专利名称：一种混菌固态发酵制备羽毛粉添加剂的方法近年来，随着我国禽畜类行业的不断发展，产生了大量的禽畜废弃物，其中以羽毛废弃物最多。羽毛的主要成分以角蛋白为主，其粗蛋白含量占羽毛含量的80%以上，氨基酸含量也占70%左右，同时含有大量的常量元素、微量元素、维生素以及ー些未知生长因子，是ー种良好的、可替代或部分替代鱼粉的饲料蛋白来源。目前羽毛角蛋白的处理方法主要有传统水解法和生物技术法。传统的高温蒸煮或化学处理方法虽可以改进角蛋白的消化率，使其能够为禽畜所吸收，但存在能耗大、产品的营养组成易被破坏、三废不易处理等问题。因此近年来利用生物技术途径开发羽毛角蛋白资源，已成为国内外研究热点，主要技 术途径包括微生物降解和酶降解两种。目前国内外对羽毛微生物水解的研究主要集中在液态深层发酵对羽毛的分解作用，但其主要针对对环境废弃物的处理，对分解产物回收利用率低，浪费了大量的氨基酸和可溶性蛋白。用作禽畜饲料还需要大量的步骤，耗能耗吋，且产生大量的废液，会对环境会产生一定的污染。另外，国内外对羽毛水解的研究重点更多集中于单ー菌种对羽毛的分解作用，単一菌种主要以分泌角蛋白酶对以角蛋白为主的羽毛进行分解，其产酶量少，酶活偏低，不能高效快捷的水解角蛋白。
本发明针对现有技术的不足之处，提供ー种羽毛分解效率高、エ艺简单、实用性强、能直接用于饲料添加剂的混菌固态发酵制备羽毛粉添加剂的方法。本发明实现目的的技术方案如下一种混菌固态发酵制备羽毛粉添加剂的方法，其特征在于包括将羽毛破碎的步骤、制备发酵培养基的步骤、加入混菌发酵的步骤、发酵后处理步骤，最終获得羽毛粉添加剂；所述混菌包括地衣芽孢杆菌CGMCC No. 1699、嗜碱芽孢杆菌CGMCC No. 5313、枯草芽孢杆菌 CGMCC No. 1398。而且，所述地衣芽孢杆菌终浓度CGMCC No. 16992. 51 X 10lclCFU/g、嗜碱芽孢杆菌CGMCC No. 53132. 48 X 10lclCFU/g、枯草芽孢杆菌 CGMCC No. 13981. 30 X 10lclCFU/g，其中 g 为羽毛重量。而且，所述发酵培养基为g/L :羽毛 1-10、K2HPO4 1-5、KH2PO4 O. 4-5、NaCl O. 4-5、麦芽糖 1-5、NH4Cl 1.5-5。而且，所述加入混菌发酵的条件为相対湿度80-90%、温度維持在30_40°C，初始pH值自然，发酵时间为40-80h。而且，所述发酵后处理步骤为调节发酵产物pH至7. 0-7. 2，烘干灭菌，打碎，得到羽毛粉添加剤。 本发明的优点及积极效果是I、本发明将羽毛直接打碎，采用固态发酵与混菌发酵相结合的方法，有效提高羽毛的水解效率，使水解后的羽毛产品所含氨基酸量达到170. 98mg/g，可溶性蛋白含量可达到9. 42mg/g，为饲料行业提供了高营养的饲料添加剤，避免羽毛资源浪费和对环境的污染。2、本发明采用预先将羽毛打碎，浸泡于培养液中的方法，可以在菌株生长的初始阶段提供使其更容易吸收利用的碳氮源和无机离子，能够使菌体量快速增长，提高其分解羽毛的效率，減少固态发酵所需的时间，同时打碎羽毛可増加固态发酵培养基之间的孔隙度，使水分和氧气能够进入羽毛间隙，为这三种好氧型细菌提供必要的水分和氧气，提高菌种的繁殖速度，提高发酵效率。3、本发明采用混合菌种固态发酵制备羽毛饲料的方法，可以有效减少废液的产生，減少的生产饲料的エ序，降低能源消耗，同时将大量废弃羽毛重新利用，变废为宝，将其 足对禽畜业发展的制約，缓解饲养业对粮食的消耗提供了有效的途径，同时也可以有效的减轻环境污染和资源浪费。4、本发明采用混菌发酵的方法，能够发挥地衣芽孢杆菌CGMCC No. 1699、嗜碱芽孢杆菌CGMCC No. 5313、枯草芽孢杆菌CGMCC No. 1398的协同作用，有效提高水解羽毛的效率，減少单ー菌株发酵所耗费的时间，提高氨基酸和可溶性蛋白的产生量，为禽畜类饲料提供更有营养的添加剤。①完全溶解蛋白标准品，取10μ I稀释至ΙΟΟμ 1，使终浓度为O. 5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用O. 9%NaCl或PBS稀释标准品。②将标准品按0，I, 2，4，8，12，16，20 μ I加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20 μ I。③加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20 μ I。④各孔加入200 μ I G250染色液，室温放置3-5分钟。⑤用酶标仪测定Α595，或560_610nm之间的其它波长的吸光度。⑥根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。本发明采用的具体方法如下①完全溶解蛋白标准品，取10 μ L稀释至ΙΟΟμ L，使终浓度为0. 5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。用0. 9%NaCl稀释标准品。②将标准品按0，I, 2，4，8，12，16，20 μ I加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20 μ I。③加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20 μし④各孔加入200 μ I G250染色液，室温放置3-5分钟。⑤用酶标仪測定A595nm下波长的吸光度。绘制标准曲线。所得标准曲线方程y=l. 0369x+0. 0152 其中 R2=O. 9981⑥将发酵处理后的产品(由Ig打碎羽毛发酵而成)溶解于IOOmLO. 9%NaCl中，搅拌放置30min，使可溶物充分溶解。取20yL样品于96孔板的样品孔中，加入200μ I G250染色液，室温放置3-5分钟，用酶标仪測定A595nm下波长的吸光度。根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。结果本发明制备的羽毛粉所含氨基酸量达到170. 98mg/g，可溶性蛋白含量可达到 9.42mg/g。本发明涉及一种混菌固态发酵制备羽毛粉添加剂的方法，采用菌种为地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌。保藏编号分别为CGMCC No.1699、CGMCC No.5313、CGMCC No.1398，本发明中采用固态发酵，将打碎后的羽毛经处理制成固态发酵培养基，三种菌按一定比例进行混合，以适宜接种量接入发酵培养基中。本发明可有效提高羽毛的水解效率，提高了发酵产物中氨基酸和可溶性蛋白的含量，氨基酸含量可达到170.98mg/g，可溶性蛋白含量可达到9.42mg/g，从而为饲料行业提供了高营养的饲料添加剂，并从一定程度有效的避免资源浪费和环境污染。