专利名称：海洋微生物发酵生产低温超氧化物歧化酶的方法超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, EC I. 15. I. 1，简写 S0D)是一类广泛存在于生物体内的金属酶，能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应生成过氧化氢和分子氧，从而清除生物体内的氧自由基，起到保护生物体免受伤害作用(自俊青，大理师专学报，1998)。1969年Mccord和Fridovich发现该酶生物催化活性并命名为超氧化物歧化酶(林庆斌，化学世界，2006)。按其结合的金属元素种类不同，可将其分为三类ー类是蓝绿色Cu，Zn-SOD，相对分子量约32000，主要存在于真核细胞的胞液和叶绿体中，是研究最多、最深入的ー类；第二类是紫红色Mn，Fe-SOD，相对分子量约40000，主要存在于原核生物细胞及线粒体的基质中；第三类是黄褐色Fe-SOD，相对分子量约38700，主要存在于原核细胞及ー些植物中(陈惠芳，生命的化学，2003)。SOD作为生物酶制剂，医疗上主要用于辅助放疗与化疗，肾、肝、心脏等器官的保护和移植，消除辐射引起的副作用，以及作为某些疾病的探针等；食品エ业作为添加剂应用于饮料和啤酒等。近年来SOD被广泛用于治疗氧中毒、老年性白内障、糖尿病、心血管疾病、各种炎症等多种疾病(张博润等，微生物学通报，1992);几十年来SOD—直是国内外研究热点，起初阶段多集中于从动物血液或植物组织中提取S0D，中期阶段普通微生物发酵生产SOD的研究开始起步并日渐增多，目前普通微生物生产SOD已然成为研究的主体。普通微生物发酵生产的SOD最适作用温度一般为45 55°C，而人体的生理温度一般为36. 5 37°C，致使普通微生物发酵生产的SOD不能充分发挥作用，出现治疗效果差或没有效果(曾胤新，微生物学杂志，2004)。海洋微生物(低温、寡营养、低光照、高压)发酵生产的SOD最适作用温度一般为35 40°C，比较接近人体的生理温度，应用于治疗效果比较明显。而海洋微生物发酵生产SOD研究尚在起步阶段，产业化、规模化海洋微生物发酵生产SOD还未见报道。鉴于动物SOD血液来源困难、安全性以及普通微生物发酵生产的SOD应用最适作用温度的局限性，利用海洋微生物发酵生产的低温SOD具有很大的应用优势。海洋低温SOD对热反应极为敏感，且在自然环境温度下具有高酶活力及高催化效率，经过温和的热处理即可使低温酶的活力丧失，如果将SOD应用于食品エ业从而大大缩短处理过程的时间并省却昂贵的加热或冷却费用，且不影响产品品质(郑洲等，极地研究，2007)，这将有助于低温SOD的推广和使用，从根本上摆脱繁琐的提取エ艺及中温酶的加热、冷却设备和流程。鉴于海洋微生物发酵生产的SOD在自然和生理温度下的应用优势，海洋低温SOD在医疗保健、食品、化 妆品等方面具有广泛的应用前景和开发潜力。
本发明的目的是提供ー种海洋微生物发酵生产低温SOD的方法，该发明主要是海洋微生物经过定向驯化后，按常规方法液体发酵生产低温SOD的方法，这种生产方法获得的低温SOD活性可以达到180U/ml，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制齐U。该酶制剂最适作用温度接近人体生理温度，医疗效果显著；在食品加工中应用操作简单、方便、快捷、成本低，可以从根本上避免中温酶的加热、冷却设备和エ艺。本发明所述的ー种海洋微生物发酵生产低温SOD的方法具体包括以下步骤(I)将产生SOD的海洋微生物进行定向驯化，使其在自然条件下生长良好；(2)按常规方法将定向驯化后的SOD产生菌8 14°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和ニ级种子； (3)将液体一级种子或ニ级种子，按发酵液体积的4 10%接种量接入液体发酵培养基中，在8 14°C培养60 96h时，即海洋微生物发酵生产低温SOD结束；(4)将(3)的发酵液4，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(5)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集的上清为SOD粗酶液；(6)根据不同需要和使用对象不同，将(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。SOD产生菌(CGMCC编号I. 3或I. 11)先活化、定向驯化后，按本发明产酶条件发酵生产低温S0D，驯化后的菌株在4°C中可保存2个月，用10 25%甘油制成的菌悬液、在_80°C条件下可以长期保藏。(3)将⑵活化好的菌种进行定向驯化，使其在自然条件下生长良好；(4)按常规方法将定向驯化后的SOD产生菌在8 14°C培养24 36h，按5 8%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和ニ级种子；(5)将(4)制备的ニ级种子按发酵液体积4 6%的接种量接入IOL的产酶培养基中，在8 10°C培养84 96h吋，即海洋微生物发酵生产低温SOD结束；(6)将(5)的发酵液4，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(7)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为SOD粗酶液； (8)根据不同需要和使用对象不同，将(7)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温SOD制剂。