专利名称：一种从外周血中扩增Vα24NKT细胞的方法自然杀伤T细胞(Natural killer T cells，NKT细胞)是一类天然存在的介导先天性免疫和获得性免疫的免疫细胞。其主要特征包括TCRV α链高度保守；能特异性识别抗原递呈细胞(APC)表面MHC I样分子CDld递呈的糖脂类抗原；活化后的细胞调节分泌多种细胞因子，直接或间接参与机体的免疫应答。小鼠NKT细胞TCR库的α链恒定表达V α 14J α 18，β链为V β 8. 2、V β 2或V β 7， 称为VaHNKT细胞。人的NKT细胞和小鼠高度同源，TCR库的α链为V a 24J a Q，与之配对的β链为V β 11，称为Va MNKT细胞。NKT细胞主要分布于胸腺和肝脏，脾脏和骨髓次之，外周血少见。NKT细胞的天然配体尚不清楚，但能与CDld分子提呈的海绵源性合成糖脂a -半乳糖基神经酰胺(a-GalCer)结合并被激活，分泌诸如IL_4、IFN-γ等细胞因子，同时表达颗粒酶、穿孔素、!^sL和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)，在诱导和维持肿瘤免疫应答、病原微生物、自身免疫以及免疫耐受中起着关键作用。⑶Id依赖性NKT细胞是⑶1反应性T细胞中的主要部分。⑶1蛋白是第三类抗原递呈分子，与MHC分子不同，CDl为非多态性，在细胞表面表达时无需功能性抗原加工相关转运体(TAP)。人⑶1基因家族有⑶Ia至⑶Ie五种基因，根据氨基酸序列同源性，将⑶la、 b、c归为I类，CDld归为II类。CDl分子抗原结合槽为疏水性，能提呈多种脂类抗原。α -GalCer是半乳糖基与神经酰胺酯通过α -联接形成的糖脂的总称，是已知的最有效的NKT细胞选择性抗原。从肿瘤患者外周血中分离所得的Va MNKT细胞，由 α -GalCer激活后在体内外均显示穿孔素依赖的抗肿瘤细胞毒活性。该细胞毒活性并不依赖于靶细胞上MHC-I类分子的表达，表明V α 24ΝΚΤ细胞与传统NK细胞的效应机制不同。 α -GalCer活化的NKT细胞产生的IFN- γ，及其诱导DC产生的IL-12，能增强NK细胞的天然抗肿瘤活性，以及CD8+T细胞的特异性抗肿瘤反应，因此在临床肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。NKT细胞在人体内的含量极少，仅占全血细胞的0. 02%左右，很难用于临床治疗。 目前多采用α-GalCer荷载DC的方法来实现NKT的扩增。但DC体外培养操作复杂且花费较大。研究发现CDld不仅表达在DC上，在NKT细胞的某一亚型或在单个核细胞及B细胞上也有表达，所以在抗原呈递细胞不参与的情况下，脐血和外周血的NKT细胞(TCR V α 24+TCR νβ11+)也有良好的扩增效率。本研究通过从外周血单个核细胞中直接扩增NKT细胞。
本发明要解决的是外周血中Va MNKT细胞含量极低，无法满足临床应用的技术问题，以及现有的制备方法复杂、效率低的技术难题。寻找一种简单高效的NKT细胞体外扩增方法。使用该方法可以产生足够数量的Va MNKT细胞。该Va MNKT细胞不仅分泌 IFN-Y和IL-4，而且穿孔素、颗粒酶表达率高。本发明采用如下技术方案采集并分离患者外周血单个核细胞，用含10%自身血浆的培养基重悬单个核细胞沉淀；加入糖脂抗原α-GalCer及细胞因子组合IL-2、IL_7、 IL-15刺激，置于37°C，5% CO2的培养箱中孵育，4天后补充含有IL-2的培养基继续培养 7-14天，即可得到高细胞毒活性的V α 24ΝΚΤ细胞。所述的培养基为GT-551人淋巴细胞培养基或RPMI1640，并添加了 10%自身血浆。 所述的单个核细胞是采用Ficoll密度梯度离心法分离收集，并用生理盐水清洗，低速离心后获得。所述的α -GalCer的终浓度为lOOng/ml，细胞因子IL-2的终浓度为100IU/ml， IL-7和IL-15的终浓度均为lOng/ml。依据单个核细胞的浓度不同细胞继续培养时间约 7-14天收集细胞。本发明所用的原料和试剂除特别说明外，均为市售可得。获得的V α MNKT细胞可以作为治疗肿瘤的自体免疫细胞制剂；V α MNKT细胞，能应用于治疗多种肿瘤的药物中，无论该肿瘤是否表达MHC，而且还适用于治疗病毒性疾病的药物中。本发明的有益效果是本方法具有扩增效率高、简单可行、重复性好、特异性强的特点，获得的Va MNKT细胞可以作为治疗肿瘤的自体免疫细胞制剂。本发明涉及自体免疫细胞制品制备技术，公开了一种从外周血中扩增Vα24NKT细胞的方法。在α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)和细胞因子组合IL-2、IL-7、IL-15的刺激下，从外周血中扩增Vα24NKT细胞，该扩增方法中的细胞因子组合有协同作用。本方法具有扩增效率高、简单可行、重复性好、特异性强的特点，获得的Vα24NKT细胞可以作为治疗肿瘤的自体免疫细胞制剂。