抗基因沉默的经修饰的人cmv启动子制作方法_杨元生,M·马里亚蒂专利（cmv,修饰,基因）-早鸽网

抗基因沉默的经修饰的人cmv启动子制作方法

专利名称

抗基因沉默的经修饰的人cmv启动子制作方法
发明者

杨元生, M·马里亚蒂
公开日

2014年1月8日
申请日期

2011年12月22日
优先权日

2010年12月24日
申请人

新加坡科技研究局
文档编号

C12N15/869GK103502459SQ201180068239
关键字

cmv 修饰基因沉默启动
权利要求

1.核酸分子，其包含疱疫病毒的功能启动子、疱疫病毒的功能增强子和aprt(腺嘌呤磷酸核糖转移酶)基因和/或其功能变体的CpG岛的一个或多个内部元件2.权利要求1的核酸分子，其中所述aprt基因是下述之一仓鼠aprt基因、小鼠aprt基因、大鼠aprt基因、人类aprt基因、牛aprt基因、斑马鱼aprt基因、鼠疫耶尔森氏菌aprt基因、热带爪蟾aprt基因、霉菌aprt基因、黑腹果蝇aprt基因、酿酒酵母aprt基因、栗酒裂殖酵母aprt基因、大肠杆菌aprt基因、鼠李糖乳杆菌aprt基因和鼠伤寒沙门氏菌aprt基因3.权利要求1或2的核酸分子，其中所述仓鼠是灰仓鼠或仓鼠属物种4.权利要求1-3任一项的核酸分子,其中所述aprt基因的CpG岛的一个或多个内部元件中的至少一个包含转录因子Spl的一个或多个结合位点5.权利要求4的核酸分子，其中所述aprt基因是仓鼠aprt基因并且所述aprt基因的CpG 岛的 Spl 结合位点具有序列5’ -GCCCCGCCCCGTCCCGCCCC-3’ (SEQ ID NO1)6.权利要求4的核酸分子，其中所述aprt基因是小鼠aprt基因并且所述aprt基因的CpG 岛的 Spl 结合位点具有序列 5’-CCCGCCC-3’ (SEQ ID NO2)或序列 5’-TCCGCCC-3’ (SEQID NO3)7.权利要求1至5任一项的核酸分子，其中所述aprt基因是仓鼠aprt基因并且所述aprt基因的CpG岛的内部兀件具有序列 5，-TCCAGCAAATGCGTTACTTCCTGCCAAAAGCCAGCCTCCCCGCAACCCACTCTCCCAGAGGCCCCGCCCCGTCCCGCCCCCTCCCGGCCTCTCCTCGTGCTGGATCGCTCCCTAAGGA-3’ (SEQ ID N04).8.权利要求1至4或6任一项的核酸分子，其中所述aprt基因是小鼠aprt基因并且所述aprt基因的CpG岛的内部兀件具有序列 5，-AGGATGGACATCGCACATCCCCTTTCCACCCATATATCTTTGAGGTAGGGATGCTTGTGTTTAGGCAGCTCAAGAAATCTAACCCCTGACTCAGGCCCCACACACACCTCGCAGAGGCCCCGCCTCTCAGCCTGTCCCGCCCCTCGTGCTAGACCAACCCGCACCCAGAAGCCCCGCCCATCGAGGACGCTCCGCCCTTGTTCCCCCCGGGATTGACGTG-3’ (SEQ ID N05).9.权利要求1至8任一项的核酸分子,其中所述aprt基因的CpG岛的一个或多个内部元件以相对于启动子的序列正向地或反向地独立地排列在所述核酸分子中10.权利要求1至9任一项的核酸分子，其包含所述aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的多个内部元件11.权利要求1至10任一项的核酸分子，其进一步包含编码目的多肽的可表达的核苷酸序列，所述可表达的核苷酸序列有效连接至所述疱疹病毒的启动子和所述疱疹病毒的增强子12.权利要求11的核酸分子，其中`所述可表达的核苷酸序列是异源核苷酸序列13.权利要求1至12任一项的核酸分子，其中所述可表达的核苷酸序列排列在所述疱疫病毒的启动子和所述疱疫病毒的增强子的下游14.权利要求1至13任一项的核酸分子，其中所述启动子和所述增强子是同一疱疹病毒的启动子和增强子15.