一种卡特兰组织培养的方法

邵和平, 张琼, 张宁宁, 孙永平, 夏明霞

2012年12月26日

2012年8月14日

2012年8月14日

江苏丘陵地区南京农业科学研究所

A01H4/00GK102835311SQ20121028748

卡特兰 组织培养

1.卡特兰的组织培养方法，其特征在干， (1)外植体的选择与灭菌 选61厘米长的新梢作材料，用升汞消毒法进行消毒，切取顶芽和侧芽生长点中心部位的分生组织块作外植体进行培养； (2)愈伤组织诱导培养 将外植体分生组织块放置在诱导培养基中，卡特兰茎尖増殖的诱导培养基为改良的MS + 6-BA3 10mg/L + NAA0. 5 3mg/L + 糖 20000 30000mg/L，培养条件为液体震荡暗培养，温度20 25°C，液体培养皿放置在回旋器上，回旋频率120rpm，培养40-60天； 其中，改良的MS基本培养基为，单位mg/L NH4N03 850 1850、KN03 1000 1900、CaCl2 · 2H20 250 650、MgS04 · 7H20 200 400、KH2P04 50 200、KI 0. 4 O. 9、H3B03 3. O 7. 0、MnS04 · 4H20 12. O 25. 0、ZnS04 · 7H20 2. 5 9. 5、Na2Mo04 · 2H20 O. 16 O. 35、CuS04 · 5H20 0. 016 O. 025、CoC12 · 6H20 0. 016 O. 025、FeS04 · 7H20 20. O 30. O、Na2 · EDTA · 2H20 18. O 40. O、肌醇50 100、氨基こ酸2. 0 3· O、谷氨酸10 18、天冬酰胺酸10 18 ； (3)继代培养 把增殖的愈伤组织转接到继代培养基，培养基配方为改良的KC +琼脂6000 8000mg/L + 糖 20000 30000mg/L，培养条件为 温度 20 28°C，光强 1500 3000Lx，每天光照12 16小时，每30天转接I次，愈伤组织上逐渐分化出原球茎，原球茎进ー步发育成幼苗； 其中，改良的 KC 基本培养基为，单位mg/L Ca (N03) 2 · 4H20 50(Tl000、ΚΗ2Ρ04 200 400、MgS04 · 7Η20 100 300、(NH4) 2S04 400 1000、NH4N03 350 850、FeS04 · 7H20 10 50、KCl 20(T400、MnS04 · 4H20 3. O 10. O ; (4)生根培养 将3 4cm高的苗接入生根培养基中，培养基配方为改良的KC + ΝΑΑ0. 2^2mg/L +琼脂6000 8000mg/L +糖20000 30000mg/L，培养条件为光照培养，温度为20 28°C，光强1500 3000Lx，每天光照16小时2.根据权利要求I所述卡特兰的组织培养方法，其特征在于，切割顶芽和侧芽生长点中心部位的分生组织块大小为直径2 4mm

