TK/gE/EGFP+缺失株后，用野生型毒株IBRV攻毒后的体温变化具体实施例方式图10是犊牛免疫IBRVAgG/TK/gE/EGFP+缺失株后，用野生型毒株IBRV攻毒后的体温变化实施例I制备实施例I.引物设计根据GenBank上发表的牛传染性鼻气管炎病毒基因组的全长核苷酸序列(GenBank登录号AJ004801)，设计两对引物即pl、p2，p3、p4(序列见下所示)，以IBRVDNA为模板，分别扩增gE基因的上下游同源臂，设计的酶切位点为HindIII、KpnI，片段大小约为1100bp，1100以及本发明的中间产物PCR鉴定引物(引物由上海生エ生物工程技术有限公司合成)分别如下(本发明及其中间产物中所缺失基因的大小及PCR鉴定时所扩增出的片段大小)扩增上下同源臂都为IlOObp左右片段的引物对pi5，agacgaaagetttcgcctcctgcccgcg3’(HindIII)(gE上游同源臂上游引物，下划线为酶切位点位置)P25’atgcccttttggtaccctctcgcgtgcgc3’(KpnI)(gE上游同源臂下游引物，下划线为酶切位点位置)p35’gcgcgactcaagtggatectccgc3’(BamHI)(gE下游同源臂上游引物，下划线为酶切位点位置)p45，cgaattccaagegccgccagegag3’(EcoRI)(gE下游同源臂下游引物，下划线为酶切位点位置)以下引物为鉴定缺失基因的特异引物p55，ctacaacgggaccgtcgagc3，(鉴定gE),p65，acgcgcagaaagtagagccct3，(鉴定gE)；P75，tgttaaatgggtctcgcgcggctcg3，(鉴定gE),p85，aatcgacgctcaagtcagaggtggc3，(鉴定gE)；P95，tgaacctgaaacataaaatgaatgca3’(鉴定gE),plO5，acgaggctttgtgtgagcgct3，(鉴定gE)；pll5，acaagatatagagaggcaagg3，(鉴定gE),pl25，gctggtcctccggctcctcg3，(鉴定gE)2.pAZ1005质粒的构建(见图2)根据GenBank上发表的牛传染性鼻气管炎病毒基因组的全长核苷酸序列(GenBank登录号AJ004801)，设计两对引物pl、p2，p3、p4，以IBRV的DNA为模板，分别扩增gE基因的上下游同源臂，设计的酶切位点为HindIII.KpnI，用pl、p2，p3、p4引物分别扩增出约IlOObp和IlOObp的特异性片断，与预期大小相符(如图3箭头所示)，上游同源臂扩增反应条件为950C5min，94°C45s,63°Clmin,72°C90s,30cycles,72°CIOmin,holdin4°C反应体系模板I.0uL,5mmol/LP12.0uL,5mmol/LP22.0uL,LaTaqI.0uL,2xGCbufferII25,lmmol/LdNTP2.OuLjH2O17yし下游同源臂扩增反应条件为95°C4min，94°C45s,63°Clmin，72で90s，30循环，72で10min，holdin4で模板I.0yL，SmmoVLP12.0uL,5mmol/LP22.0uL,LaTaqI.0uL,2xGCbufferII25,ImmoI/LdNTP2.0uL,H2O17yし回收之后连接到PMD18-T载体(宝生物工程大连有限公司)，测序结果显示，上下游同源臂分别为IlOObp和llOObp，与GenBank登录序列IBRV(登录号AJ004801)的同源性分别为100%和99%将质粒pcDNA3.I(+)myc-HisB(购自美国invitrogen公司)用HindIII和KpnI双酶切，将原外源片段切除，暴露出酶切位点的粘性末端，再将已连入载体PMD18-T上的gE基因上游同源臂，再用HindIII和KpnI进行双酶切，之后将该片段连入pcDNA3.I(+)myc-HisB中(其构建过程见图2)再将已连入gE基因上游同源臂的pcDNA3.I(+)myc-HisB和连有gE基因下游同源臂pMD18-T用BamHI和EcoRI进行双酶切，回收，16°C连接过夜，转化大肠杆菌DL5a，质粒的酶切鉴定见图4，最终命名为pAZ10056重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRVAgG/TK/gE/EGFP+缺失株的构建及鉴定(见图5，图6)在MDBK细胞(购自中国兽药监察所，北京)上增殖牛传染性鼻气管炎病毒IBRVAgG/ATK(2010年10月23日保藏在湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号CCTCCN0V200915)，提取牛传染性鼻气管炎病毒基因组DNA，具体方法如下待MDBK细胞病变达80%以上，收集病毒，蔗糖梯度离心，25000rpm，处理2h用TE溶解，加十二烷基磺酸钠(SDS)裂解液裂解及RNA酶水浴30mins，再加蛋白酶K水浴作用30mins;然后用苯酹氯