Satb1在治疗皮肤t细胞淋巴瘤中的应用的制作方法【技术领域】。[0003]LyP, PCALCL和MF起源于单个T淋巴细胞的优势克隆，LyP能够进展到PCALCL或MF已经得到证实。然而皮肤T细胞淋巴瘤中⑶30+的恶性肿瘤细胞的发生发展机制仍然不清楚。既往关于这方面的研究主要集中于TGF-β受体的突变及⑶30信号通路的改变。研究发现，与LyP相比，部分PCALCL细胞表面的TGF-β受体发生突变，从而摆脱了由⑶30+Τ细胞自身分泌的TGF-β对细胞生长的负性调节及凋亡诱导，使细胞出现凋亡抵抗，进而出现不受控制的肿瘤性增生。但后来人们发现，只有一少部分PCALCL患者的TGF- β受体出现突变，故而其并不是导致凋亡抵抗的主要原因。又有研究显示:在对PCALCL细胞系的体外研究中观察到，PCALCL细胞的CD30受体激活以后，细胞出现增殖增加及凋亡抵抗。故而提出LyP及PCALCL细胞中CD30下游不同通路的激活可能导致疾病的不同临床表现及进展。但尚无研究表明LyP的皮损中有相应的细胞通路激活的证据。[0004]SATBl (special AT-rich binding proteinl,特异性 AT 富集区结合蛋白 I)是一种组织特异性的核基质结合蛋白，主要表达于T细胞的前体——胸腺细胞上。SATBl以特殊的笼状结构分布于细胞核骨架，通过与DNA的特殊区域相结合而调控染色质的高级结构，同时参与染色体重塑、组蛋白乙酰化、甲基化等过程，从而调控多种组织特异性基因的表达。SATBl在T细胞的正常发育中起到至关重要的作用。SATBl基因敲除小鼠的胸腺细胞发育停滞在⑶4+⑶8+双阳性细胞阶段，而不产生⑶4+或⑶8+单阳性的成熟T细胞。SATBl在成熟的外周T细胞分化中的作用近年来成为研究热点。研究发现SATBl高表达于活化的⑶4+T细胞，而在无反应⑶4+T细胞及调节性T细胞中不表达。[0005]SATBl在外周成熟T细胞及T细胞肿瘤中的作用尚不清楚。
[0006]本发明的目的是提供一种SATBl在治疗皮肤T细胞淋巴瘤中的应用，本发明提供的SATBl蛋白特异性的高表达于皮肤T细胞淋巴瘤中⑶30+的肿瘤性T淋巴细胞上，且其表达随着疾病进展而增加。此外，SATBl蛋白的高表达对于维持肿瘤细胞的恶性生物学表型及疾病进展起到重要作用，抑制该基因的表达可以降低⑶30+CLPD细胞系(如Mac — I)的生存率以及体外克隆形成能力、阻滞细胞周期、促进细胞凋亡。[0007]将如下任一物质作为靶点的产品在制备预防和/或治疗皮肤T细胞淋巴瘤的药物中的应用:
[0008](I) SEQ ID N0.1 所示的蛋白；
[0009](2) SEQ ID N0.2 所示的 DNA 分子；
[0010](3) SEQ ID N0.2中自5’末端起第1736位至第4024位核苷酸所示的DNA分子。
[0011]所述皮肤T细 胞淋巴瘤中具有⑶30+的肿瘤性T细胞。
[0012]将如下任一物质作为靶点的产品在制备抑制皮肤T细胞淋巴瘤中CD30+的肿瘤性T细胞生长和/或增殖的药物中的应用也属于本发明的保护范围:
[0013](I)SEQ ID N0.1 所示的蛋白；
[0014](2) SEQ ID N0.2 所示的 DNA 分子；
[0015](3) SEQ ID N0.2中自5’末端起第1736位至第4024位核苷酸所示的DNA分子。
[0016]将如下任一物质作为靶点的产品在制备降低皮肤T细胞淋巴瘤中CD30+的肿瘤性T细胞肿瘤形成能力的药物中的应用也属于本发明的保护范围:
[0017](I)SEQ ID N0.1 所示的蛋白；
[0018](2) SEQ ID N0.2 所示的 DNA 分子；
[0019](3) SEQ ID N0.2中自5’末端起第1736位至第4024位核苷酸所示的DNA分子。
[0020]将如下任一物质作为靶点的产品在制备促进皮肤T细胞淋巴瘤中CD30+的肿瘤性T细胞凋亡的药物中的应用也属于本发明的保护范围:
[0021](I)SEQ ID N0.1 所示的蛋白；
[0022](2) SEQ ID N0.2 所示的 DNA 分子；
[0023](3) SEQ ID N0.2中自5’末端起第1736位至第4024位核苷酸所示的DNA分子。
[0024]如下任一物质作为诊断标记在制备检测皮肤T细胞淋巴瘤和/或其中⑶30+的肿瘤性T细胞的药物或试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围:
[0025](I)SEQ ID N0.1 所示的蛋白；
[0026](2) SEQ ID N0.2 所示的 DNA 分子；