本发明涉及一种卡特兰的组织培养快速繁殖方法，属于植物细胞工程技术领域ニ背景技术 卡特兰是世界上栽培最多，最受人们喜爱的洋兰之一它花型优美，色彩艳丽，并且有特殊的芳香一年四季都有不同的品种开花花期较长，一般可开放2 3周，不仅是珍贵的盆花，还是重要的高档切花组织培养技术的应用大大促进了卡特兰的规模生产，不仅能加快新品种推广，而且能够获得可观的经济效益但是卡特兰外植体在初始培养中易褐化死亡，是原球茎诱导成功的一大障碍目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起，即培养材料变褐主要是由伤ロ处分泌的酚类化合物引起选择适当的外植体是克服褐变的最主要的手段，取材时应注意选择分生能力较强的外植体成年植株比幼苗褐变程·度严重，夏季材料比冬季、早春及秋季材料的褐变严重，冬季培养物的存活率明显高于夏秋季节因此，采芽时机应尽可能避开生长旺盛期对外植体要充分漂洗，促进酚类物质渗出培养基的成分与褐变程度有关，要考虑所选培养基的状态和类型，筛选适宜的培养基配方在组织培养过程中，经常进行细胞筛选，可以剔除易褐变的细胞在外植体接种广2天后立即转移到新鲜培养基中，能减轻酚类物质对培养物的毒害作用，使外植体尽快分生，连续转移5飞次，可基本解决外植体的褐变问题现有技术方案切取优良母株的新梢进行茎尖诱导繁育通过研究，筛选出适合卡特兰茎尖培养及分生苗生长的培养基配方和组培快繁技木新梢经消毒后，于无菌条件下将外包嫩叶剥至广2片，小心切除芽基部，保留生长点内长约2 3cm的茎尖顶端分生组织块，接入茎尖培养基内培养，每瓶放I块将接种后的培养基置于室温(25 ±2)で、相对湿度70°/Γ90%、光照强度20001χ条件下诱导培养，经继代培养和生根培养，长成合格分生苗茎尖诱导培养以配方Α. 1/2 MS + BA 2 mg/L + NAA O. 2 mg/L + 椰乳200 ml/L + 3 %蔗糖和配方B. 1/2 MS + BA 2mg/L + NAA 0.2 mg/L + 3%蔗糖效果较好，表现为茎尖组织块分生率较高，诱导培养40天后外植体基部分生出较多的愈伤组织和不定芽点，经继代培养，不定芽点逐渐发育长成不定芽，切取的不定芽块转入生根培养，60天后长成根茎叶齐全、生长正常的分生瓶苗，可出瓶移栽现有技术从茎尖诱导不定芽到分生苗的培养周期较长，可能与卡特兰内源激素的作用和植物体生长发育周期较长有夫茎尖培养极易发生褐变，导致外植体切ロ组织坏死需通过以下几个方面的工作减轻外植体的褐变发生首先，要避免在高温季节采芽，因为高温有利植物体内酚类物质的产生，培养时褐变严重，新芽成活率较低，春秋季是较适宜的采芽季节；其次，需在培养基内単独或混合加入活性炭lg/L、聚こ烯吡咯烷酮(PVP)5g/L、柠檬酸2g/L等药剂抑制褐变；再次，培养温度要保持在20 25で，此时培养材料分泌产生的酚类物质较少，室温超过30°C时，褐变物质显著增加，成活率大大降低；此外，暗培养和勤转瓶(15 20天转I次)也能减轻褐化物质对外植体的危害三发明内容 技术问题本发明通过切取卡特兰新梢的顶芽和不同部位的侧芽生长点进行液体培养，详细描述了茎尖外植体的切割方法，一个新梢可以切取5个外植体，提高了増殖系数其次通过适宜的激素配比和液体培养技术，有效解决卡特兰茎尖常规培养方法的外植体褐变现象，提高培养质量因为酶促褐变如同一般的酶促反应，其发生必须具备三个条件，即酶、底物和氧液体培养阻断了外植体与氧气的接触，可有效抑制褐变现象，从而简化卡特兰的茎尖培养流程技术方案 利用卡特兰新梢顶芽和侧芽分生组织为外植体，通过添加适宜的激素配比和液体培养条件，进行愈伤组织诱导和分化，促进愈伤组织增殖并分化出原球茎，切割原球茎进行继代培养，培养出幼苗，经生根培养长成合格的瓶苗具体步骤如下 Cl)外植体的选择与灭菌 选61厘米长的新梢作外植体，用升汞消毒法进行消毒，分别取新梢上顶芽和侧芽作外植体进行培养，切割顶芽和侧芽生长点中心部位的分生组织大小为直径2 4mm(2)愈伤组织诱导培养 将外植体分生组织块放置在诱导培养基中，卡特兰茎尖増殖的诱导培养基为改良的MS + 6-BA3 10mg/L + NAA0. 5 5mg/L + 糖 20000 30000mg/L，培养条件为液体震荡暗培养，温度20 25°C，液体培养皿放置在回旋器上，回旋频率120rpm，培养40 60天； 其中，改良的MS基本培养基为，单位mg/L NH4N03 850 1850、KN03 1000 1900、CaCl2 · 2H20 250 650、MgS04 · 7H20 200 400、KH2P04 50 200、KI 0. 4 O. 9、H3B03 3. O 7. 0、MnS04 · 4H20 12. O 25. 0、ZnS04 · 7H20 2. 5 9. 5、Na2Mo04 · 2H20 O.16 O. 35、CuS04 · 5H20 0. 016 O. 025、CoC12 · 6H20 0. 016 O. 025、FeS04 · 7H20 20. O 30. O、Na2 · EDTA · 2H20 18. O 40. O、肌醇50 100、氨基こ酸2. 0 3· O、谷氨酸10 18、天冬酰胺酸10 18 ； (3)继代培养 把增殖的愈伤组织转接到继代培养基，培养基配方为改良的KC +琼脂6000 8000mg/L + 糖 20000 30000mg/L，培养条件为 温度 20 28°C，光强 1500 3000Lx，每天光照12 16小时，每30天转接I次，愈伤组织上逐渐分化出原球茎，原球茎进ー步切割转接培养，发育成幼苗； 其中，改良的 KC 基本培养基为，单位mg/L Ca (N03) 2 · 4H20 50(Tl000、ΚΗ2Ρ04 200 400、MgS04 · 7Η20 100 300、(NH4) 2S04 400 1000、NH4N03 350 850、FeS04 · 7H20 10 50、KCl 20(T400、MnS04 · 4H20 3. O 10. O ; (4)生根培养 将3 4cm高的苗接入生根培养基中，培养基配方为改良的KC + ΝΑΑ0. 2^2mg/L +琼脂6000 8000mg/L +糖20000 30000mg/L培养条件为光照培养，温度为20 28°C，光强1500 3000Lx，每天光照16小时幼苗长成合格的瓶苗有益效果 本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果 I、外植体选择途径有优势，即可以扩大増殖系数，相比顶芽培养侧芽分生力強，具有较高的培养成活率2、液体培养可以克服卡特兰茎尖培养极易发生褐变的障碍，提高培养质量3、培养基配方在MS和KC基本培养基的基础上改良，易配制，成本低四

