一种卵巢早衰非人哺乳动物模型的制备方法及其应用的制作方法[0003]卵巢早衰(POF) [4]的主要临床特征之一是患者血液中FSH水平的异常升高，提示POF患者卵巢组织对FSH的敏感性降低或消失。已有基于人群的研究证实，FSHR基因突变会导致遗传性卵巢早衰[5]。现有技术中仅仅研究了在实验动物体内诱导FSHR抗体对雄性小鼠生育力的影响以及遗传修饰的POF小鼠模型[6、7]。[0004]因此，本领域急需能够用于研究POF且简便易得的哺乳动物模型。
[0005]本发明的目的在于提供一种雌性非人哺乳动物模型以及所述模型在性成熟前卵巢早衰的治疗和特异治疗药物的筛选中的应用。[0006]在第一方面，本发明提供卵巢早衰的非人哺乳动物模型的制备方法，该方法利用衍生自FSHR的免疫原，免疫非人雌性哺乳动物得到所述卵巢早衰的非人哺乳动物模型。[0007]在优选的实施方式中，所述衍生自FSHR的免疫原包括选自下组的多肽:[0008](a)序列如 SEQ ID NO: K SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3 或 SEQ ID N0:4 所示的多肽；
[0009](b)包含(a)所限定的序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽。
[0010]在优选的实施方式中，所述多肽包含(a)所限定的序列经过1-3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且具有(a)所限定的多肽功能。
[0011]在优选的实施方式中，所述非人哺乳动物是啮齿类动物或灵长类动物；在另一优选的实施方式中，所述非人哺乳动物是小鼠、大鼠、豚鼠、家兔或猴，优选大鼠。
[0012]在优选的实施方式中，所述免疫通过口服、含服、喷雾、经鼻腔、经皮等方式实施。[0013]在优选的实施方式中，所述免疫进行一次或多次；优选进行三次。
[0014]在优选的实施方式中，与正常的非人哺乳动物相比，所述非人哺乳动物模型血液中的雌二醇水平有统计学显著的降低和/或FSH水平有统计学显著的升高和/或所述非人哺乳动物模型的后代窝仔数有统计学显著的降低。
[0015]在优选的实施方式中，所述雌二醇水平有统计学显著的降低是指与正常非人哺乳动物相比，所述非人哺乳动物模型血液中的雌二醇水平降低50%以上，优选50-90%，更优选70-80%ο
[0016]在优选的实施方式中，所述FSH水平有统计学显著的升高是指与正常非人哺乳动物相比，所述非人哺乳动物模型血液中的FSH水平升高20%以上，优选20%-50%，更优选30-40%ο
[0017]在优选的实施方式中，所述后代窝仔数有统计学显著的降低是指与正常非人哺乳动物相比，所述非人哺乳动物模型的窝仔数降低50%以上，优选50-90%，更优选70-80%。
[0018]在第二方面，本发明提供第一方面所述方法制备的卵巢早衰非人哺乳动物模型在筛选卵巢早衰治疗药物中的应用。
[0019]在第三方面，本发明提供筛选卵巢早衰治疗药物的方法，所述方法包括以下步骤:
[0020](a)将待测物质给予第一方面所述方法制备的卵巢早衰非人哺乳动物模型；和[0021 ] (b)检测所述动物模型中的雌二醇或FSH水平；
[0022]如果与给予待测物 质前的对照动物模型相比，给予待测物质的非人哺乳动物模型中所述雌二醇有统计学显著的升高和/或FSH浓度有统计学显著的降低，则待测物质是卵巢早衰治疗药物。
[0023]在优选的实施方式中，所述给予方法是口服、含服、喷雾或经皮给药。
[0024]在第四方面，本发明提供一种多肽，所述多肽选自下组:
[0025](a)序列如 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO:4 所示的多肽；
[0026](b)包含(a)所限定的序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽。
[0027]在优选的实施方式中，所述多肽包含(a)所限定的序列经过1-3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且具有(a)所限定的多肽功能。
[0028]在第五方面，本发明提供第四方面所述的多肽在制备药物中的用途。
[0029]在优选的实施方式中，所述药物用于影响FSH与FSHR结合；和/或
[0030]所述药物用于治疗卵巢早衰疾病；和/或
[0031]所述药物是避孕药。
[0032]在另一优选的实施方式中，所述的卵巢早衰疾病是因FSHR异常免疫反应所导致的，而所述药物通过中和FSHR抗体而起治疗作用。
[0033]在第六方面，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含第四方面所述的多肽以及药学上可接受的载体。
[0034]在优选的实施方式中，所述药物组合物是疫苗组合物或避孕药。
[0035]在第七方面，本发明提供第四方面所述的多肽在制备模型动物的用途，所述模型动物是卵巢早衰非人哺乳动物模型。[0036]在第八方面，本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码第四方面所述的多肽。
[0037]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。



[0038]图1显示了标注出胞外区的FSHR氨基酸序列。其中，下划线标记的氨基酸为重组表达蛋白(13-333aa) (SEQ ID NO:1)，红色标记的氨基酸(l_17aa)为信号肽序列，蓝色标记单独氨基酸为合成肽序列(17-27aa(SEQ ID NO:2)、182_194aa(SEQ ID NO:3)、207-219aa(SEQ ID NO:4))，均处于完整FSHR蛋白分子的胞外区。