[0027](3) SEQ ID N0.2中自5’末端起第1736位至第4024位核苷酸所示的DNA分子。
[0028]上述任一所述的应用中，所述皮肤T细胞淋巴瘤为蕈样肉芽肿或原发皮肤CD30+T淋巴细胞增殖性疾病。[0029]所述蕈样肉芽肿为MF大细胞转化；
[0030]所述原发皮肤CD30+T淋巴细胞增殖性疾病为淋巴瘤样丘疹病或原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤或两者的中间类型。
[0031]上述任一所述的应用中，所述皮肤T细胞淋巴瘤中⑶30+的肿瘤性T细胞为淋巴瘤样丘疹病细胞外周血中的异型淋巴细胞或从淋巴瘤样丘疹病发展到原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤中的细胞；
[0032]具体为Mac-1、Mac_2A 和 Mac_2B 细胞。
[0033]上述任一所述的应用中，所述产品为具有抑制SEQ ID N0.1所示的蛋白活性的物质，具体为SEQ ID N0.1所示的蛋白的抗体。
[0034]上述任一所述的应用中，所述产品为具有抑制SEQ ID N0.2所示的DNA分子和/或SEQ ID N0.2中自5’末端起第1736位至第4024位核苷酸所示的DNA分子活性的物质；
[0035]所述物质具体为如下(1)-(4)任一所述的DNA分子:
[0036](I) SEQ ID N0.8 所示的 DNA 分子；
[0037](2) SEQ ID N0.9 所示的 DNA 分子；
[0038](3) SEQ ID N0.10 所示的 DNA 分子；
[0039](4) SEQ ID N0.11 所示的 DNA 分子。
[0040]如下(I) - (4)任一所述的DNA分子也属于本发明的保护范围:
[0041 ] (I)SEQ ID N0.8 所示的 DNA 分子；
[0042](2) SEQ ID N0.9 所示的 DNA 分子；
[0043](3) SEQ ID N0.10 所示的 DNA 分子；
[0044](4) SEQ ID N0.11 所示的 DNA 分子。
[0045]SATBl作为靶点在治疗皮肤T细胞淋巴瘤中具有广泛的应用前景。



[0046]图1为免疫组织化学染色(A)和组织免疫荧光双染(B)结果。
[0047]图2为流式细胞仪检测⑶30和SATBl的表达。
[0048]图3为组织免疫荧光双染检测⑶30和SATBl。
[0049]图 4 为 Macl、Mac2A、Ma2B、Hut78 及 Jurkat 中 SATBlmRNA (A)和 SATBl 蛋白(B)的表达。
[0050]图5为CD30+CLPD进展不同的标本中SATBlmRNA的表达。
[0051]图6为GVl 18慢病毒载体。
[0052]图 7 为 Macl、Macl-shO、Macl-shl、Macl-sh2、Macl_sh3 和 Macl_sh4 中 SATBlmRNA(A)和SATBl蛋白(B)的表达。
[0053]图8 为 Macl、Macl-shO、Macl-shl 和 Macl_sh2 细胞系在 96 小时内的增殖。
[0054]图9为Macl、Macl-shO、Macl_shl和Macl_sh2细胞培养7天后形成的细胞群落数以及形态。
[0055]图10 为 Macl、Macl-shO、Macl-shl 和 Macl_sh2 细胞的细胞周期检测。
[0056]图11 为 Macl、Macl-shO、Macl-shl 和 Macl_sh2 细胞的凋亡检测。
[0057]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0058]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0059]下述实施例中的统计学分析:
[0060]用SPASS11.0软件，计量资料采用均数土标准差表示。细胞mRNA的表达，细胞的生存率分析以及细胞凋亡采用计量资料，多个样本的均数比较采用单向方差分析(AN0VA)，P < 0.05为差异有统计学意义。
[0061 ] 下述实施例中患者标本及对照标本:
[0062]下述实验遵循《赫尔辛基宣言》得到了北京大学第一医院伦理委员会批准，所有患者及正常对照均签署了知情同意书。实验从2002年到2014年在北京大学第一医院皮肤科收集50例CTCL包括6例MF-LCT (MF大细胞转化)、25例LyP (淋巴瘤样丘疹病)和19例PCALCL (原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤)石蜡标本(其中4例LyP和9例PCALCL石蜡组织切片由美国波士顿医学院罗格威廉姆斯医学中心的皮肤科Marshall E.Kadin教授提供；6例LyP石蜡组织切片由四川大学华西医学中心皮肤科教授王琳提供)，以及25例皮肤良性炎性疾病标本和10例非大细胞转化的MF标本(此处指斑块期MF (plaque stage MF)、肿瘤期MF (tumor stage MF)标本，其中 不含有表达⑶30+的肿瘤性T细胞)作为对照，25例皮肤良性炎性疾病标本包括5例扁平苔藓、3例湿疹、4银屑病、5例特应性皮炎、5传染性软疣和3例嗜酸细胞增多性皮病；4例正常人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclearcell，PBMC)及初始T细胞(Naive T细胞)作为细胞实验对照。所有炎症性皮肤病对照标本、LyP-A, LyP-C, PCALCL+, PCALCL-临床标本得到3位皮肤病理学专家最终诊断；CTCL病例的临床和病理诊断，根据最新的国际皮肤淋巴瘤协会(ISCL)、欧洲癌症研究和治疗组织(EORTC)以及美国皮肤淋巴瘤联盟(USCLC)推荐的最新修订标准。
[0063]鼠抗人SATBl单克隆抗体购自BD Bioscience公司，货号为611182。
[0064]羊抗鼠生物素二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号为SP2000。
[0065]辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
[0066]羊抗鼠/兔突光二抗购自Invitrogen。
[0067]细胞系Hut-78和Jurkat购自美国ATCC。
[0068]细胞系Mac-l、Mac-2A 和 Mac_2B 在文献“Davis, T.H.，et al.(1992).〃Hodgkin’ sdisease, lymphomatoid papulosis,and cutaneous T-cell lymphoma derived from acommon T-cell clone.〃N Engl J Med，326 (17): 1115-1122.”中公开过，公众可从北京大学
第一医院获得。
[0069]Power SYBR^ Green PCR Master Mix 试剂盒购自 Life Technology 公司，产品目录号为4368577。
[0070]pGC-LV 载体、pHelperl.0 载体、pHelper2.0 载体在文献“You，W.，et al.(2013).Construction of lentiviral vector containing Homo sapiens forkhead box C2geneand its expression in bone marrow mesenchymal stem cells of rabbits.ZhongguoXiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi27 (5): 535-540.”中公开过，公众可从北京大学第一医
院获得。
[0071]MethoCult CFC 培养基购自 StemCell Technologies，货号为 H4230。[0072]SATBl的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0073]SATBl的基因序列如SEQ ID N0.2所示，编码区为SEQ ID N0.2中自5’末端起第1736位至第4024位所示。
[0074]实施例1、SATBl在皮肤T细胞淋巴瘤⑶30+的肿瘤性T细胞中特异性高表达
[0075]一、免疫组织化学染色
[0076]将MF大细胞转化(MF — LCT)、淋巴瘤样丘疹病(LyP)、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤(PCALCL)石蜡标本进行免疫组织化学染色，步骤如下:
[0077](一)标本石蜡包埋，制成5μπι的切片，常规脱蜡入水，顺次放入二甲苯1、11各10分钟，无水乙醇1、II，体积百分含量95%的乙醇水溶液1、II，体积百分含量80%的乙醇水溶液各5分钟，蒸馏水充分水化3-5分钟，用PBS (ρΗ7.4)冲洗3次，每次5分钟。
[0078](二)抗原修复:将组织切片放入0.01mol的枸橼酸钠缓冲液中在微波炉中高火加热至沸腾后，换至中火加热lOmin，拿出静置冷却至室温。 [0079](三)每张切片滴加I滴3%过氧化氢阻断溶液，室温下孵育10-15分钟，以阻断内源性过氧化酶的活性。用PBS (pH7.4)冲洗3次，每次5分钟。