仿异戍醇(体积比为2524I)抽提四次,用无水こ醚去除苯酚、氯仿和异戊醇，最后用无水こ醇将病毒基因组沉淀出来将制备好的病毒基因组与线性化(将上下游同源臂从PAZ1005转移质粒酶切下来)共转染于MDBK细胞，挑取发绿色荧光的空斑并将其纯化用鉴定引物p5/p6，p7/p8，p9/pl0,pll/pl2(引物设计策略见图7)进行PCR扩增，其片段大小分别为240bp，288bp，255bp和219bp，结果如图6所示实施例2(重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRVAgG/TK/gE/EGFP+缺失株的体外生物学实验)将本发明与本申请人农业微生物国家重点实验室分离和构建的牛传染性鼻气管炎病毒IBRVHB06株(临床分离株)(2010年10月29日保藏在湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号CCTCCNOV201024)，将牛传染性鼻气管炎病毒gGVEGFP+(陈程，2009见中国知网http//www.cnki.net/kcms/detail/detail,aspxdbcode=CMFD&QuerylD=l&CurRec=l&dbname=CMFD0911&fiIename=2008203361.nh&uid=WEEvREdiSUtucElBVlVFQ2RNNHFWVUhjQkRffNlBpazO=)与牛传染性鼻气管炎病毒TKT/EGFP+(定明，2010;中国知网http//www.cnki.net/kcms/detail/detail,aspxdbcode=CMFD&QuerylD=2&CurRec=l&dbname=CMFDTEMP&fiIename=1010010044.nh&uid=WEEvREdiSUtucElBVlVFQ2RNNHFWVUhjQkRffNlBpazO=)株进行空斑比较，具体实验步骤为将长满六孔板的细胞接种上述病毒，在37°C温箱中吸附2小时之后弃掉上清，用3%的甲基纤维素覆盖，48小时后用10%中性甲醛固定，冲洗干净后在显微镜下观察，发现IBRVAgG/TK/gE/EGFP+形成空斑的直径比其他病毒形成的要小，与野毒相比本发明的IBRVAgG/TK/gE/EGFP+缺失株形成的空斑直径减小达到54.43%(见图8)实施例3应用实施例(利用重组牛传染性鼻气管炎病毒AgG/TK/gE/EGFP+缺失株免疫犊牛，并利用野生型牛传染性鼻气管炎病毒进行攻毒实验)将IBRVAgG/TK/gE/EGFP+缺失株滴鼻免疫0.5岁犊母牛，并同时设非免疫组和牛传染性鼻气管炎病毒野毒组作对照，接种后测量母牛0-15天直肠温度，结果证明接种IBRVAgG/TK/gE/EGFP+后母牛的体温都在正常范围，没有出现发烧现象，而接种了野生型牛传染性鼻气管炎病毒的母牛发烧持续了6天(见图9)在28天时，将免疫IBRVAgG/TK/gE/EGFP+的母牛进行攻毒，攻毒后实测体温证明免疫了IBRVAgG/TK/gE/EGFP+的母牛没有出现发烧现象，而没有免疫的母牛都有发烧并且持续了5-6天(见图10)权利要求1.重组牛传染性鼻气管炎病毒毒株IBRVAgG/TK/gE/EGFP+，其特征在于该毒株保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNOV201023，该毒株缺失了gG、TK、gE三个基因2.包含权利要求I所述的毒株IBRVAgG/TK/gE/EGFP+的牛传染性鼻气管炎基因工程疫苗3.权利要求I所述的毒株在制备牛传染性鼻气管炎病毒基因工程重组病毒中应用4.权利要求I所述的毒株在制备牛传染性鼻气管炎病毒基因工程疫苗中的应用全文摘要本发明属于动物病毒学和动物基因工程

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专利名称：：一种缺失gG,TK和gE基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒的制作方法技术领域：，具体涉及三基因缺失的一种重组牛传染性鼻气管炎病毒，该病毒缺失了gG、TK和gE基因。该毒株的毒力降低而免疫原性没有改变。本发明还包括利用该重组病毒制备牛传染性鼻气管炎病毒疫苗以及该疫苗的应用。：牛传染性鼻气管炎(InfectiousBovineRhinotracheitis,IBR),又称“坏死性鼻炎”或“红鼻病”，是由牛传染性鼻气管炎病毒(InfectiousBovineRhinotracheitisviruses,IBRV)引起的、牛的ー种急性、热性、接触性传染病，该病的危害性在于病毒侵入牛体后，可潜伏于一定部位，导致持续性感染，病牛长期乃至终生带毒，在机体抵抗力下降吋，又向外排毒。该病对奶牛的产奶量、公牛的繁殖力及役用牛的使役力均有较大的影响，而且急性呼吸道感染可继发牛致命性细菌性肺炎，是造成养牛业经济损失的主要原因之一。该病在世界范围内流行，并且每年都给养牛业造成巨大的经济损失。