专利名称：一种利用固定化酵母细胞制备栀子蓝色素的方法目前，世界各国的天然色素开发品种已达百种，我国已批准使用的达40多种，但大多数属红、黄色，我国天然蓝色素的产量也不高。桅子蓝色素是以茜草科植物山桅的果实为原料，采用生物工程技术制得的一种安全无毒的食用天然色素，它耐热、耐光、耐酸碱，PH 适用范围广，易溶解于水和低醇，可替代化学合成蓝色素单独使用，也可以与红、黄类色素调配成绿、紫、棕等色调混合使用，在国外被广泛应用于食品、制药及化妆品等产品的着色。 我国于1999年在制定新增食品添加剂的使用卫生标准时将其列入，用于蛋白质、糖和淀粉等食品着色。目前国内对桅子蓝色素的分离提纯工艺研究较少。我国是世界上食品需求量最大的国家，作为食品添加剂等重要组成部分的天然食用色素的需求量与日俱增。同时，我国也是桅子产量最多的国家之一，以桅子为发酵工业原料，通过微生物的生物转化生产天然蓝色素，不仅能充分该利用资源，而且符合我国天然色素开发的趋势和需要。现有技术中生产桅子蓝的方法主要采用桅子苷、氨基酸和产β -葡萄糖苷酶的酵母菌，将产β -葡萄糖苷酶的酵母菌的酵母直接投入到桅子苷溶液和氨基酸溶液中，桅子苷经β-葡萄糖苷酶水解后生成的桅子甙元与谷氨酸反应生成桅子蓝色素溶液，由于酵母中不仅存在β -葡萄糖苷酶，还存在其他物质，将其直接与桅子苷溶液和氨基酸溶液中，会引入杂质，而且酵母与产品难分离；另一方面酶离开了酵母细胞直接裸露在液体中，降低了酶的活性，因此，采用该方法得到的桅子蓝的质量和纯度均不理想。
本发明克服了现有技术中的不足，提供一种能够提高桅子蓝的质量和纯度的利用固定化酵母细胞制备桅子蓝色素的方法。本发明的技术方案如下一种利用固定化酵母细胞制备桅子蓝色素的方法，包括如下步骤a)将产葡萄糖苷酶的酵母菌株按总重量3%_7%接种于培养基上发酵得到菌液，菌液经离心后，取下层菌液用海藻酸钠溶液进行包埋，形成海藻酸钠-酵母菌悬液，将海藻酸钠-酵母菌悬液逐滴滴入到氯化钙溶液中形成固定化酵母细胞；b)将桅子苷溶液、氨基酸溶液以及固定化酵母细胞搅拌混合，得到桅子蓝溶液；c)将桅子蓝溶液加入到由大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂组成的柱中，用乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩，浓缩液经喷雾干燥得到桅子蓝粉末。作为改进，步骤a)中将海藻酸钠-酵母菌悬液逐滴滴入到1 -4mol/L氯化钙溶液中固化，形成直径为l_2mm的固定化小球，固化温度为20— 37°C，固化时间为10-1 ； 将固定化小球置于0. 01-0. lmol/L的氯化钙溶液中硬化形成固定化酵母细胞，硬化时间为l-5h。作为改进，b)步骤中加入醋酸缓冲液调节PH至3-6，反应温度为40_50°C，搅拌速度为100-200r/min，搅拌时间为3_8h。作为改进，b)步骤中桅子苷溶液与氨基酸溶液等体积混合后，取混合液与固定化酵母细胞以质量比4:1的比例搅拌混合。作为改进，步骤a)中的培养基为YPDL液体培养基，发酵温度为^°C、发酵时间为 72小时。作为改进，b)步骤中桅子苷溶液的质量浓度为5%-10%、氨基酸溶液的质量浓度为 3%-7% 。作为改进，步骤b)中桅子苷溶液所采用的桅子苷的制备方法如下a)取桅子粉末，加入其质量10-50倍的水溶解，制备成桅子溶液；
b)将桅子溶液过滤后，将滤液加入到由聚苯乙烯型非极性大孔吸附树脂组成的柱中， 用体积浓度为20—30%的乙醇洗脱，将洗脱液浓缩、冷冻干燥后得到桅子苷制品。作为改进，上述海藻酸钠溶液的质量浓度为2%_6%。 作为改进，步骤c)中的乙醇溶液的体积浓度为50%-70%。作为改进，上述氨基酸选自甘氨酸、精氨酸、谷氨酸钠、苯丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、 谷氨酸钠中的一种。本发明采用的固定化酵母细胞方法，将产β -葡萄糖苷酶的酵母菌株不经处理直接固定化，将固化后的产葡萄糖苷酶的酵母菌株加入溶液中，使用完后直接将固化后的产β -葡萄糖苷酶的酵母菌株过滤，克服了传统的以流离酵母发酵导致的酵母与产品难分离，易流失等问题，保持了酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定性，且具有生长周期短、抗污染能力强等优势，节约了成本，提高了桅子蓝的质量和纯度。

