专利名称：调节包括与粘膜体表面接触的疫苗抗原的物质的作用的新的非抗原性粘膜佐剂制剂的制作方法粘膜疫苗在全球范围内越来越普遍，部分是由于相对于皮下或者其它传统施用方式来说这些疫苗容易施用，相对于与聚集大众进行传统疫苗施用相关的传统延迟，这种便利有助于自身施用粘膜疫苗，以及减少甚至逐渐不使用皮下注射器针头。开发有效粘膜疫苗的另外的益处在于自己施用，因此避免训练人员进行传统方式施用的必要。粘膜表面是引起动物和人疾病的微生物最常见的入侵途经。特化的免疫系统，配备有大量淋巴样细胞，保护这些表面抵抗微生物侵袭。这种所谓粘膜免疫系统可以对侵入的病原微生物以及对施用到粘膜表面上的疫苗抗原产生强特异性免疫应答。对人和兽医中与免疫系统的该重要部分直接相互作用的粘膜疫苗产生兴趣有着合理的生物学基础。与注射疫苗相比，可以作为鼻用喷雾剂或者口服补剂施用的疫苗的明显优点也刺激该领域的快速发展。但是，粘膜疫苗不会成为现存注射疫苗的现实替代品，除非可以改进这样的疫苗的功效。辅助物质，或者佐剂的应用是最有希望增强粘膜疫苗的抗体应答和临床功效的途经之一。长期以来佐剂和传统疫苗一起使用来增强免疫应答，使得使用较少疫苗产生免疫应答。关于免疫途经之间的差异，比较更传统的注射方法和粘膜施用已经做了大量工作，并且结论被广泛接受。存在大量证据证明有两个免疫系统外周免疫系统和粘膜免疫系统。相信这些系统在大多数物种包括人体内独立并且同时地运行。本申请的发明点是粘膜疫苗，更具体地说是疫苗和佐剂的新的制剂，其中佐剂应该是无毒性的，应该不破坏粘膜的完整性，应该具有适合通过粘膜组织中的M-细胞运输的物理-化学特性，激活非特异性免疫而不诱导对抗其本身(佐剂)的抗体产生，刺激淋巴细胞产生特异性针对抗原的抗体，不诱导对抗原的耐受性，作为抗原的相容载体起作用，增强非特异性免疫并且提高特异性疫苗的临床功效。本发明第一次公开了具有这些期望的特征的粘膜疫苗制剂并且给出了不同时产生对其本身的抗体应答的确实存在的粘膜佐剂作用的证据。因此可以预见这里给出的新的粘膜佐剂制剂对人以及对兽医都是有用的新贡献。详细描述抗原和佐剂对粘膜表面M-细胞的选择性定向似乎是增强分泌免疫应答的最有希望的途经，因为这些细胞专门将抗原取样直接暴露给胃肠道和呼吸道粘膜组织中的免疫细胞。已知通过M-细胞转运对于微粒物质比对于可溶性物质更有效。与微粒相比，可溶性物质还可以粘附于并且穿透上皮内衬的其它部分，因此干扰更宽范围的免疫活性细胞，并且结果对免疫应答具有比微粒抗原和微粒佐剂更不可预测的作用。大小以及可能还有它们的化学性质影响微粒的转运效率。粒度范围在1-10微米的微粒似乎被最有效地转运。
对既用于注射又用于粘膜施用的更安全并且更好的疫苗的搜索集中在确定并且制备诱导高抗原应答和高度保护作用的纯化的抗原。但是大多数纯化的疫苗抗原当施用到粘膜表面上时是弱的免疫原。因此有必要提供佐剂来增强粘膜疫苗抗原诱导有效抗体应答的能力。有很多具有这种能力的物质。但是，所有的检测其增强粘膜疫苗的功效的佐剂都有一个或多个缺点。现有产品的最严重的缺陷是1)不可接受的毒性作用，2)诱导抗佐剂本身的抗体产生，3)诱导对疫苗抗原的免疫耐受性。