权利要求1至14任一项的核酸分子，其中所述疱疹病毒选自巨细胞病毒、棒状病毒属、蔷薇疫病毒属、单纯疱疫病毒属、水痘病毒属、马立克病毒属、传染性喉气管炎病毒属、β疱疫病毒、Y疱疫病毒、Epstein-Barr病毒、水痘带状疱疫病毒、小鼠Y疱疫病毒-68和猿猴疱疹B病毒16.权利要求15的核酸分子，其中所述巨细胞病毒是人巨细胞病毒17.权利要求1-16任一项的核酸分子，其中所述功能启动子和所述功能增强子被包含在以下序列中 18.权利要求1至17任一项的核酸分子，其中所述功能启动子具有序列 19.权利要求1至18任一项的核酸分子，其中所述功能增强子具有序列 20.权利要求1至19任一项的核酸分子，其中所述疱疹病毒的增强子排列在所述疱疹病毒的启动子的上游21.权利要求1至20任一项的核酸分子,其中所述aprt基因或其功能变体的CpG岛的一个或多个内部元件中的至少一个排列在所述疱疹病毒的启动子的上游或邻近地排列在所述疱疹病毒的启动子的下游22.权利要求21的核酸分子，其中所述aprt基因或其功能变体的CpG岛的一个或多个内部元件中的至少一个排列在(i)所述疱疹病毒的增强子和所述疱疹病毒的启动子之间或(ii)邻近地排列在所述疱疹病毒的增强子的上游23.权利要求21或22的核酸分子，其中所述aprt基因或其功能变体的CpG岛的一个或多个内部元件中的至少一个与所述疱疹病毒的增强子或所述疱疹病毒的启动子邻近地排列24.权利要求1至23任一项的核酸分子,其中所述核酸分子是DNA分子25.权利要求1至24任一项的核酸分子，其中所述疱疹病毒的功能启动子是所述核酸分子中包含的唯一启动子26.权利要求1至25任一项的核酸分子，其中所述核酸分子被包含在载体中27.权利要求26的核酸分子,其中所述载体是真核表达载体或原核表达载体28.权利要求26或27的核酸分子，其中所述载体是质粒29.权利要求1至28任一项的核酸分子，其中所述核酸分子被包含在合适的宿主细胞中30.权利要求29的核酸分子，其中所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞31.权利要求1至30任一项的核酸分子，其中所述核酸分子是分离的核酸分子32.产生所希望的多肽的方法，所述方法包括 -提供根据权利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子进一步包含编码所希望的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效连接至所述疱疹病毒的启动子和所述疱疹病毒的增强子，和 -允许所希望的多肽的表达33.权利要求32的方法，其中所述的编码所希望的多肽的核苷酸序列是异源核苷酸序列34.权利要求32或33的方法，其中允许所述所希望的多肽的表达包括将根据权利要求1的核酸分子引入到合适的宿主细胞中35.权利要求34的方法，其中根据权利要求1的核酸分子被包含在适合于所述宿主细胞中表达的载体中36.权利要求34或35的方法，其中允许所述所希望的多肽在所述宿主细胞中表达超过约30代或更多代37.权利要求36的方法，其中当与具有编码目的多肽的异源核苷酸序列的核酸分子相比时，所述宿主细胞在约30代或更多代后，所述所希望的多肽的表达水平提高，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件38.权利要求36或37的方法，其中所述所希望的多肽在多个宿主细胞中表达，并且其中当与包含具有编码目的多肽的异源核苷酸序列的核酸分子的多个宿主细胞相比时，所述宿主细胞在约30代或更多代后，仍然表达所希望的多肽的宿主细胞的数目增加，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件39.权利要求34至38任一项的方法，其中允许所述所希望的多肽表达超过约4周或更长的时间40.权利要求38的方法，其中当与具有编码目的多肽的异源核苷酸序列的核酸分子相比时，4周或更长的时间后，所述所希望的多肽的表达水平提高，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件41.