专利名称：一种维管组织特异表达启动子vsp1及其应用的制作方法组织或器官特异性启动子，即在此类启动子的调控下，基因的表达仅限于某些特定的部位或者器官。这种特异性通常以特定的组织细胞结构和化学物理信号为存在基础。用组织特异性启动子调控基因表达时，可使外源基因产物更有效地发挥作用，并降低对植物的负面影响。 目前已经分离并得到了一些能在不同组织部位或者器官中特异表达的启动子。比如能够在叶肉细胞特异启动的水稻来源的RbcS启动子；还有能够在根部特异启动的烟草的TobRB7基因启动子；能够在胚乳特异性启动表达的水稻中GluB-I基因启动子；能够在花药中特异启动表达的烟草TA29启动子、水稻0sg6B启动子等；能够在维管组织木质部特异启动表达的法国菜豆富含甘氨酸结构基因Grpl. 8启动子；能够在维管组织韧皮部特异启动表达的拟南芥H+-ATP酶基因3 (Ha3)启动子等。
本发明的目的是提供一种维管组织特异表达启动子VSPl及其应用。本发明提供的ー种DNA片段，为如下I) -3)中任一所述的DNA分子I)序列表的序列I自5’末端第7-4753位核苷酸所不的DNA分子；2)在严格条件下与I)所不DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与I)中所示DNA分子具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下杂交，然后用2 X SSC, O. 1%SDS 和 I X SSC, O. 1%SDS 各洗膜一次。含有上述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。扩增上述DNA片段全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。上述DNA片段在使目的基因在植物组织中表达中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，所述植物组织为植物叶、茎和/或根的维管组织。在本发明的实施例中目的基因为GUS基因，其核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第4760-6567位核苷酸。上述应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。上述应用中，所述双子叶植物为拟南芥或棉花，所述单子叶植物为水稻或者小麦。上述DNA片段在植物的遗传育种中的应用也是本发明保护的范围；上述应用中，所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物进ー步具体为拟南芥或棉花，所述单子叶植物进ー步具体为水稻。本发明的实验证明，本发明提供ー种新型的维管组织特异表达的启动子VSP1，将VSPl启动子与报告基因GUS相连，用带有该融合基因的载体转化拟南芥、水稻及棉花，该启动子能够在拟南芥、棉花、水稻等植物根、茎、叶的维管组织中特异地启动基因表达，证明在转基因植株中该启动子能够特异性地在维管组织中启动⑶S基因表达。图I为pBinl9- VSPl_GUS植物表达载体结构示意2为TO代转基因拟南芥PCR鉴定结果图3为TO代转基因水稻的PCR鉴定结果图4为TO代转基因棉花的PCR鉴定结果图5为TO代转基因拟南芥中⑶S基因的维管组织特异性表达图6为TO代转基因水稻中⑶S基因的维微管组织特异性表达图7为TO代转基因棉花中⑶S基因的维管组织特异性表达
Acids Res. 12:871-18721，该载体上没有启动子和终止子。)的BamHI酶切位点，得到重组载体，经过测序验证正确。将该重组载体命名为pBinl9-VSPl-GUS，其结构示意图如图I所