具有亲脂或者赋予表面活性的其它特征的几种物质可以提高跨粘膜吸收作用，因此提高疫苗抗原的粘膜免疫原性。对于白喉和破伤风类毒素已将这样的赋形剂混入鼻用佐剂并且验证，并且与在人体试验中经鼻施用吸附铝的疫苗相比较。证实了明确的佐剂作用，但是局部副作用是显著的，可能是由于赋形剂对上皮膜的作用引起的。膜完整性的破坏也引起关于对粘膜表面同时存在的除疫苗抗原之外的免疫应答的忧虑。
霍乱是一种异常有效的粘膜免疫原，并且是对同时和相同位点施用的不相关抗原的粘膜和系统性抗体应答的有效佐剂。其佐剂活性的机理是复杂的，并且可能包括通过其B-亚基跨越上皮细胞的抗原吸收增强，抗原呈递细胞的正调节，和刺激B-细胞转换。但是，在体外CT和CTB(霍乱毒素B)两者对T-细胞的直接作用是抑制性的，提示这是佐剂性和耐受性诱导的可能机理。
证明抗原与重组CTB的偶联增强口服送递之后对CTB本身和偶联的抗原两者的系统耐受性。与对肠道送递的耐受原性相比，CTB作为佐剂对经鼻送递的表观作用可能是由于污染商售CTB制剂的痕量全毒素，恢复其佐剂活性。但是，比较商售和重组CTB的最新报道显示重组CTB对经鼻送递的佐剂作用，疫苗抗原与CTB偶联和与CTB混和都是如此。
已经证明与几种不同的疫苗抗原一起经鼻送递之后CT/CTB诱导保护性免疫。此外，可以诱导对CT以及相关抗原的长期免疫记忆应答。因为″野生型″全毒素对于用作人粘膜佐剂来说毒性太大，所以开发了没有毒性的CT的新重组体。但是CT的佐剂性是否能够与其毒性分开这一点悬而未决。CTB被认为是没有毒性的，但是当试图对人高剂量鼻内施用时诱导大的刺激作用。
CT诱导对其自身和混和的抗原的免疫，这限制其反复施用的佐剂作用。针对这一问题的几项研究表明对该佐剂的先存免疫性可以抑制对该抗原的血清应答，其程度甚于局部粘膜应答。
最近使用CT作为对全细胞细菌疫苗制剂的佐剂的研究证明其佐剂作用的其它局限性，特别是对经鼻送递。这证实CT的佐剂机理可能不同于微粒佐剂的机理，并且不同免疫途经具有不同的佐剂活性。
大肠埃希氏菌热不稳定肠毒素HLT具有类似于CT的A-B结构，和氨基酸序列80％同源性。HLT佐剂性机理还没有象对CT这样广泛研究，该机理可能多少有所不同。而且，曾提出HLT可以通过其以和CT同样的方式对上皮内淋巴细胞的作用而消除粘膜耐受性。HLT在一定程度上毒性比CT小，并且和CT一样，与B-亚基一起施用的痕量全毒素可以恢复其佐剂性而没有毒性。
HLT是有效的粘膜佐剂，鼻内送递之后能诱导广泛分布的保护性免疫应答，并且在诱导保护性免疫方面象是和CT一样有效。对于与HLT同时施用的一种以上的抗原的血清和粘膜抗体，它是一种有效的佐剂。构建了具有保留的佐剂性的无毒性突变体。但是，仍然不清楚这些突变体是否能够诱导保护性免疫并且佐剂性是否能够与毒性分开。当在对人的研究中试图鼻内施用补充有痕量重组LT的重组LTB(HLT的亚基)作为流感佐剂时，其佐剂作用似乎相当适度，并且局部不期望的副作用显著。
鼻内施用与抗原偶联的重组LTB能以和口服CTB同样的方式诱导外周耐受性。
