专利名称：一种用于五种流感病毒亚型核酸分型检测的试剂盒的制作方法附图为本实用新型的一种具体实施例。该实施例包括带有盒盖1的盒体2，盒体2 内部设有海绵托3，海绵托3上设有若干个固定孔4，固定孔4内放置有多个反应管，第一反 应管5内装有A型、B型、H3亚型检测反应液；第二反应管内装有H5亚型、新型Hmi亚型 检测反应液；第三反应管内装有A型流感阳性对照；第四反应管内装有B型流感阳性对照； 第五反应管内装有A型H3亚型阳性对照；第六反应管内装有A型H5亚型阳性对照；第七反 应管内装有新型Hmi亚型阳性对照；第八反应管内装有阴性对照；第九反应管内装有逆转录酶和扩增酶，盒盖1为滑套式结构。采用本实用新型的用于五种流感病毒亚型核酸分型检测的试剂盒，使用步骤如 下( 1)标本、对照品的核酸提取取不少于200 μ 1鼻、咽拭子和鼻咽吸取物悬浮样本进行核酸提取，病毒RNA提取 可采用核酸分离纯化试剂盒，按说明书操作要求进行；(2) PCR 扩增(2-1)检测标本可使用2种反应液(Α、B、Η3反应液和Η5、HlNl反应液)同时进行 分型检测，也可单独使用，每次试验均应设置阴性对照和阳性对照；(2-2)体系配制(2-2-1)准备将Α、Β、Η3反应液和H5、Hmi反应液融化后轻轻混勻，避免起泡，并 在分取时慢慢吸取，逆转录酶和扩增酶用前混勻再吸取；(2-2-2)体系配制按下列组分配制(反应液配制请在冰上进行)组分体积反应液17μ 1逆转录酶和扩增酶1μ 1依反应管数按照上述比例配制反应混合液，每管分装18μ 1，然后分别加入 2 μ IRNA 模板；(2-2-3 )进行 RT-PCR 反应PCR反应管用离心机瞬时离心后放入PCR仪中进行RT-PCR反应。按下图表显示程序进行反应歩骤 1 Il W^KJH_ m 48_ 50分钟￥■ I — mi n i| IMji- 循_ C 1 12 觀性S4-aJW* - Idl, 变性9430秒3 退火 延伸55 .721浦 1捕4 靈伸721◎分_1(3)结果分析待PCR反应完成后，取7 μ 1产物进行电泳(2%AgoroSe)，观察有无特异性条带。4[0033](4)结果判断在仪器正常，阴性参照、阳性参照均正常的情况下，a.反应液为A、B、H3反应液①如果出现163bp大小的片段，则表明是A型流感；②如果出现202bp大小的片段，则表明是B型流感；③如果163bp和351bp大小的片段同时出现，则表明是H3亚型。b.反应液为H5、Hmi反应液①如果出现218bp大小的片段，则表明是H5亚型；②如果出现510bp大小的片段，则表明是新型Hmi亚型。备注不用时，应于_20°C贮存，避免反复冻融。因此，本实用新型的有益效果是该用于五种流感病毒亚型核酸分型检测的试剂 盒，采用多重RT-PCR扩增的方法，可一次反应同时对流感病毒A型、A型H3亚型、B型或A 型H5亚型、新型Hmi亚型进行检测，试剂盒组成简单，使用方便，省时省力，不需要使用荧 光定量PCR仪等贵重仪器，便于在基层推广。