一种猪圆环病毒2型纯化方法[0002]猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2, PCV2)可能引起的一系列疾病，包括断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemiewasting syndrome,PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(Porcine dermatitis and nephrophathysyndrome, PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex, PRDC)。[0003]1997年，Clark等首次分离到猪圆环病毒2型。在2008年第20届国际猪病大会上，圆环病毒病被列为当前危害养猪业发展的头号疫病。我国在2000年证实猪群中存在PCV2感染，2002年由PCV2感染的引起的PWMS在全国呈暴发流行。猪圆环病毒病造成猪只生长慢，饲料报酬低，机体免疫力下降，给养猪业造成了严重威胁和巨大经济损失。据调查，PCV2在我国的阳性率已经达到80%以上。[0004]疫苗是预防该病的主要方法之一。目前，我国商品化的猪圆环病毒2型疫苗主要是全病毒灭活疫苗，其安全性和有效性主要受病毒滴度，抗原纯净性，灭活工艺及佐剂等因素的影响。商品化疫苗如果直接以细胞繁殖的病毒液进行成品苗的生产，会受到细胞破碎产物，培养基成分，细胞代谢产物等杂质的影响，致使疫苗免疫动物后易发生过敏反应，发热反应等副作用。所以，提高病毒滴度和抗原纯净性是提升疫苗质量基本途径。[0005]中空纤维膜过滤技术属于切向流过滤技术(Tangential Flow Filtration, TFF)的范畴，又称错流过滤(Cross-Flow Filtration, CFF):料液以一定的流速在膜的上表面循环，小于膜孔径的物质可以透过膜到透过端，而大于膜孔径的物质会被膜截留，从而实现目标物质的浓缩以及不同物质的分级分离。[0006]和传统的平板膜包相比，中空纤维膜具有纤维管状的开放式流道结构，无筛网的管状流道结构避免了料液的无规则剧烈湍流，因此具有更低的剪切力，温和的操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脱落和蛋白的聚集，有利于保护病毒的完整性，防止病毒颗粒聚集的同时有助于杂蛋白的透过和去除。[0007]目前，对于猪圆环病毒2型(PCV2)的中空纤维纯化及浓缩工艺尚无报道。
[0008]本发明旨在解决现有猪圆环病毒2型疫苗副反应率高、均一性差、免疫效果差等技术问题，提供一种使用微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统实现的猪圆环病毒2型纯化方法。
[0009]为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案:
[0010]一种猪圆环病毒2型纯化方法，该方法通过微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统来实现，过程如下:
[0011]I系统的组装[0012]无菌条件下，将微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统按照组装要求进行组装。在微滤澄清纯化系统中可安装无菌0.45 μ m或0.65 μ m、完整无损的中空纤维微滤膜,在超滤浓缩纯化系统中可安装无菌100KD或300KD、完整无损的中空纤维超滤膜。
[0013]2系统完整性检测
[0014]压力保持法检测系统的完整性。
[0015]3系统的处理
[0016]3.1清洗及灭菌
[0017]将0.5M NaOH溶液注满系统的进料罐，浸泡处理20min，开启循环泵300rpm，进行系统的清洗及灭菌处理30min。
[0018]3.2水洗及通量检测
[0019]灭囷结束后，排尽系统内的NaOH溶液。将无囷超纯水注?两系统的进料--!，开启循环泵，300rpm循环30min，弃尽系统内的液体，如此反复水洗，直至系统内PH为7.0左右。
[0020]3.3PBS 处理
[0021]水洗结束后，弃尽最后一次超纯水。将0.1M PBS溶液注满进料罐，开启循环泵300rpm循环冲洗20min。
[0022]上述所述技术方案中，步骤3.1和3.2中用到的NaOH溶液起到清洗、灭菌作用，也可选用50%~80%的酒精溶液，或采用蒸汽灭菌的方式进行系统灭菌。
[0023]一种猪圆环病毒2型纯化方法，该方法通过微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统来实现，该方法包括以下步骤:
[0024]I)将无菌吐温20按0.5%~10%(v/v)的比例加入猪圆环病毒2型(PCV2)病毒液中，振荡处理；
[0025]2)将步骤I)振荡处理后的病毒液注入微滤澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵，循环一定时间后经0.45或0.65 μ m中空纤维微滤柱微滤，收集透过液待用；