其它细菌毒素或衍生物例如百日咳毒素也类似于霍乱毒素，并且已产生了无毒突变体。在一项研究中鼻内送递时无毒B亚基诱导抗流感的保护性免疫，并且在另一项研究中将无毒突变体与CT相比较。就保护性免疫来说，所述突变体至少和百日咳毒素一样有效，但是就系统性抗体增强来说其免疫原性比CT低。百日咳毒素的佐剂活性是公知的并且归因于其致有丝分裂作用。
胞壁酰二肽和衍生物是来自分枝杆菌细胞壁的成分，已经证明这些物质当在攻击之前经鼻给予时诱导免疫应答非特异性增强。
使用壳多糖衍生物和细胞因子GM-CSF证实了相同的作用原理。尝试过用脂质体包被鼻内施用细胞因子IL-2并且诱导保护性免疫，而IL-4则无效。当与疫苗抗原结合时在诱导保护性免疫方面IL-2也优于LTB，尽管抗体水平相当。当眼部施用时I1-5和I1-6被包入微球体并且增强粘膜IgA应答。
脂质体
脂质体是由脂质层组成的人造脂小泡，其中抗原可被包在脂质体的含水区室中，或者通过表面偶联技术与表面上的抗原结合。在对所包被的抗原适度的条件下可以大规模容易并且低成本地制备脂质体。它们不诱导对于它们本身的免疫应答，并且在人体中用于肠胃外施用药物。
它们的粘膜佐剂性最初归因于它们的微粒特性，因此意味着载体活性。载体功能意味着载体和抗原之间的某种物理关系，至少同时施用抗原和载体。但是，在一项研究中证明在用亚基抗原鼻内免疫之前多至48小时施用空脂质体会诱导增强的免疫性。
当与不同的抗原鼻内施用时，它们佐剂作用的结果不一致。大多数研究证明全身和分泌性体液应答增强，有保护功能。但是，有人指出这些研究在鼻沉积疫苗期间采用了麻醉，该过程使得疫苗扩散到整个呼吸树，包括肺。因为这涉及除与鼻相关组织之外的其它淋巴-上皮结构，所以可能导致与当抗原只在鼻腔中沉积时诱导的那些应答不同的免疫应答。事实上，这提示脂质体可以通过其对肺泡巨噬细胞的作用而发挥它们的佐剂活性，所述肺泡巨噬细胞通常是不好的抗原呈递细胞。在未麻醉动物鼻内使用脂质体的那些研究中，没有始终如一地证实佐剂作用。使用从病毒膜制备的脂质体(更可能分类为蛋白体而非脂质体)的一项研究证明在未麻醉动物中抗流感保护作用的佐剂作用。因此，脂质体的任何佐剂活性的机理仍有待解决。此外，因为脂质体在使用中象是安全的，也应该在对人的研究中评价其粘膜佐剂性。
ISCOMS(免疫刺激复合体)
ISCOM基质是带负电荷的笼样结构，由皂苷与胆固醇和磷脂的相互作用产生，其中可以引入抗原样的蛋白质。在兽医疫苗中广泛使用ISCOM基质，并且已经证明其诱导体液免疫和细胞毒性(CTL)T-细胞-介导的应答。关于它们的毒性有一些忧虑，可能与具有表面活性的内在佐剂皂甙的含量有关。
最近几年，尝试将ISCOMS作为粘膜佐剂。但是，当对未麻醉的实验动物进行鼻免疫时没有清楚地证明其佐剂活性。
生物可降解的聚合微球体
生物可降解的聚合微球体通常指由DL-丙交酯和乙交酯的聚合物(PLG)组成的，在体内通过水解而生物降解为乳酸和乙醇酸的微粒。疫苗抗原可包入微粒中，可以控制其大小并因而控制其降解速度和体内分布。PLG微粒是非免疫原性的并且证实了肠胃外药物送递期间对人体使用的安全性。但是，关于包封方法有所忧虑，其涉及使用有机溶剂，有使包封的抗原变性的可能性，并且可能有痕量的这样的溶剂保留在微粒中。抗原的变化也可以发生在体内水解降解时微粒内的酸性内环境中。