[0039]图2显示了纯化重组蛋白rFSHR经SDS/PAGE分离的考马斯亮蓝染色结果。其中M为蛋白分子量Marker (SM0671);泳道1_2为纯化的重组蛋白his_rFSHR ;泳道3_4为纯化的重组蛋白GST-rFSHR ;泳道5-6为BSA蛋白标准品。
[0040]图3显示了经纯化的重组蛋白的Western blotting验证。照片A为兔抗FSHR多克隆抗体检测结果；照片B为鼠抗his单克隆抗体检测结果；照片C为兔抗GST多克隆抗体检测结果。其中，泳道M为蛋白分子量Marker (SM0671);泳道I为纯化的重组蛋白his_rFSHR ；泳道2为纯化的重组蛋白his-rFSHR ;泳道3为纯化的重组蛋白GST-rFSHR ;泳道4为纯化的重组蛋白GST-rFSHR。
[0041]图4显示了大鼠皮下免疫三次后血清抗体滴度水平随日龄的变化。重组蛋白组以His-rFSHR为免疫原；合成肽组以三段合成肽混合物偶联于KLH作为免疫原；佐剂对照组为仅仅皮下注射相应剂量的佐剂作为大鼠免疫的对照；三组均用GST-rFSHR作为包被抗原检测血清抗体滴度。
[0042]图5显示了幼年大鼠 经FSHR免疫后卵巢对促性腺激素的反应性。其中Con为空白对照；PMSG为未经免疫处理的同龄大鼠经过PSMG处理后的卵巢反应，作为免疫影响PMSG反应性的对照；rFSHR+PMSG为显示FSHR免疫反应对卵巢PMSG反应的影响的实验组。纵坐标表示卵巢重量，或者大鼠体重。各组之间进行t检验,发现rFSHR+PMSG组的卵巢的反应性，相对 PMSG 组(p=0.000)和 Con 组(p=0.027)均差异显著(ρ〈0.01)。
[0043]图6显示了经过FSHR免疫的大鼠抗血清特异结合于卵母细胞_复合体。利用FSHR免疫原常规免疫大鼠，获得免疫血清。通过常规荧光免疫检测，观察其中的特异抗体对大鼠卵母细胞-卵丘复合体上FSHR的识别情况。其中图片A为不加抗血清的免疫对照；Β为佐剂组大鼠的血清；(:为合成多肽作为免疫原的大鼠抗血清；D为以重组表达His-FSHR为免疫原的大鼠抗血清。

[0044]发明人经过广泛而深入的研究，人工制备了大鼠FSHR的重组多肽和三个人工合成多肽，出乎意料地发现通过皮下免疫后能获得血液中含有高水平FSHR抗体的大鼠，大鼠血液中FSHR抗体可以和卵巢颗粒细胞上的FSHR特异结合，导致其对FSH反应性降低，进而引发大鼠出现卵巢早衰的症状；发明人还出乎意料地发现本发明的多肽还能与自身FSHR抗体特异性结合，从而降低自身FSHR抗体的水平，进而用于治疗FSHR异常免疫反应导致的卵巢早衰等疾病。在此基础上完成了本发明。
[0045]哺乳动物
[0046]本文所用的术语“哺乳动物”指非人雌性哺乳动物，包括啮齿类动物和灵长类动物。在具体的实施方式中，所述非人哺乳动物是小鼠、大鼠、豚鼠、家兔或猴。在优选的实施方式中，所述非人哺乳动物包括大鼠和小鼠。在更优选的实施方式中，所述非人哺乳动物是大鼠。
[0047]模型动物的制备方法 [0048]本发明通过对FSHR分子结构的生物信息学分析，克隆其胞外区片段，构建原核表达质粒进行表达纯化，并合成三段可能与配体FSH结合的多肽。
[0049]用所得重组蛋白rFSHR和人工合成多肽主动免疫雌性非人哺乳动物后，该动物的血液中产生高滴度水平的抗体，进而检测到该动物的动情周期紊乱、发情期缩短、血液FSH水平上升、而血液雌激素水平降低。所述动物血液中FSHR抗体可以和卵巢颗粒细胞上的FSHR特异结合，导致其对促性腺激素的反应性降低，进而引发卵巢早衰症状的出现，从而得到卵巢早衰的动物模型。
[0050]在具体的实施方式中，所述免疫可进行一次或多次。在优选的实施方式中，所述免疫进行三次。
[0051]模型动物的用途
[0052]本发明的动物模型可用于研究哺乳动物的性成熟前卵巢早衰，确定治疗方案并用于特异治疗药物的筛选。
[0053]本发明的多肽
[0054]本发明所用的术语“多肽”具有本领域普通技术人员熟知的含义。
[0055]在优选的实施方式中，本发明的多肽包括序列如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQID NO: 3或SEQ ID NO:4所示的多肽。
[0056]本发明的多肽还包括所包含的序列是SEQ ID NO:1D NO: K SEQ ID N0:2、SEQ IDNO: 3或SEQ ID NO: 4所示序列经过1-5个氨基酸残基，优选1-3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且具有所需功能的衍生多肽。
[0057]本领域普通技术人员知道，一般在多肽的非必要区域改变少数个氨基酸残基基本上不会改变生物活性，即，适当替换氨基酸得到的序列并不影响其活性(可参见Watson等，Molecular Biology of The Gene,第四版，1987, The Benjamin/Cummings Pub.C0.P224)。本领域技术人员不难实施这种替换并且能确保所得分子的生物活性不改变。
[0058]在本发明中，优选的“衍生多肽”指与上述多肽的氨基酸序列(如SEQ ID N0:2、3或4)相比，有至多5个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地至多I个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据下表进行氨基酸替换而产生。
[0059]
最初的残基代表性的取代优选的取代
Ala (A)Val; Leu; HeVal