YPDL液体培养基取葡萄糖2g，蛋白胨2g，酵母浸粉lg，加蒸馏水至IOOml后于121°C 灭菌20min制得。YEPD固体培养基取葡萄糖2g，蛋白胨2g，酵母浸粉lg，琼脂2g，加蒸馏水至 IOOml后于121°C灭菌20min制得。本发明所述的“产葡萄糖苷酶的酵母菌株”是利用市售的酿酒酵母发酵培养筛选出的，筛选方法如下
a)取市售酿酒酵母2g，溶解于IOmL蒸馏水中，用接种环于YEPD固体培养基上划板， 于37 °C恒温培养过夜；
b)取单菌落接种于5mLYPDL培养基上于^°C、180r/min摇床中培养72小时得到发酵
液；
c)取步骤b)中的发酵液ImL置于4°C低温保存，再向剩余发酵液中加入7%桅子苷溶液和5%氨基酸溶液各4mL，用醋酸缓冲溶液调节溶液pH为5，置于45°C的恒温锅中反应2h， 若溶液变蓝说明此酵母单菌落可以产β-葡萄糖苷酶；
d)若酵母单菌落可以产β-葡萄糖苷酶，则取步骤c)中于4°C低温保存的ImL发酵液用接种环于YEPD固体培养基上划板，于37°C恒温培养过夜得到产β-葡萄糖苷酶的酵母菌株；
本发明所述的“产葡萄糖苷酶的酵母菌株”指的是步骤d)中得到的产β-葡萄糖苷酶的酵母菌株。实施例1
a)将3mL产β-葡萄糖苷酶酵母菌株接种于装有IOOmLYPDL液体培养基的三角瓶中， 于^°C、180r/min摇床中发酵培养72小时得到菌液，菌液经离心后，取下层菌液加入到21 海藻酸钠溶液中充分混合均勻，形成海藻酸钠-酵母菌悬液，将海藻酸钠-酵母菌悬液逐滴滴入到lmol/L氯化钙溶液中固化，形成直径为l_2mm的固定化小球，固化温度为20°C，固化时间为IOh ；将固定化小球置于0. 01mol/L的氯化钙溶液中硬化形成固定化酵母细胞，硬化时间为Ih ；将制备的固定化酵母细胞置于4°C下保存备用；
b)称取IOOg桅子粉末溶于IL蒸馏水中，过滤，将滤液加入到由聚苯乙烯型非极性大孔吸附树脂组成的柱中，用体积浓度为20%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得到桅子苷粉末；配制质量浓度5%的桅子苷溶液，取桅子苷溶液2L和3%精氨酸溶液2L混合后， 取混合液4 Kg,混合液中加入固定化酵母细胞lKg，用醋酸缓冲液调节溶液pH为3. 2后，置于40°C的恒温锅中以lOOr/min的搅拌速率反应lh，得到桅子蓝溶液；
c)将桅子蓝溶液加入到由大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂组成的柱中，用蒸馏水洗至滴出液为无色液体后再用体积浓度为50%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液；将洗脱液浓缩，喷雾干燥得到桅子蓝粉末。色价为108，纯度为90%。实施例2
a)将5mL产β-葡萄糖苷酶的酵母菌株接种于装有IOOmLYPDL液体培养基的三角瓶中，于、180r/min摇床中发酵培养72小时得到菌液，菌液经离心后，取下层菌液加入到 4%海藻酸钠溶液中充分混合均勻，形成海藻酸钠-酵母菌悬液，将海藻酸钠-酵母菌悬液逐滴滴入到3mol/L氯化钙溶液中固化，形成直径为l_2mm的固定化小球，固化温度为30°C，固化时间为15h ；将固定化小球置于0. 05mol/L的氯化钙溶液中硬化形成固定化酵母细胞，硬化时间为池；将制备的固定化酵母细胞置于4°C下保存备用；