目前只有少数欧洲国家已经根除了本病，其他ー些国家正在实施扑灭计划，或使用标记疫苗区分自然感染和疫苗免疫的牛群，以便于更好的进行监控和防制。IBRV为有囊膜的双股DNA病毒，病毒粒子呈圆球型，成熟病毒粒子直径约150-220nm，主要由核心、衣壳和囊膜组成。核心由双股DNA和蛋白质缠绕而成，其核衣壳为立体対称的二十面体，外观呈六角形，上面有162个壳粒，周围为ー层含脂质的囊膜。双股DNA分子量为84X106，其中G+C含量为72%。据测IBRV基因组可编码大约70个蛋白质，其结构和功能目前大部分已知(李继昌，牛传染性鼻气管炎病的研究进展，黑龙江畜牧兽医.2002，4:50)，其中含有2533种结构蛋白。存在于病毒囊膜的gB、gC、gD和gE四个主要糖蛋白基因已经测序并在原核和哺乳动物中表达。IBRV糖蛋白能刺激机体产生中和抗体，并且在补体的存在下使感染细胞裂解。gB、gC、gD和gE四个基因主要负责病毒的吸附、滲透和在细胞之间扩散病毒(BelknapEB,WaltersLM.,KellingC,AyersVK,NorrisJ,McMillenJ,HayhowC,CochranM,ReddyDN,WrightJ,CollinsJK.ImmunogenicityandprotectiveeffcacyofagE,gGandUS2gene_deletedbovineherpesvirus-1(BHV-I)vaccine.Vaccine,1999,17(18):2297-2305),gB、gC、gD是刺激宿主免疫应答的主要抗原蛋白(TikooSK,CamposM,BabiukLA.BovineherpesvirusI(BHV-I)biology,pathogenesis,andcontrol.Adv.VirusRes,1995,45=191-223),gD能诱导产生最高水平的体液和细胞免疫(BabiukLA，vanDrunenLittei—vandenHurkS,TikooSK,LewisPJ,LiangX.Novelviralvaccinesforlivestock.Vet.ImmunoIImmunopatho1,1996,54(1-4):355-363)。gBgB能引起细胞融合，在哺乳动物细胞中的表达显示出引起细胞融合和多核体的形成，对病毒复制是必需的，国内学对其实现了原核表达并对表达产物的抗原性进行了分析，在杆状病毒中表达的抗原性较gC、gD弱；细胞表面的糖蛋白相互作用，介导病毒吸附的起始，可能调控病毒的数个反式激活子的结合作用，但对病毒的感染并非必需；糖蛋白gB对于穿孔是必需的，并且已经证实侵袭神经和通过神经传播需要gBgC:gC是BHV-I表达最多的糖蛋白，并且在病毒粒子表面即体液中和抗体和细胞毒性T细胞反应的有效部位能够形成最清晰的影象。它对病毒吸附组织培养细胞是重要的，但它在牛细胞内的表达并不影响病毒蚀斑的数量和病毒的存在。此外，gC促进病毒的穿透即病毒进入细胞的第二过程，也可能參与病毒复制的其他过程。BHV-1、HSV-I和IBRV的gC蛋白与细胞表面的糖蛋白相互作用，介导病毒吸附的起始，还能够诱导细胞介导的免疫应答。gDgD与病毒穿透，进入宿主细胞有关，含有gD基因的质粒作为免疫原可能诱导细胞毒性淋巴细胞的反应(Muralidhar，2002)，被认为是病毒粒子表面和病毒感染细胞的主要分子。与其它相关的几种糖蛋白比较，抗gD抗体的病毒中和效果最好，具有制备亚单位疫苗的前景。鼠和牛的免疫试验显示出gD能够引起比gB、gC更强而持久的细胞免疫。gGgG是IBRV的主要囊膜糖蛋白之一,具有很强的抗原性(HartleyCA,DrummerHE，^tudaertMJ.ThenucleotidesequenceoftheglycoproteinKjhomologueoiequineherpesvirus3(EHV3)indicatesEHV3isadistinctequidalphaherpesvirus.ArchVirol,1999,144(10):2023-2033)，是许多疱疹病毒的诊断抗原，被广泛用于其它疱疹病毒感染性疾病的血清学诊断。同时，糖蛋白gG也是病毒复制非必需的分泌性蛋白，它在a疱疫病毒中相对保守(NakamichiK,OharaK,KurokiD,OtsukaH.BovineherpesviruslglycoproteinKjisrequiredforviralgrowthbycell—to—cellinfection,virusreseach200068:175-181)。可影响病毒在宿主細胞内有效增殖与細胞间扩散，与病毒毒カ相关，已被广泛用作IBRV外的其它疱疹病毒的诊断抗原。