大多数使用PLG-包被的疫苗抗原进行粘膜免疫的研究利用口服或经胃途经，而某些使用鼻送递。它们增强具有保护功能的免疫应答，包括记忆应答，并且在两项研究中也诱导了细胞-介导的应答。但是在口服送递抗原的研究中ISCOMS比PLG微粒更始终如一地诱导CTL应答。另一项研究证明使用包被在微粒中的细胞因子对眼施用时分泌性抗体增加。
据称其它微粒例如聚烷基氰基丙烯酸酯微粒是生物相容微粒，其吸附蛋白质并且证实在口服免疫时有佐剂性。已经制备出从衍生化α-酸制备的微球体并且还证明了口服之后的佐剂活性。这些微粒中没有一种证实诱导保护性免疫，或者对人进行了验证。
蛋白体是由60至100nm小泡组成的微粒，最初从脑膜炎球菌外膜蛋白质制备而得。从不同的细菌或病毒制备的其它膜蛋白制剂可能具有相似特征和活性，并且也可以称为蛋白体。证明了蛋白体作为疫苗抗原对人肠胃外施用具有安全性，它们容易大规模制备，并且能与是粘膜表面上的弱免疫原的合成肽或蛋白质连接。除了它们的微粒性质之外，它们可以通过它们对B-细胞的作用而发挥佐剂活性。它们的亲脂性质也意味着通过生物膜的吸收作用的增强。
已经尝试将蛋白体作为粘膜佐剂鼻内送递细菌脂多糖，葡萄球菌肠毒素B和病毒蛋白质。这些研究中的一些也证明这些微粒能增强保护性的持续时间长的免疫应答。它们至少是和霍乱毒素一样好的佐剂。使用来自脑膜炎球菌的外膜小泡作为对人使用的鼻疫苗的最近研究证明了其免疫原性以及不存在副作用。此外，诱导了与临床保护相关的杀菌抗体，但是比从ELISA测定的特异性抗体效价预计的杀菌活性更大。
对于粘膜施用，灭活细菌作为微粒佐剂也有效。最近的研究用全脑膜炎球菌和百日咳细菌已经证明这一点，其中当对未麻醉小鼠鼻内送递时大大增强对灭活流感病毒的系统性和分泌性抗体。提到过通过噬菌体介导的溶胞作用获得的所谓细菌菌蜕作为用于粘膜送递的有效的疫苗载体。
细菌毒素是有效的粘膜佐剂，但是，以它们的天然形式使用毒性太大。没有毒性的衍生物和可溶性表面活性剂由于增加了通过上皮粘膜疫苗抗原的摄入而可能具有粘膜佐剂活性。但是，关于在人体试验中使用时这些物质的佐剂性对耐受原性的机理以及副作用还不清楚。M-细胞介导的微粒佐剂吸收似乎是粘膜送递非增殖疫苗抗原之后诱导免疫应答的更可靠的途经。惰性微粒象脂质体，ISCOMs和生物可降解微球体由于它们的安全记录具有对人使用的可能性。但是，它们对鼻送递的佐剂作用，优选在人体研究中的佐剂作用，有待证实。细菌衍生的微粒，象蛋白体和全细胞细菌(对人经鼻施用没有显著副作用)对动物是有效的粘膜佐剂。现在，虽然对它们本身有免疫原性，但是这样的微粒似乎是最有希望的粘膜佐剂。
如果认识到的与佐剂及其在粘膜免疫或接种中的应用相关的问题被解决将是本领域的进步。
因此，本发明提供对粘膜施用有效的佐剂，所述佐剂包括由在侧链中通过β-1，3和β-1，6键连接在一起的葡萄糖单体组成的多糖。这些佐剂有利地调节与粘膜表面接触或者施用于粘膜表面的药物的生物作用。出人意料的是，证明佐剂增强粘膜疫苗制剂的功效，所述粘膜疫苗制剂包括但不限于流感病毒疫苗，变应性疫苗和治疗关节炎所用的疫苗。