b)称取200g桅子粉末溶于5L蒸馏水中，过滤，将滤液中加入到由聚苯乙烯型非极性大孔吸附树脂组成的柱中，用体积浓度为40%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得到桅子苷粉末；配制质量浓度7%的桅子苷溶液，取桅子苷溶液3L和3%甘氨酸溶液3L混合后， 取混合液6 Kg，往混合液中加入固定化酵母细胞1. ^(g，用醋酸缓冲液调节溶液pH为4. 5 后，置于15°C的恒温锅中以180r/min的搅拌速率反应池；得到桅子蓝溶液；
c)将桅子蓝溶液加入到由大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂组成的柱中，用蒸馏水洗至滴出液为无色液体后再用体积浓度为60%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液；将洗脱液浓缩，喷雾干燥得到桅子蓝粉末。色价为112，纯度为89%。实施例3
a)将7mL产β -葡萄糖苷酶酵母菌株接种于装有IOOmLYPDL液体培养基的三角瓶中， 于^°C、180r/min摇床中发酵培养72小时得到菌液，菌液经离心后，取下层菌液加入到6% 海藻酸钠溶液中充分混合均勻，形成海藻酸钠-酵母菌悬液，将海藻酸钠-酵母菌悬液逐滴滴入到4mol/L氯化钙溶液中固化，形成直径为l_2mm的固定化小球，固化温度为37°C，固化时间为18h ；将固定化小球置于0. lmol/L的氯化钙溶液中硬化形成固定化酵母细胞，硬化时间为证；将制备的固定化酵母细胞置于4°C下保存备用；
b)称取200g桅子粉末溶于IOL蒸馏水中，过滤，将滤液加入到由聚苯乙烯型非极性大孔吸附树脂组成的柱中，用体积浓度为30%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得到桅子苷粉末；配制质量浓度10%的桅子苷溶液，取桅子苷溶液4L和3%谷氨酸钠溶液4L混合， 取混合液8 Kg,往混合液中加入固定化酵母细胞^ig,用醋酸缓冲液调节溶液pH为3后，置于50°C的恒温锅中以200r/min的搅拌速率反应证；得到桅子蓝溶液；
c)将桅子蓝溶液加入到由大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂组成的柱中，用蒸馏水洗至滴出液为无色液体后再用体积浓度为70%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液；将洗脱液浓缩， 喷雾干燥得到桅子蓝粉末。色价为123，纯度为92%。实施例4
a)将7mL产β-葡萄糖苷酶的酵母菌株接种于装有IOOmLYPDL液体培养基的三角瓶中，于、180r/min摇床中发酵培养72小时得到菌液，菌液经离心后，取下层菌液加入到 7%海藻酸钠溶液中充分混合均勻，形成海藻酸钠-酵母菌悬液，将海藻酸钠-酵母菌悬液逐滴滴入到2mol/L氯化钙溶液中固化，形成直径为l_2mm的固定化小球，固化温度为35°C，固化时间为15h ；将固定化小球置于0. 08mol/L的氯化钙溶液中硬化形成固定化酵母细胞，硬化时间为池；将制备的固定化酵母细胞置于4°C下保存备用；
b)称取200g桅子粉末溶于IOL蒸馏水中，过滤，将滤液加入到由聚苯乙烯型非极性大孔吸附树脂组成的柱中，用体积浓度为25%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得到桅子苷粉末；配制质量浓度7%的桅子苷溶液，取桅子苷溶液4L和5%苯丙氨酸溶液4L混合， 取混合液8Kg，往混合液中加入固定化酵母细胞^ig,用醋酸缓冲液调节溶液pH为5后，置于45°C的恒温锅中以150r/min的搅拌速率反应池；得到桅子蓝溶液；
c)将桅子蓝溶液加入到由大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂组成的柱中，用蒸馏水洗至滴出液为无色液体后再用体积浓度为55%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液；将洗脱液浓缩，喷雾干燥得到桅子蓝粉末。色价为107，纯度为87%。实施例5