[0026]3)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第一洗滤液待用；
[0027]4)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入到步骤3)处理完毕的进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第二洗滤液待用；
[0028]5)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入到步骤4)处理完毕的进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第三洗滤液待用；
[0029]6)将上述透过液、第一洗滤液、第二洗滤液、第三洗滤液混合均匀，得到混合液；
[0030]7)将步骤6)得到的混合液注入超滤浓缩纯化系统的进料罐，开启循环泵循环一定时间，经100~300KD中空纤维超滤柱进行超滤处理，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为初级浓缩病毒液；
[0031]8)以l:l(v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的初级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为二级浓缩病毒液；
[0032]9)以l:l(v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的二级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵，循环一定时间，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为三级浓缩病毒液；
[0033] 10)以1:1 (v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的三级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵，循环一定时间，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为病毒浓缩液成品。[0034]将上述制备的病毒浓缩液成品保存于_20°C。
[0035]上述猪圆环病毒2型纯化方法，采用的是二步纯化法，第一步通过较大孔径的澄清纯化滤膜过滤病毒液，除去毒液中的细胞碎片；第二步通过较小孔径的澄清纯化滤膜洗滤第一步的滤过液，达到除去病毒液中的吐温20、小分子蛋白，细胞代谢产物的小分子物质等杂质及实现浓缩病毒等目的。
[0036]上述猪圆环病毒2型纯化方法中，步骤I)所述的振荡处理时间优选为IOmin ;步骤I)所述的比例优选为5% ;步骤2)所述的微滤的滤膜孔径优选为0.65 μ m ;步骤7)所述的超滤滤膜孔径优选为300KD ;步骤2、3、4、5、7、8、9、10中所述的开启循环泵循环一定时间的操作条件均优选为400rpm循环30min ;利用该方法制备的病毒浓缩液成品用于制备疫苗；上述所述病毒澄清纯化及浓缩方法，步骤2)中透过液的体积可以根据需要进行调整，优选为透过液体积达到原液的90% ;步骤7)中的浓缩倍数可以根据实际需要进行调整，优选为浓缩10倍以上。
[0037]上述技术方案中，步骤I)所述的猪圆环病毒2型病毒液是指制备得到的病毒原液，未经稀释处理；步骤I)加入吐温20起到乳化作用，能够有效避免病毒粒子聚集成团，从而提升后续过滤效率。
[0038]所述微滤澄 清纯化系统是指GE公司制造的QuixStand中空纤维澄清纯化系统，型号为QAM-04SA/50 ;所述微滤膜可以选自GE公司制造的、型号为CFP-6-D-6A或CFP-4-E-6A的Pilot微滤柱膜；所述超滤膜可以选自GE公司制造的、型号为UFP-300-C-6A或UFP-100-C-6A的Pilot超滤柱膜。
[0039]上述制备的病毒浓缩液成品检测方法如下:
[0040]对纯化浓缩工艺过程中的病毒样品进行病毒滴度及蛋白浓度检测，以分析浓缩工艺的有效性。其中病毒滴度的检测方法为:
[0041]以IFA法对各样品的病毒滴度进行检测，纯化有效的判定标准为:二级纯化及浓缩步骤的洗滤液检测不出存活病毒，表明工艺有效；病毒的回收率在80%以上。
[0042]蛋白含量的测定方法为:
[0043]以蛋白浓度测定试剂盒对浓缩病毒液的蛋白残存量进行测定，可溶性蛋白的残存量应低于原液可溶性蛋白的10%,表明工艺有效。
[0044]以上对本发明的
进行了详细说明。本发明的纯化方法综合采用了病毒粒子洗脱法，二级纯化法，重复洗滤法等一系列工艺，最大限度的增大了 PCV2的回收效率，降低了纯化成本。以本发明制备的猪圆环病毒浓缩液成品尤其适用于制备疫苗，以本发明制备的猪圆环病毒浓缩液成品制备的疫苗相对于现有技术的猪圆环病毒2型疫苗而言安全性高，均一性好、免疫效果好。同时，本发明工艺简便、成本较低，具有突出的规模化应用前
旦