粘膜疫苗和β-1，3/β-1，6多糖(葡聚糖)佐剂可以口服，经鼻，经直肠，经阴道施用，通过胃施用或者使疫苗和佐剂与粘膜表面接触的任何其它方法施用。
用于粘膜的新佐剂的制备
接种(施用)
微颗粒产物。根据美国专利No5,401,727(这里引作参考)中描述的方法，通过在碱和酸中反复萃取干啤酒糖酵母，制备该产品。描述的萃取过程去除了酵母细胞中的细胞质成分和细胞表面含有甘露糖的多糖和蛋白聚糖。根据先前描述的方法制备的产物，由粒度2-5微米的β-1，3/β-1，6-葡聚糖组成。该微粒β-1，3/β-1，6-葡聚糖的化学结构特征是83％β-1，3交联的葡萄糖，6％β-1，6交联的葡萄糖和5％β-1，3，6-交联的葡萄糖，而且是有β-1，3，6-交联的葡萄糖作为分支点的β-1，3-葡聚糖链。将微粒产物制备成无菌蒸馏水中的3％(w/v)悬浮液(贮存悬浮液)并且用0.3％甲醛保存。通过离心并且再悬浮于无菌蒸馏水中去除甲醛，接着稀释成适合于粘膜施用的浓度，从该贮存悬浮液制备试验微粒佐剂产物。
酶处理过的微粒产物.在该产物中，微粒产物中β-1，6-交联的葡萄糖的侧链通过用酶进行酶处理而被选择性去除，根据挪威专利No 300692，所述酶特异性作用于多聚葡萄糖链中的β-1，6-键将根据美国专利No5,401,727制备的微粒产物(0.2克)悬浮于pH5.0的40ml 50mM乙酸铵缓冲液中，并且与20单位的β-1，6-葡聚糖酶混合。将该混合物在37摄氏度下连续搅拌6小时，并且通过煮沸5分钟终止酶的作用。通过离心和再悬浮，在无菌蒸馏水中反复洗涤残留的酶处理过的微粒。得到的产物是有在分支点通过β-1，6-键合连接的β-1，3-葡聚糖侧链，而在从分支点延伸的侧链中没有β-1，6-键合的葡萄糖的分支的β-1，3-葡聚糖。
溶解的产物。该产物具有和如上所述制备的微粒产物相同的化学组成。不同的是所述微粒分解成更小的分子聚集体溶解于水中。根据挪威专利No.300 692描述的方法制备该产物将微粒产物(2克)悬浮于1升甲酸(90％)中并且在连续搅拌下加热至80摄氏度。将该悬浮液冷却到35摄氏度并且在真空下蒸发以去除游离的甲酸。将残余物悬浮于0.5升蒸馏水中并且煮沸3小时。冷却后通过微孔过滤器(0.44微米孔径)将悬浮液过滤，并且冷冻干燥。将冷冻干燥的产物悬浮于0.1升蒸馏水中并且用蒸馏水透析(截留阈是5000道尔顿)24小时，然后冷冻干燥。在实验中使用溶解于合适的水溶液的干燥产物。
溶解的酶处理过的产物。根据如上所述相同的方法通过溶解酶处理过的微粒产物(6.1.2.)制备该产物。
实验疫苗
为了研究上述β-1，3β-1，6-葡聚糖制剂的佐剂作用，就下述能力比较实验流感疫苗制剂a)诱导特异性抗体应答和b)当随后在体外接触疫苗抗原时引发T-细胞增殖。对照疫苗含有没有加入任何佐剂的热灭活全流感病毒(＝INV)或者没有佐剂的相同病毒的纯化抗原(“片段疫苗”＝片段-INV)。从相同的流感病毒疫苗制剂制备实验疫苗，但是与上述佐剂混合。