权利要求39或40的方法，其中所述所希望的多肽在多个宿主细胞中表达，并且其中当与包含具有编码目的多肽的异源核苷酸序列的核酸分子的多个宿主细胞相比时，在4周或更长的时间后，仍然表达所希望的多肽的所述宿主细胞的数目增加，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件42.权利要求34至41任一项的方法，其中允许所述所希望的多肽在所述宿主细胞中表达超过约60代或更多代43.权利要求34至42任一项的方法，其中允许所述所希望的多肽表达超过8周或更长的时间44.权利要求43的方法，其中当与不具有aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件的核酸分子相比时，8周或更长的时间后，所述所希望的多肽的表达水平提高45.权利要求43或44的方法，其中所述所希望的多肽在多个宿主细胞中表达，并且其中当与包含具有编码目的多肽的异源核苷酸序列的核酸分子的多个宿主细胞相比时，在8周或更长的时间后，仍然表达所希望的多肽的所述宿主细胞的数目增加，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件46.载体,其包含权利要求1至25任一项的核酸分子47.权利要求46的载体，其中所述载体是真核表达载体或原核表达载体48.权利要求46或47的载体，其中所述载体是质粒49.宿主细胞，其包含权利要求1至28任一项的核酸分子50.根据权利要求1至28任一项的核酸分子的用途，所述核酸分子用于增强目的多肽的表达，其中所述核酸分子包含编码目的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效连接至所述疱疫病毒的启动子和所述疱疫病毒的增强子51.权利要求50的用途，其中所述目的多肽在合适的宿主细胞中表达.52.权利要求51的用途，其中允许所述目的多肽在宿主细胞中表达超过约30代或更多代53.权利要求51或52的用途，其中允许所述目的多肽在所述宿主细胞中表达超过约60代或更多代54.权利要求52或53的用途，其中当与具有编码目的多肽的异源核苷酸序列的核酸分子相比时，所述宿主细胞在约30代或更多代后，所述所希望的多肽的表达水平提高，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件55.权利要求53或54的用途，其中当与具有编码目的多肽的异源核苷酸序列而不具有aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件的核酸分子相比时，所述宿主细胞在约60代或更多代后，所述所希望的多肽的表达水平提高，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件56.权利要求52至55的用途，其中所述所希望的多肽在多个宿主细胞中表达，并且其中当与包含具有编码目的多肽的异源核苷酸序列的核酸分子的多个宿主细胞相比时，所述宿主细胞在约30代或更多代后，仍然表达所述所希望的多肽的宿主细胞的数目增加，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件57.权利要求53至56的用途，其中所述所希望的多肽在多个宿主细胞中表达，并且其中当与包含具有编码目的多肽的异源核苷酸序列的核酸分子的多个宿主细胞相比时，所述宿主细胞在约60代或更多代后，仍然表达所述所希望的多肽的宿主细胞的数目增加，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件58.权利要求50至57任一项的用途，其中所述aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件防止功能启动子和/或功能增强子的甲基化，从而降低和/或防止所述所希望的多肽表达水平的降低`
技术领域