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[0045]图1是本发明微滤澄清纯化系统的结构示意图；
[0046]图2是本发明实施例1制备的PCV2浓缩液成品荧光图(10-4)；
[0047]图3是本发明实施例1中PCV2原液荧光图(10-4);
[0048]图4是本发明实施例1中洗滤液的荧光图(10-1)；[0049]图5是本发明实施例1中细胞对照组的荧光图；
[0050]图6是本发明实施例1各样品的病毒滴度图；
[0051 ]图7是本发明实施例1各样品的可溶性蛋白浓度图；
[0052]图8是本发明实施例1免疫反应后抗体消长曲线图(ELISA值)；
[0053]图1 中:
[0054]1、进料罐2、中空纤维滤柱 3、蠕动泵
[0055]4、病毒原液进料管线5、透过液流出管线6、截留液流动管线

[0056]实施例中所用仪器型号如下:
[0057]QuixStand中空纤维澄清纯化系统，型号:QAM_04SA/50 ；
[0058]Pilot 微滤柱:CFP-6-D-6A(0.65 μ m)，CFP-4-E-6A(0.45 μ m)；
[0059]Pilot 超滤柱:UFP-300-C-6A(300KD)，UFP-100-C-6A(100KD)；
[0060]上述仪器均购自GE公司。
[0061]实施例中所用试剂如下:
[0062]100L猪圆环病毒2型病毒液，107 2TCID5Q/ml，由本公司生产；
[0063]PCV2-Cap蛋白单克隆抗体，购自浙江大学；
[0064]FITC标记羊抗鼠IgG,购自Sigma公司；
[0065]丙内酯，购自上海谱振生物科技有限公司；
[0066]ISA28VG，购自法国赛比克公司；
[0067]PCV2ELISA抗体检测试剂盒，购自瑞普(保定)生物药业有限公司；
[0068]BCA蛋白定量试剂盒，购自康为世纪公司；
[0069]0.5Μ NaOHlOOL ；
[0070]无菌0.1M PBS100L ；
[0071]无菌高纯水100L ;
[0072]吐温20，分析纯。
[0073]实施例1
[0074] I操作流程
[0075]1.1前处理
[0076]1.1.1系统的组装
[0077]无菌条件下，将澄清纯化系统和浓缩系统按照组装要求进行组装。在澄清系统中可安装无菌0.65 μ m、完整无损的中空纤维微滤膜，在浓缩系统中安装孔径为300KD的无菌中空纤维超滤膜。
[0078]1.1.2系统完整性检测
[0079]压力保持法检测系统的完整性。
[0080]1.1.3系统的处理
[0081]清洗及灭菌:
[0082]将0.5M NaOH溶液注满系统的进料罐，浸泡处理20min，开启循环泵300rpm，进行系统的清洗及灭菌处理30min。[0083]水洗及通量检测:
[0084]灭囷结束后，排尽系统内的NaOH溶液。将无囷超纯水注?两系统的进料--!，开启循环泵，300rpm循环30min，弃尽系统内的液体，如此反复水洗，直至系统内PH为7.0左右。
[0085]PBS 处理:
[0086]水洗结束后，弃尽最后一次超纯水。将0.1M PBS溶液注满进料罐，开启循环泵300rpm循环冲洗20min。
[0087]1.2病毒的澄清纯化
[0088]1.2.1病毒液的处理
[0089]将5L无菌吐温20加入100L猪圆环病毒2型(PCV2)病毒液中，振荡处理lOmin。
[0090]1.2.2病毒液的澄清
[0091]澄清系统处理完毕后，弃尽系统内的PBS溶液，将振荡处理后的病毒液，注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵，400rpm循环30min,经0.65 μ m中空纤维微滤柱进行纯化处理，收集透过液90L，进料罐内存留截留液10L。
[0092]1.2.3截留液的洗滤
[0093]第一次洗滤:
[0094]将IOL无菌的0.1M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵400rpm循环30min，收集透过液10L，记为洗滤液I。
[0095]第二次洗滤:
[0096]将IOL无菌的0.1M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵400rpm循环30min,收集透过液10L，记为洗滤液2。
[0097]第三次洗滤:
[0098]将IOL无菌的0.1M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵400rpm循环30min,收集透过液10L，记为洗滤液3。
[0099]1.2.4病毒液的收集
[0100]将上述澄清纯化过程所收集的透过液及三次洗滤液混合均匀，得到混合液120L。
[0101]1.2.5初级浓缩
[0102]浓缩系统处理完毕后，将混合液注入浓缩系统的进料罐，开启循环泵，400rpm循环30min,经300KD中空纤维超滤柱进行纯化处理,弃去透过液,进料罐中剩余截留液10L,记为初级浓缩病毒液。
[0103]1.2.6浓缩液的洗滤
[0104]第一次洗滤:
[0105]将10L0.1M PBS注入进料罐中的初级浓缩液中，重悬，开启循环泵，400rpm循环30min，弃去透过液10L，进料罐中剩余截留液10L，记为二级浓缩病毒液。
[0106]第二次洗滤:
[0107]将10L0.1M PBS注入进料罐中的二级浓缩液，重悬，开启循环泵，400rpm循环30min，弃去洗滤液10L，进料罐中剩余截留液10L，记为三级浓缩病毒液。
[0108]第三次洗滤:
[0109]将10L0.1M PBS注入进料罐中的三级浓缩液，重悬，开启循环泵，400rpm循环30min，弃去洗滤液10L，进料罐中剩余截留液10L，即为病毒浓缩液成品。[0110]1.2.7病毒液的收集
[0111]将经过上述处理后的得到的病毒浓缩液成品进行收集，保存于_20°C。
[0112]2有效性检测
[0113]对纯化浓缩工艺过程中的病毒样品进行病毒滴度及蛋白浓度进行检测，以分析浓缩工艺的有效性。
[0114]2.1病毒滴度的检测:
[0115]以IFA法对各样品的病毒滴度进行检测，具体步骤如下:
[0116]2.1.1细胞的铺板及培养
[0117]以0.25%的EDTA-胰酶将生长良好的检测用猪肾细胞(PK15)进行消化，以细胞生长液重悬为2X 105/ml并接种于96孔细胞培养板，IOOul/孔，置于37°C，5%C02细胞培养箱中培养24h。[0118]2.1.2病毒的梯度稀释
[0119]将各收集的毒液样品取样，以0.1M PBS进行10倍倍比稀释10个梯度(KT1~10_10)。
[0120]2.1.3病毒的接种及培养
[0121 ] 将稀释后各梯度病毒液接种于步骤(1)所述的检测用细胞，IOOul/孔，每个梯度8个重复，同时设置不接病毒液的细胞对照，37°C，5%C02细胞培养箱中维持培养72h。
[0122]2.1.4IFA 检测
[0123]维持培养结束后，弃尽板内维持液，以固定液(甲醇丙酮混合，1:1)对细胞进行固定，IOOul/ 孔，-200C，5 ~IOmin0
[0124]弃尽固定液，将细胞板进行风干。
[0125]以1%的牛血清白蛋白(BSA)溶液进行封闭处理，IOOul/孔，37 °C，孵育30~60mino
[0126]以0.1M PBS洗3遍，200 μ I/孔。将500~700倍稀释的PCV2_cap蛋白单克隆抗体(一抗)添加于细胞培养板，100 μ I/孔，37°C，孵育30~60min。
[0127]弃尽一抗溶液，以0.1M PBS洗5遍，200 μ I/孔。添加800-1000倍稀释的荧光色素(FITC)标记的羊抗鼠IgG抗体(二抗)，100μ I/孔，37°C，孵育30~60min。
[0128]弃尽二抗溶液，以0.1M PBS洗5遍，200 μ I/孔，荧光显微镜下观察。
[0129]2.1.5统计并计算病毒滴度
[0130]统计出现特异荧光孔的数目，以Reed-Muench法对猪瘟病毒的滴度(TCID50)进行计算，结果证实，浓缩后的病毒液产生的荧光数明显高于浓缩前的病毒液，浓缩阶段的洗滤液无特异荧光，纯化过程各阶段的样品的病毒滴度显示，浓缩病毒滴度达到108_°TCID5(l/ml，浓缩阶段的洗滤液无效价，病毒回收率接近100%。
[0131]2.2可溶性蛋白的检测
[0132]取各样品以BCA蛋白浓度试剂盒进行测定，结果显示，可溶性蛋白残存率为9.3%。
[0133]3疫苗制备
[0134]以上述工艺制备的病毒浓缩液作为原料，进一步制备疫苗，其工艺步骤如下:
[0135]3.1 灭活
[0136]将纯化浓缩后的PCV2毒液以0.1M PBS进行稀释，使其病毒滴度达到107_ tlTCID5tl/ml，将纯化前的PCV2病毒液(107_°TCID5(l/ml)与纯化后的PCV2病毒液(107_°TCID5(l/ml)分别置于灭活容器中，按1:2000加入β -丙内酯，搅拌灭活48h，而后置37°C水浴2小时，终止灭活。
[0137]3.2 乳化
[0138]将彻底灭活的两份毒液，分别置于乳化容器中，按水相与油相3:1，缓慢向病毒液中加入ISA28VG，800r/min搅拌30min，制备为水包油型疫苗，将纯化前的PCV2病毒液和纯化后的PCV2病毒液制备的疫苗分别记为:PCV2灭活疫苗I和PCV2灭活疫苗2。
[0139]4疫苗安全检验
[0140]以上述工艺制备的PCV2灭活疫苗1，PCV2灭活疫苗2，无菌0.1M PBS溶液作为实验试剂；取20日龄PCV2ELISA抗体阴性、PCV2抗原阴性健康易感仔猪15头作为实验动物。具体操作步骤如下:
[0141]4.1动物分组
[0142]将15头仔猪随 机分为3组，每组5头。
[0143]4.2疫苗免疫
[0144]腹腔注射两种疫苗及PBS于试验用仔猪，如下操作:
[0145]第一组，每头仔猪颈部肌肉注射4ml PCV2灭活疫苗1，共5头；
[0146]第一组，每头仔猪颈部肌肉注射4ml PCV2灭活疫苗2，共5头；
[0147]第一组，每头仔猪颈部肌肉注射4ml PBS，共5头。
[0148]疫苗免疫后连续观察14天。
[0149]4.3实验结果
[0150]免疫后，各组仔猪均无不良反应，纯化疫苗组仔猪日增重优于普通疫苗组，各组仔猪体温无明显波动，结果如表1所示。
[0151]表1各组仔猪体重增长及体温纪录
[0152]