实验中使用的动物是雌性BALB/c小鼠，6-8周龄(实验开始时)。
实验设计
以每周间隔用疫苗制剂之一对每组6-10只小鼠的实验组鼻内免疫四次。以滴剂施用疫苗，麻醉小鼠的鼻腔中剂量体积是30微升。以未免疫的小鼠作为对照。最后一次疫苗给药之后一周，收集唾液，血清和脾细胞样本用于对特异性抗体应答和抗原特异性T-细胞增殖进行分析。
B-和T-细胞应答分析
根据酶联免疫吸附测定(ELISA)所述分析血清和唾液中作为对本研究中使用的流感疫苗(INV)的特异性应答而生成的IgG和IgA型抗体。通过测量C14标记的胸苷掺入核酸的率分析体外脾细胞培养物中CD4+T-细胞的抗原-特异性增殖。
结果
所有上文提到的β-1，3β-1，6-葡聚糖产物通过刺激先天和非特异性防御机理而增强动物对疾病的抵抗力这是公知的知识(参见美国专利No.5,401,727；挪威专利No.300 693)。β-1，3β-1，6-葡聚糖不诱导抵抗它们本身的抗体产生这也是公知的知识。先前假定β-1，3β-1，6-葡聚糖当与疫苗抗原一起注射至动物时可以作为增强疫苗功效的佐剂起作用。但是，先前没有证明对动物的粘膜表面上施用β-1，3β-1，6-葡聚糖以这样的方式影响体内特异性免疫系统，使得其更积极地对施用到粘膜表面上的抗原发生应答。下面的实施例证明β-1，3β-1，6-葡聚糖产物诱导产生抗共同施用到粘膜表面上的疫苗抗原的特异性抗体的能力增强，并且，β-1，3β-1，6-葡聚糖产物引发脾中的T-细胞更活跃地对随后接触相同的疫苗抗原发生应答。
实施例1
表1单独用疫苗或者使用混合有实验佐剂的相同疫苗对小鼠经鼻免疫之后，产生的抗流感病毒“片段疫苗”(片段-INV)的血清抗体的量(数据以每毫升中IgG千单位数表示)
实施例1的数据表明，当与非增殖流感病毒疫苗一起施用到小鼠鼻腔中时，新的佐剂制剂(在本例中是微粒产物)提高抗流感疫苗抗原的血清(IgG)抗体的产生。
实施例2
表2单独用疫苗或者使用混合有实验佐剂的相同疫苗对小鼠经鼻免疫之后，抗流感病毒“片段疫苗”(＝片段-INV)的分泌(唾液)抗体的量(数据以每毫升中IgA单位数表示)
实施例2的数据表明，当与非增殖流感病毒疫苗一起施用到小鼠鼻腔中时，新的非增殖佐剂制剂(在本例中是微粒产物)提高抗流感疫苗抗原的分泌抗体(IgA)的产生。实施例3
表3单独用疫苗或者使用混合有实验佐剂的相同疫苗对小鼠经鼻免疫之后，抗全流感病毒疫苗(＝全INV)的分泌(唾液)抗体的量(数据以每毫升中IgA单位数表示)
实施例3的数据表明，新的非增殖佐剂制剂提高亦对抗共同施用到小鼠鼻腔中的全流感病毒疫苗中的抗原的分泌抗体(IgA)的产生。
实施例4
表4新的粘膜佐剂对流感病毒抗原“引发”小鼠脾中T-细胞对随后接触相同抗原作出应答的能力的作用。以鼻用喷雾剂施用流感疫苗(＝INV)，单独施用或者与25，75和150微克的新佐剂共同施用。三星期之后，通过增殖率在体外测定脾T-细胞对相同流感疫苗作出应答的能力，以放射性胸苷掺入核酸中的掺入率(cpm)表示。