/Jn ο2、pBinl9-GUS表达载体(对照重组载体)构建将序列I自5’末端第4760-6802位核苷酸(⑶S-CaMV)插入双元载体pBinl9的BamHI酶切位点，得到对照重组载体，经过测序验证正确。将该对照重组载体命名为pBinl9-GUS0ニ、pBinl9-VSPl_GUS融合表达载体转化植物l、pBinl9-VSPl_GUS融合表达载体对农杆菌的转化I)、农杆菌感受态的制备接种农杆菌GV3101 (购自Biovector中国质粒载体菌株基因库，货号为Biovector-375)单菌落于50ml YEP培养基中，28 °C振荡培养，至OD6tltl为O. 5，冰浴30分钟，5000rpm离心5分钟，收集菌体，重悬于IOml O. 5M NaCl中；再次离心，菌体重悬于Iml 20mM CaCl2溶液中；取50 μ I菌液分装到I. 5ml离心管中，_80°C保存。2)、质粒对农杆菌的转化取2μ I的上述质粒pBinl9-VSPl_GUS，加到50 μ I上述感受态菌(GV3101)中，混匀后冰浴30分钟，在液氮中速冻5分钟，37 °C热激5分钟，カロ 入ImlYEP培养液，28 °C培养4小时，将菌液涂布在含有50 μ g/ml利福霉素、50μ g/ml卡那霉素的平板上，28°C培养2天。待长出菌落后，取单菌落进行PCR检测，引物为GUS-FTACCCGTCCGCAAGTGCACG (序列 2)、⑶S-R GCGAGGTCGCAAAATCGGCG (序列 3);扩增出 450bp片段即为阳性，将该阳性菌命名为GV3101/pBinl9-VSPl-GUS。2、pBinl9-VSPl_GUS融合表达载体农杆菌介导法转化植物I) pBinl9-VSPl_GUS融合表达载体农杆菌介导法转化拟南芥浸花法转化拟南芥取200 μ I GV3101/pBinl9-VSPl-GUS加入到5mlYEP液体培养基(含有50 μ g/ml利福平、50 μ g/ml卡那霉素)中，28°C过夜培养。取过夜培养的菌液2ml，加入到装有250mlYEP液体培养基(含有50 μ g/ml利福平、50 μ g/ml卡那霉素)的500ml三角瓶中，28°C过夜培养，直到菌液0D_为O. 8吋，5000r/min离心10分钟，弃去上清液，将菌体在50ml5%蔗糖水溶液中悬起，在转化植株之前向悬液中加入O. 05%含量(V/V)的silwet表面活性剂。将野生型拟南芥(Arabidopsis, col-O,购自The European ArabidopsisStock Centre (NASC), N1092)植株的花浸入到上述农杆菌悬浮液中约10秒，随后将浸花后的植株用塑料盖子盖上，温室(20°C，16小时日照)培养24小时后取下盖子。培养植物直到收集种子，得到TO代转基因拟南芥种子。将收集到的TO代转基因拟南芥种子烘干，保存于4°C条件。在无菌工作台上进行以下操作，取适量种子放于EP管中，加入75%こ醇，涡旋I分钟，弃去75%こ醇，用无菌水洗一遍，加入含有10%次氯酸钠的溶液，充分涡旋5分钟，旋转EP管20分钟以便充分灭菌。静置后弃去上清液，用无菌水洗4適。将洗过的种子在无菌水中悬起，均匀铺在含有50 μ g/ml卡那霉素的1/2MS固体培养基上，在无菌工作台中吹干表面水分，使用封ロ膜将平板封闭，放入温室(20°C，16小时日照)培养。在培养数天后，阳性植株会逐渐长出真叶并有较发达的根系，而阴性植株会呈矮小状态并最終死亡。这样就可以达到初步筛选的目的，随后，将初步筛选的苗子移栽到营养土中，温室培养，得到抗性阳性TO代转基因拟南芥。2)、pBinl9-VSPl_GUS融合表达载体农杆菌介导法转化棉花(I)、挑取 GV3101/pBinl9-VSPl-GUS 单菌落，接种于 20ml 含 50mg/L 卡那霉素、50mg/L利福平和30mg/L链霉素的YEP培养基中，28。C、280rpm过夜培养至0D600为0. 7 0. 8。5000rpm离心,用MS液体培养基重新悬浮,与野生型棉花(中棉24,购自中国农科院棉花研究所科技贸易公司)愈伤组织共侵染10分钟。