I、切割卡特兰新梢的顶芽和侧芽作外植体培养材料在毎年春秋两季卡特兰生长旺盛期采集材料，选6 8厘米长的新梢，用利刀切下放入保鲜袋中在实验室内先把外表的尘土 彻底冲洗干净，用升汞消毒法进行消毒剥去外层叶片，再用流水冲洗30分钟，再用O. 1%的升汞消毒10分钟，最后用无菌蒸馏水漂洗6 8次，毎次5分钟分别取新梢上的顶芽和侧芽作外植体进行培养顶芽外植体在芽点下部水平切取，再在生长点中心部位的四周切割取出分生组织块；侧芽外植体切取先从芽点的上部纵向斜切一刀，在生长点下部横切一刀，把生长点分离，再在生长点中心部位切取的分生组织块大小为直径4飞_2、获取的分生组织块在解剖镜下用无菌解剖刀剥除残留的叶原基后，重新切取生长点中心部位的分生组织块大小为直径2 4_，作为外植体进行初始培养3、将外植体放置在诱导培养基中，卡特兰茎尖増殖的诱导培养基为改良MS基本培养基和附加不同成份的物质，改良MS基本培养基为，单位mg/L NH4N03 850 1850、KN03 1000 1900、CaC12 · 2H20 250 650、MgS04 · 7H20 200 400、KH2P04 50 200、KI 0. 4 O. 9、H3B03 3. O 7. O、MnS04 · 4H20 12. O 25. O、ZnS04 · 7H20 2. 5 9. 5、Na2Mo04 ·2H20 0. 16 O. 35、CuS04 ·5Η20 0. 016 O. 025、CoC12 ·6Η20 0. 016 O. 025、FeS04 · 7H20 20. O 30. O、Na2 · EDTA · 2H20 18. O 40. O、肌醇50 100、氨基こ酸