[0003]本发明涉及分子生物学、病毒学和基因治疗领域，尤其涉及含有疱疹病毒的功能启动子、疱疹病毒的功能增强子和aprt (腺嘌呤磷酸核糖转移酶)基因和/或其功能变体的CpG岛的一个或多个内部元件的核酸分子，本发明包括所述核酸分子的用途以及产生目的多肽或蛋白质的方法
专利摘要

本发明涉及这样的核酸分子，其包含疱疹病毒的功能启动子、疱疹病毒的功能增强子以及aprt（腺嘌呤磷酸核糖转移酶）基因和/或其功能变体的CpG岛的一个或多个内部元件。还公开了使用所述核酸分子、含有所述核酸分子的载体和宿主细胞产生所希望的多肽的方法。
专利说明

抗基因沉默的经修饰的人CMV启动子

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权力要求
说明书
法律状态

抗基因沉默的经修饰的人cmv启动子的制作方法[0001]相关申请的交叉参考[0002]该申请要求2010年12月24日提交的美国临时申请号61/427，121的优先权的权益，为所有目的将所述临时申请的内容完整引入本文作为参考。[0004]迄今为止，基因治疗中的大多数研究已经利用了病毒启动子。一般而言，强的病毒启动子为有效的病毒繁殖所需，并且它们通过使用控制并募集宿主转录机的机制，经常比真核启动子诱导更高水平的转录。此外，病毒启动子倾向于更紧凑，因此更易于操纵并适应于基因治疗载体。[0005]人巨细胞病毒主要立即早期基因启动子(hCMV)已经广泛用于学术研究和工业应用中，用于哺乳动物细胞中高水平重组蛋白质的产生。例如，hCMV中驱动立即/早期基因表达的增强子/启动子元件已经广泛用于生物技术中，用于驱动异源基因在真核表达载体中的表达。正在使用的其他病毒启动子包括猿猴病毒40(SV40)、劳斯肉瘤病毒长末端重复(RSV-LTR)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR和其他逆转录病毒LTR启动子。因此病毒启动子的应用已经非常普遍，并且已经成功用于体外和体内的某些应用。然而，真核细胞已经进化了检测并使病毒转基因的表达沉默的机制。病毒启动子已经显示经常不能维持体内转基因的表达，尽管有病毒启动子易于在体外和体内失活并沉默的大量证据，但是大部分的基因治疗应用还是继续利用它们来驱动转基因的表达。不过，一个普遍的问题在于，通过转导进入到哺乳动物细胞中的异源基因瞬时表达至足够的水平，然后在长期培养过程中在稳定转染的细胞系中所述表达被抑制并逐渐被沉默。因此基因沉默是基因治疗中的主要障碍。[0006]转基因表达的丢失主要归因于转录沉默，其涉及CpG DNA序列上的甲基化、组蛋白脱乙酰作用或整合位点附近的染色质凝聚。CpG岛一般至少200bp长，富含GC，并含有至少约60%频率的CpG 二核苷酸。DNA甲基化是共价修饰，其中胞嘧啶的5’位置被甲基化。在哺乳动物中，该修饰发生在CpG 二核苷酸。在组蛋白非常分散的开放染色质中，DNA是未甲基化的，由开放的圆圈表示(图1)，基因活跃地表达。甲基化后，甲基结合(MBD)蛋白将组蛋白修饰蛋白和协阻抑物募集到甲基化的区域，引起染色质变得致密，并将所述基因沉默。[0007]已经应用多种抗甲基化技术来防止基因沉默。例如,Senigl, H和同事(Senigl，H;Plachyj J.;Hejnarj J., The core element of a CpG island protects avian sarcoma andleukosis virus-derived vectors from transcriptional silencing(2008)Journal ofVirology, 82:7818-7827)显示，在小病毒启动子RSV LTR(_200个碱基)的增强子和启动子之间插入CpG岛的内部元件(IE)防止基因沉默。然而，该策略对于较大的启动子可能不起作用，因为已经报道，IE仅可保护约150个碱基免于甲基化(Siegfried, Z.;Eden, S.，等DNAmethylation represses transcription in vivo(1998)Nature genetics 22:203-206)。[0008]UCOE (遍在染色质开放元件)已经用于研究和生物技术应用中，如细胞培养中的重组蛋白质产物。UCOE赋予增加比例的高产基因整合事件，其在转基因表达的水平和稳定性上均有改良。尽管UCOE在本领域中被称为CpG岛相关元件(W0 2006/095156)，已知UCOE还具有不同的功能，UCOE使染色质在结构上松散，因此即使基因整合到异染色质中也能够表达。因此并不清楚UCOE是否能防止各种核酸的DNA甲基化。
[0009]产生可在规模扩大期内维持高生产性的细胞系对生物制药而言是极其重要的。产品的不稳定性可影响产品的产量和产品的一致性，妨碍该产品的注册批准。使用目前可用的表达载体产生的大多数克隆具有不稳定的生产性。因此，大量的克隆需要经过筛选，以获得稳定的高产细胞系。在以前的文献报道中已经表明，生产性的丢失主要是由于转录沉默，其涉及启动子内CpG 二核苷酸的甲基化。
[0010]考虑到重组蛋白质的表达在生物技术中的重要性，仍然需要包含经修饰的启动子或增强子组合的改良的表达载体。
[0011]发明概述
[0012]—方面,本发明提供包含疱疫病毒的功能启动子、疱疫病毒的功能增强子和aprt(腺嘌呤磷酸核糖转移酶)基因和/或其功能变体的CpG岛的一个或多个内部元件的核酸分子。