(2)、将愈伤组织用无菌吸水纸吸干，放置于MS培养基上，暗培养2 3天后，用无菌水将外植体洗浄，转到含有100 μ g/ml头孢霉素，75 μ g/ml卡那霉素的分化培养基中，在12小时光照，12小时黑暗的条件下，继续培养至分化出小芽。(3)、待芽长到2cm后，用无菌剪刀和镊子将分化的芽剪下，插到生根培养基中，继续培养4周左右，移栽到土壤中，得到TO代转基因棉花。在TO代转基因棉花单株幼苗长出3 4片真叶吋，对其进行了卡那霉素叶片涂抹初筛实验。卡那霉素的浓度分别为1.0%(w/v)。涂抹5天后进行观察，淘汰显症(叶片涂抹点变黄)单株后进行第二轮筛选，如此连续涂抹三次，选出三次不显症单株，进入下ー步筛选，得到抗性阳性TO代转基因棉花。3)、pBinl9-VSPl_GUS融合表达载体农杆菌介导法转化水稻
(I)挑取 GV3101/pBinl9-VSPl-GUS 单菌落，接种于 20ml 含 50mg/L 卡那霉素、50mg/L利福平和30mg/L链霉素的YEP培养基中，28。C、280rpm过夜培养至0D600为O. 7 O. 8。把菌液倒入I. 5ml的离心管中7，OOOrpm离心5分钟。弃掉上清，加入N6-AS液体培养基重悬菌细胞。用N6-AS液体培养基调节细胞浓度，用分光光度计测浓度，最适OD6c 值随农杆菌菌株和载体(有吋)变化很大，最适值是指三天内共培养，农杆菌细胞不会过多生长。(2)野生型水稻(日本睛，学名是 Oryza. Sativa L. spp. japonica, varnipponbare,记载在蒋云洪，日本睛水稻高产栽培技术，山东农业科学，1981年第2期中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)愈伤组织和细菌细胞(可在50ml的消毒锥形管中进行)混合，用手轻摇3分钟，愈伤组织与细菌溶液的比值不是影响转化效率的关键因素，15毫升的细菌悬浮液中可有几克愈伤组织。(3)倒出细菌溶液，把愈伤组织转移到无菌试纸上以去除多余的液体。把含有愈伤组织的试纸放在N6-AS半固体培养基上。每100x20mm的培养皿含20ml的N6-AS，然后用医用胶带封ロ。22°C暗中共培养愈伤组织和细菌细胞6天，在N6培养基(添加250ug/ml羧苄青霉素或头孢噻肟和3ug/ml双丙氨膦)上次继代培养愈伤组织16天，抗双丙氨膦的愈伤组织在第二次抗性选择的后期应该能清楚的分辨出来，非转化的野生型愈伤组织被筛选剂杀死，如果第二次选择分不清楚抗性愈伤组织需要进行第三次选择。(4)转基因植物的再生把独立的抗性愈伤组织转移到N6-R植物再生培养基中，每100x20mm的培养皿包含30ml的N6-R培养基，每培养皿10个愈伤组织，培养皿用医用胶带封ロ。在冷荧光灯下28°C培养愈伤组织直到看到芽和根的形成，两周之内应该形成芽。把小苗转移到含30mlMS-F培养基的盒子中，在冷荧光灯下28°C培养小苗14天。把幼苗转移到盆里，在温室中培养，得到抗性阳性TO代转基因水稻。三、转基因植株PCR鉴定I、转基因植株总DNA提取抗性阳性TO代转基因水稻和抗性阳性TO代转基因拟南芥用普通CTAB法进行总DNA提取；而抗性阳性TO代转基因棉花的总DNA提取方法如下(I)试剂配制表I为提取缓冲液(buffer I)的配方


本发明公开了一种维管组织特异表达启动子VSPl及其应用。本发明提供的DNA片段，为如下1)-3)中任一所述的DNA分子1)序列表的序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)所述DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)中所述DNA分子具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。本发明的实验证明，本发明提供一种新型的维管组织特异表达的启动子VSPl，将VSPl启动子与报告基因GUS相连，用带有该融合基因的载体转化拟南芥，水稻及棉花，该启动子能够在拟南芥、棉花、水稻等植物的维管组织中特异地启动基因表达。