实施例4的数据表明当实验微粒佐剂制剂和非增殖流感疫苗一起施用至小鼠鼻腔中时，佐剂制剂增强脾中T-细胞当随后接触相同的流感疫苗时发生增殖的能力。这证明新佐剂制剂确实是对施用至粘膜表面上的抗原的抗原特异性T-细胞应答的粘膜佐剂。
实施例5
表53周之前用没有佐剂(对照)和有75微克新佐剂(实验疫苗)的鼻流感疫苗接种过的小鼠中脾T-细胞的增殖应答。用0.8微克/毫升流感病毒疫苗或0.8微克佐剂体外刺激T-细胞。以放射性胸苷掺入到核酸中的率(cpm)测定应答。
实施例5中的数据证明粘膜佐剂制剂不引发脾T-细胞对随后接触相同的佐剂作出响应，说明新粘膜佐剂制剂不作为对T-细胞的抗原起作用。通过比较，T-细胞被引发对随后接触疫苗中的流感病毒抗原发生应答，而新的非复制粘膜佐剂制剂大大增强这种引发作用，证实其作为粘膜疫苗制剂中的佐剂的效力。
实施例6
表6反复经鼻施用没有佐剂(对照疫苗)或者混合有新佐剂(75微克/毫升)(实验疫苗)的全流感疫苗(25微克/毫升)对小鼠产生抗流感病毒分泌(唾液)抗体作用。在实验开始时(第0，1，2，3周)，然后在第8，9，10和11周，然后在第16，17，18和19周，以一周间隔分别对小鼠经鼻接种4次。4，8，12，16和20周后收集唾液并且分析抗-INVIgA含量(数据以U/ml表示)。
实施例6中的数据表明新微粒佐剂产物不诱导对流感病毒抗原的耐受性，而且该粘膜佐剂对分泌IgA产生的作用持续至少20周(其间将抗原反复施用到鼻腔内粘膜表面上)。
实施例7
表7反复经鼻施用没有佐剂(对照疫苗)或者混合有新佐剂(75微克/毫升)(实验疫苗)的全流感疫苗(25微克/毫升)对小鼠产生抗流感病毒血清抗体的作用。在实验开始时(第0，1，2，3周)，然后在第8，9，10和11周，然后在第16，17，18和19周，以一周间隔分别对小鼠鼻内接种4次。4，8，12，16和20周后收集血样并且分析抗-INVIgG含量(数据以kU/ml表示)。
实施例7中的数据表明，新粘膜佐剂(在本例中为微粒产物)不诱导对流感病毒抗原的耐受性，而且该粘膜佐剂对血清IgG产生的作用持续至少20周(其间将抗原反复施用到鼻腔内粘膜表面上)。上面的实施例给出由实验得出的代表性结果，其支持下面提出的权利要求书。使用这里描述的全部四种佐剂制剂获得相一致的结果，但是数据不同。
其它实施例
上述实施例证明，β-1，3β-1，6-葡聚糖产物，当与粘膜表面接触时，诱导对这样的体内功能的作用，所述体内功能如产生抗病毒疫苗抗原的特异性抗体和抗原特异性引发脾T-细胞。使用粘膜疫苗中的细菌抗原，特别是脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)和百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)，也获得了一致的结果。
此外，这里第一次报道，当施用到粘膜表面上时，相同的产物还引起炎症和变态反应显著而明显的减轻。这是对增强非特异性免疫的产物的显然矛盾的反应，因此是非预期的发现。


本发明公开了粘膜疫苗的佐剂，其调节包括与粘膜体表面接触的疫苗抗原在内的物质的作用。