实施例ニ (I)培养基制备①菌种活化培养基葡萄糖10. 0g，牛肉膏14.(^，蛋白胨7.(^，酵母粉4.(^，琼脂20. Og,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。②菌种定向驯化培养基葡萄糖8. O 16. 0g，牛肉膏12. O 24. Og,蛋白胨4. O 12. Og,酵母粉 2. O 8. 0g, NaCl 5. O 10. Og,琼脂 15. O 30. Og,蒸馏水 I. 0L, pH 值 7. 0，121°C高压蒸汽灭菌30min。③液体种子培养基葡萄糖8. O 15. Og,牛肉膏8. O 16. Og,蛋白胨5. O 15. 0g，酵母粉 2. O 10. 0g，NaCl 5. O 10. 0g，自来水 I. 0L，pH 值 7. 0，121°C 高压蒸汽灭菌 30min。④发酵产酶培养基葡萄糖15. O 25. 0g, (NH4) 2S043. O 10. 0g，玉米浆5. O 15. 0g，酵母粉 2. O 8. OgjNaCl 5. O 10. 0g，CaCO3L O 6. 0g，MgSO4O. I 0. 9g,自来水I.0L, pH 值 7. 0,121°C高压蒸汽灭菌 30min。(2)将产生SOD的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将(2)活化好的菌种进行定向驯化，使其在常规压力、盐浓度条件下生长良好；(4)按常规方法将定向驯化后的SOD产生菌在8 14°C培养24 36h，按5 8%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和ニ级种子；(5)将(4)制备的ニ级种子按发酵液体积6 8%的接种量接入50L的产酶培养基中，在10 12°C培养72 84h时，即微生物发酵生产低温SOD结束；(6)将(5)的发酵液4，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(7)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为SOD粗酶液；(8)根据不同需要和使用对象不同，将(7)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温SOD制剂。实施例三(I)培养基制备①菌种活化培养基葡萄糖lO.Og，牛肉膏14.(^，蛋白胨7.(^，酵母粉4.(^，琼脂20. Og,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。②菌种定向驯化培养基葡萄糖8. O 16. 0g，牛肉膏12. O 24. Og,蛋白胨4. O 12. Og,酵母粉 2. O 8. 0g, NaCl 5. O 10. Og,琼脂 15. O 30. Og,蒸馏水 I. 0L, pH 值 7. 0，121°C高压蒸汽灭菌30min。③液体种子培养基葡萄糖8. O 15. Og,牛肉膏8. O 16. Og,蛋白胨5. O 15. 0g，酵母粉 2. O 10. 0g，NaCl 5. O 10. 0g，自来水 I. 0L，pH 值 7. 0，121°C 高压蒸汽灭菌 30min。④发酵产酶培养基葡萄糖15. O 25. 0g, (NH4) 2S043. O 10. 0g，玉米浆5. O 15. 0g，酵母粉 2. O 8. OgjNaCl 5. O 10. 0g，CaCO3L O 6. 0g，MgSO4O. I 0. 9g,自来水
I.0L, pH 值 7. 0,121°C高压蒸汽灭菌 30min。(2)将产生SOD的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将⑵活化好的菌种进行定向驯化，使其在常规压力、盐浓度条件下生长良好；(4)按常规方法将定向驯化后的SOD产生菌在8 14°C培养24 36h，按5 8%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和ニ级种子；(5)将(4)制备的ニ级种子按发酵液体积8 10%的接种量接入200L的产酶培养基中，在12 14°C培养60 72h时，即微生物发酵生产低温SOD结束；(6)将(5)的发酵液4，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(7)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为SOD粗酶液；(8)根据不同需要和使用对象不同，将(7)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温SOD制剂。


本发明所述的一种海洋微生物发酵生产低温超氧化物歧化酶的方法是将产生超氧化物歧化酶的海洋微生物进行定向驯化，使其在自然条件下生长良好；将定向驯化后的超氧化物歧化酶产生菌在8～14℃逐级扩大培养，按发酵液体积的4～10％接种量接入液体发酵培养基中，在8～14℃培养60～96h时，即海洋微生物发酵生产低温超氧化物歧化酶结束；发酵液在4,000～8,000rpm离心收集菌体，数次洗涤后收集沉淀，悬浮于缓冲液中，并加石英砂研磨，10,000～14,000rpm离心收集上清即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，可以将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。