[0013]第二方面，本发明提供产生所希望的多肽的方法。所述方法包括提供如本文定义的核酸分子，其中所述核酸分子进一步包含编码所希望的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列被有效地连接至疱疹病毒的启动子和疱疹病毒的增强子，和允许表达所述所希望的多肽。
[0014]第三方面，本发明提供包含如本文定义的核酸分子的载体。
[0015]第四方面，本发明提供包含如本文定义的核酸分子的宿主细胞。
[0016]第五方面，本发明提供如本文定义的核酸分子的用途，所述核酸分子用于增强目的多肽的表达，其中所述核酸分子包含编码目的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列被有效地连接至疱疫病毒的启动子和疱疫病毒的增强子。
[0017]附图简述
[0018]当结合非限制性实施例和附图进行考虑时，参考详细的描述能更好地理解本发明，在所述附图中:
[0019]图1阐明了转录基因沉默机制的图示。图1A显示了核苷酸的共价修饰，其中胞嘧啶的5’位置被甲基化。图1B显示了在CpG 二核苷酸处发生的DNA甲基化。在组蛋白(“H3”)非常分散的开放染色质中，DNA是未甲基化的，由开放的圆圈表示，基因活跃地表达。通过甲基化，甲基结合(“MBD”)蛋白将组蛋白修饰蛋白(如“HDAC”:组蛋白脱乙酰酶)和协阻抑物(如“HP1”:异染色质蛋白I)募集到甲基化的区域，使染色质变得致密，并将所述基因沉默。
[0020]图2显示了在仓鼠APRT基因上发现的CpG岛的内部元件(IE)的核苷酸序列(SEQ ID N0:4)。所述内部元件(IE)是仓鼠APRT基因的CpG岛的小区域(Brandeis, Μ.;Frank,D.;Keshet,1.,等 Spl Elements Protect A Cpg Island FromDe-Novo Methylation(1994)Nature 371:435-438)。
[0021]图3A显示了含有人巨细胞病毒(CMV)增强子和启动子的核苷酸序列(SEQ IDNO:6)。以粗体显示CG 二核苷酸，其均可被甲基化，导致基因沉默。下划线和粗体显示的CTCGAG序列表示使用定点诱变在增强子和启动子之间产生的XhoI位点，用于插入IE。
[0022]图3B显示了图3A的核苷酸序列的图示。每个环指的是序列中的CG 二核苷酸。所述CG 二核苷酸均可被甲基化，导致基因沉默。
[0023]图4显示了根据本发明多个实施方案的12个不同核酸分子的图示，其中将aprt基因的CpG岛的一个或两个IE以正向或反向插入到增强子的上游、增强子与启动子(P)之间以及启动子(P)的下游，以研究定位、方向和拷贝数对IE防止基因沉默能力的影响以及IE的插入是否影响启动子的强度。野生型CMV称为WT CMV,而经修饰的CMV在下文中称为IE CMV。
[0024]图5显示了含有CMV增强子区和启动子(P)区的载体序列，其用于在哺乳动物细胞中表达所克隆的DNA插入片段。MluI用于将IE插入到CMV增强子的上游，XhoI用于将IE插入到CMV的增强子和启动子之间，NheI用于将IE插入到启动子的下游。IRESatt是衰减的内部核糖体进入位点(IRES)。IRES允许在一个启动子控制下表达多个基因。IRES翻译效率的衰减用于更有效地选择高产克隆。mNPT是具有降低的酶活性的突变新霉素，其允许更有效地选择高产克隆。
[0025]图6显示了克隆产生以及评估细胞培养中本发明的核酸分子长期表达的图示方法。
[0026]图7显示了在瞬时(图 7A)和稳定基因表达(图7B)中含有经修饰的CMV启动子(“IE CMV”，见图4)与野生型CMV启动子(“WT CMV")的12个核酸分子强度的比较。向CMV中插入IE的目的是为了提高表达的稳定性，但不改变表达水平。在瞬时和稳定转染中使用GFP作为报告基因比较经修饰的CMV启动子与WT CMV在表达基因中的强度。使用FACS测定瞬时转染的库和稳定表达克隆的平均荧光强度。用星号表示95%置信水平上相对于WTCMV的统计学显著差异。不希望受理论的束缚，在瞬时转染中，将IE插入到CMV的下游降低表达水平，而插入到其他位置看起来具有较小的影响。在稳定转染中，UF2、UR2和MRl具有的表达水平与野生型CMV相当。
[0027]图8显示了使用WT CMV产生的代表性克隆B4在第8周和第O周时GFP阳性细胞的百分比。在第O周时，所有细胞表达GFP。在没有选择试剂G418的情况下传代8周后，仅34%的细胞仍然表达GFP。
[0028]图9显示了根据本发明的多个实施方案使用IE CMV启动子(MF2)获得的代表性克隆B8在第O周和第8周时GFP阳性细胞的百分比。所述IE CMV启动子(MF2)含有在增强子和小型启动子之间插入的2个IE(图9A)。在第O周时，所有细胞表达GFP。在没有选择试剂G418的情况下传代8周后，所有细胞仍然表达GFP。
[0029]图10显示了使用WT CMV产生的代表性克隆B4在第O周和第8周时的柱状图。将GFP表达的保留(％)如下计算为第8周时的平均荧光强度(MFI)与第O周时平均荧光强度(MFI)的比值:
[0030]

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