[0080](四)除去PBS液，每张切片滴加正常山羊血清遮盖组织，室温下孵育15-20分钟，以封闭非特异性抗原。
[0081](五)除去血清，每张切片滴加一抗(鼠抗人SATBl单克隆抗体)，4°C过夜。阴性对照(皮肤良性炎性疾病标本和非大细胞转化的MF标本(斑块期MF (plaque stage MF)、肿瘤期MF (tumor stage MF)标本，其中不含有⑶30+的肿瘤性T细胞))使用PBS代替一抗。
[0082](六)用PBS(pH7.4)冲洗2次，每次5分钟。除去血清，每张切片滴加I滴羊抗鼠生物素二抗，室温下孵育20分钟。用PBS冲洗3次，每次3-5分钟。
[0083](七)除去PBS液，每张切片滴加I滴辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，室温下孵育20分钟。用PBS (ρΗ7.4)冲洗2次，每次3-5分钟。
[0084](A)除去PBS液，每张切片滴加2滴新鲜配制的DAB溶液，显微镜观察显色5_10分钟。
[0085](九)自来水冲洗，苏木素复染3-5分钟，1%盐酸酒精分化I分钟。
[0086](十)切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
[0087]MF大细胞转化(MF — LCT)、淋巴瘤样丘疹病(LyP)、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤(PCALCL)中的细胞以具有⑶30+的肿瘤性T细胞为特点。
[0088]MF大细胞转化(MF — LCT)、淋巴瘤样丘疹病(LyP)、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤(PCALCL)石蜡标本经过上述免疫组织化学染色的结果如图1中A所示，染色结果见表1。
[0089]二、组织免疫荧光双染
[0090](一)将标本制备成3.5 μ m的石蜡组织切片，并在70度烤片2小时。
[0091](二)两个二甲苯各脱蜡15分钟。
[0092](三)在体积百分含量分别为100%、95%、85%、70%乙醇的水溶液中各放置5分钟。
[0093](四)PBS冲洗2次，每次3分钟。
[0094](五)柠檬酸盐缓冲液95度修复25分钟，PBS冲洗3次，每次3分钟。
[0095](六)3%过氧化氢在室温下孵育15分钟，孵育时避光。PBS冲洗3次，每次3分钟。
[0096](七)一抗(鼠抗人SATBl单克隆抗体)在4度下孵育过夜，PBS冲洗3次，每次3分钟。
[0097](八)羊抗鼠/兔突光二抗(购自Invitrogen,Alexaflour488/595)在室温下孵育I小时，孵育时避光，PBS冲洗3次，每次3分钟。
[0098](九)用含有DAPI的封片胶封片并盖上盖玻片，避光放置10分钟。
[0099](十)使用Leica激光共聚焦显微镜，选取405/488/543激光观察相应指标在目的细胞着色情况。
[0100]LyP石蜡标本的组织免疫荧光双染实验结果如图1中B所示。
[0101]图1表明，SATBl高表达于⑶30+的肿瘤性T细胞中。
[0102]SATBl 蛋白在6 例斑块期MF (plaque stage MF)、4例肿瘤期MF (tumor stage MF)、5例MF大细胞转化(MF - LCT),23例淋巴瘤样丘疹病(LyP)、12例原发皮肤间变大细胞淋巴瘤(PCALCL)中的表达情况如表1所示。
[0103]其中23例LyP中有19例SATBl出现阳性表达，而且3例SATBl表达阴性的病例，⑶30蛋白的表达也为阴性。12例PCALCL患者SATBl和⑶30蛋白均为阳性表达。5例MF - LCT患者SATBl和⑶30蛋白均为阳性表达。10例非大细胞转化的MF (6例斑块期MF(plaque stage MF)、4例肿瘤期MF(tumor stage MF))其SATBl蛋白的表达均为阴性。
[0104]从以上结果可以看出SATBl蛋白的表达与⑶30的表达高度相关。
[0105]同时，组织免疫荧光双染激光共聚焦显示SATBl和⑶30蛋白共同表达于核大深染，胞浆丰富，明显异型的CD30+T淋巴瘤细胞包膜和细胞核上，两者高度一致的共定位，⑶30+T淋巴瘤细胞旁边的组织细胞和反应性增生的炎细胞不表达SATBl。
[0106]综上所述，SATBl特异性的高表达于⑶30+的肿瘤性T细胞中。
[0107]表1 SATBl和CD30在CTCL中的表达统计
[0108]