同时gG蛋白因为能与体内的趋化因子受体结合，因此又被认为是ー种免疫抑制因子(NakamichiK，KurokiD，MatsumotoY，OtsukaH.BovineherpesvirusIglycoproteinKjisrequiredforpreventionofapoptosisandefucientviralgrowthinrabbitkidneycells.Virology,2001,279(2):488-498；NakamichiK，MatsumotoY，OtsukaH.BovineherpesvirusIglycoproteinGisnecessaryformaintainingcell—to—celljunctionaladherenceamonginfectedcells.Virology，2002，294(I):22-30;SaschaTrapp,NikolausOsterrieder，GiintherM.Keil,MartinBeer.MutagenesisofabovineherpesvirustypeIgenomeclonedasaninfectiousbacterialartificialchromosomeanalysisofglycoproteinEandGdoubledeletionmutants.Virology，2003，84:301-306;BryantNA，Davis-PoynterN,VanderplasschenA，AlcamiA.GlycoproteinGisoformsfromsomealphaherpesvirusesfunctionasbroad—spectrumchemokinebindingproteins.EMBOJ.2003Feb17；22(4):833-46)。TK:TK基因在核酸代谢中起重要作用，是a-疱疹病毒的毒力基因，对病毒的复制并非需要，但对病毒維持在神经组织的持续性感染十分重要。所以，TK基因一直是疱疹病毒分子生物学研究的热点之一。TK基因缺失后可使毒力降低，并且在非分裂细胞中的复制能カ也很低，从而使潜伏的病毒不易激活，因此在研制基因缺失疫苗吋，TK基因是常用的靶基因(KitS,OaviH,GainesJD,BillingsleyP,McConnellS.Thymidinekinase-negativebovineherpesvirustypeImutantisstableandhighlyattenuatedincalves.ArchVirol,1985，86:63-83)。此外，病毒的TK基因比细胞的相应基因具有更广谱的磷酸化底物，在设计抗病毒治疗药物和治疗肿瘤药物时具有广泛的应用价值。gEgE是IBR病毒粒子的主要成分之一，它能够在病毒粒子表面及病毒感染细胞表面高水平表达，以细胞特异的方式影响病毒从感染细胞的释放，而且是中和抗体的主要作用靶位，因此gE是牛传染性鼻气管炎鉴别诊断的可靠标记。gE基因缺失也影响到病毒在细胞间的传播。在动物，gE的存在对病毒有效地感染中枢神经系统方面有重要作用。gE是病毒复制非必需的，这使基因缺失苗的构建成功成为可能，缺失gE特定部位的编码区能降低疫苗的毒カ且能充分抵抗病毒的入侵。研究表明，gE可用于ELISA诊断方法的建立。国外已经研制了TK/gE双基因缺失疫苗(KaashoekMJ,vanEngelenburgFA,MoermanA,GielkensAL,RijsewijkFA,vanOirschotJT.VetMicrobiol.1996Jan；48(1-2):143-53)。而我国的IBRV的血清学的阳性率很高(B.F.Yan,Serologicalsurveyofbovinenerpesvirustypelimectioninしnina,veterinarymicrobiogy,2007,127,136-141)。但我国尚无应对措施，所以研制出适合我国国情的安全高效疫苗具有重要意义。本实验室前期成功研制了TK/gE双基因缺失重组病毒，在此基础上，成功敲除了免疫抑制蛋白基因gG，获得三基因缺失重组病毒，并对其毒力、免疫原性等相关特性进行了评价。
技术领域：，具体涉及一种gG、TK和gE三基因缺失的重组牛传染性鼻气管炎病毒、基因工程疫苗及应用。本发明制备的重组牛传染性鼻气管炎病毒毒株IBRVΔgG/TK/gE/EGFP+保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOV201023，该毒株缺失了gG、TK和gE基因。本发明的亲本毒株即重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRVΔgG/TK，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNOV200915，该毒株缺失了gG和TK基因。本发明还公开了重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRVΔgG/TK/gE/EGFP+在牛传染性鼻气管炎的基因工程疫苗的制备和应用。文档编号A61P31/20GK102653731SQ20111005050公开日2012年9月5日申请日期2011年3月2日优先权日2011年3月2日发明者付书林,刘正飞,张敏敏,谢倩,邓明亮,郭爱珍,陈焕春申请人:华中农业大学

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