a)将5mL产β-葡萄糖苷酶的酵母菌株接种于装有IOOmLYPDL液体培养基的三角瓶中，于、180r/min摇床中发酵培养72小时得到菌液，菌液经离心后，取下层菌液加入到 5%海藻酸钠溶液中充分混合均勻，形成海藻酸钠-酵母菌悬液，将海藻酸钠-酵母菌悬液逐滴滴入到2mol/L氯化钙溶液中固化，形成直径为l_2mm的固定化小球，固化温度为25°C，固化时间为他；将固定化小球置于0. 02mol/L的氯化钙溶液中硬化形成固定化酵母细胞，硬化时间为证；将制备的固定化酵母细胞置于4°C下保存备用；
b)称取200g桅子粉末溶于5L蒸馏水中，过滤，将滤液加入到由聚苯乙烯型非极性大孔吸附树脂组成的柱中，用体积浓度为25%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得到桅子苷粉末；配制质量浓度8%的桅子苷溶液，取桅子苷溶液3L和5%苏氨酸溶液3L混合，取混合液6Kg，往混合液中加入固定化酵母细胞1. ^(g，用醋酸缓冲液调节溶液pH为4后，置于 20°C的恒温锅中以150r/min的搅拌速率反应4h ；得到桅子蓝溶液；
c)将桅子蓝溶液加入到由大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂组成的柱中，用蒸馏水洗至滴出液为无色液体后再用体积浓度为55%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液；将洗脱液浓缩，喷雾干燥得到桅子蓝粉末。色价为109，纯度为88%。
实施例6
a)将3mL产β-葡萄糖苷酶的酵母菌株接种于装有IOOmLYPDL液体培养基的三角瓶中，于、180r/min摇床中发酵培养72小时得到菌液，菌液经离心后，取下层菌液加入到 2%海藻酸钠溶液中充分混合均勻，形成海藻酸钠-酵母菌悬液，将海藻酸钠-酵母菌悬液逐滴滴入到2mol/L氯化钙溶液中固化，形成直径为l_2mm的固定化小球，固化温度为35°C，固化时间为12h ；将固定化小球置于0. 03mol/L的氯化钙溶液中硬化形成固定化酵母细胞，硬化时间为4h ；将制备的固定化酵母细胞置于4°C下保存备用；
b)称取IOOg桅子粉末溶于IL蒸馏水中，过滤，将滤液加入到由聚苯乙烯型非极性大孔吸附树脂组成的柱中，用体积浓度为35%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得到桅子苷粉末；配制质量浓度6%的桅子苷溶液，取桅子苷溶液2L和5%亮氨酸液2L混合，取混合液4 Kg,往混合液中加入固定化酵母细胞lKg，用醋酸缓冲液调节溶液pH为6后，置于 30°C的恒温锅中以120r/min的搅拌速率反应池；得到桅子蓝溶液；
c)将桅子蓝溶液加入到由大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂组成的柱中，用蒸馏水洗至滴出液为无色液体后再用体积浓度为40%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液；将洗脱液浓缩，喷雾干燥得到桅子蓝粉末。色价为106，纯度为85%。


本发明涉及一种利用固定化酵母细胞制备栀子蓝色素的方法，包括如下步骤a)将产β-葡萄糖苷酶的酵母菌株接种于培养基上发酵得到菌液，菌液经离心后，取下层菌液用海藻酸钠溶液进行包埋，形成海藻酸钠-酵母菌悬液，将海藻酸钠-酵母菌悬液逐滴滴入到氯化钙溶液中形成固定化酵母细胞；b)将栀子苷溶液、氨基酸溶液、固定化酵母细胞搅拌混合，得到栀子蓝溶液；c)将栀子蓝溶液加入到大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂组成的柱中，用乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩，浓缩液经喷雾干燥得到栀子蓝粉末。本发明将酵母菌发酵液不经处理直接固定化，克服了传统的以流离酵母发酵导致的酵母与产品难分离，易流失等问题，提高了栀子蓝的纯度。