专利名称：粘膜疫苗的制作方法在专利文献I及2中，详细记载了与现有的钝化疫苗及类毒素等中的缺点、粘膜疫苗及免疫佐剂的开发有关的现状等。 如这些专利文献1、2中记载所述，广泛且深刻地认识到用在作为病毒的自然感染途径的粘膜中诱导IgA抗体产生的粘膜疫苗来代替向皮下、肌肉内等接种的现有疫苗的必要性。特别是作为21世纪的下一代疫苗，全世界均期待诱导IgA抗体的产生、局部免疫或粘膜免疫的所谓粘膜疫苗的开发和实用化，但尚未实现。本申请发明人等对于这样的课题，发明了由作为肺表面活性蛋白质B及/或肺表面活性蛋白质C与脂质的复合体的抗原药物(AD)载体(vehicle)和由该AD载体和抗原构成的粘膜疫苗，并提出了专利申请(专利文献I)。进而，本申请发明人等发现通过调节AD载体量(V)和抗原量㈧的重量比V/A，可以转换IgA抗体的选择性产生和IgA · IgG两抗体产生，并提出了以此为作用机制的粘膜疫苗的专利申请(专利文献2)。另外，专利文献1、2也公开了肺表面活性蛋白质B及C的片段(肽)的有效性。进而，本申请发明人等对肺表面活性蛋白质片段的各种变异体研究了抗体产生增强作用，结果发明了以合成肽KnLm(其中，η为4_8，m为11-20)为成分的AD载体和包含该AD载体和抗原的粘膜疫苗并提出了专利申请(专利文献3)，所述合成肽虽然为比专利文献1、2所公开的部分肽小的肽，但具有抗体产生的强诱导或者增强作用，特别是具有分泌型IgA抗体的单独产生、以及分泌型IgA和血中IgG两种抗体产生的优异且有效的诱导作用。另外，对采用与粘膜疫苗相同的给药经路的滴鼻剂而言，为了提高其粘度并持续发挥对于花粉症或过敏的效能，广泛使用有羧基乙烯基聚合物(CVP) (Carboxyvinylpolymer)或羟丙基纤维素(HPC)，另外，使用有以海藻酸钠为代表的增稠凝胶化剂。例如也已知有含有HPC的粘膜疫苗(专利文献4)及含有CVP的粘膜应用型疫苗制剂(专利文献5)及鼻腔内喷雾给药用流感疫苗(专利文献6)等。另外，在专利文献7中公开有一种由抗原、佐剂[特别是Poly (1.C.)]及增稠剂(海藻酸钠等)构成的粘膜给药用的疫苗。专利文献1:国际公开W02005/097182号公报专利文献2 :国际公开W02007/018152号公报专利文献3 :国际公开W02009/123119号公报专利文献4 :日本特开2008-231343号公报专利文献5 :国际公开W001/017556号公报专利文献6 :日本特开平03-38529号公报专利文献7 :日本特开2009-209086号公报发明内容发明要解决的课题专利文献3的粘膜疫苗具有强抗体产生能力，但作为粘膜疫苗的共通的问题点，具有需要比经皮注射疫苗更多的抗原。为了进行有效的疫苗治疗，相对于作为其目标的传染病的流行范围，需要充分量的疫苗，在鉴于现状的抗原生产量规模的情况下，粘膜疫苗增产很困难。因此，要求对粘膜疫苗赋予更强的抗体产生能力。本申请发明的课题在于提供一种改良型粘膜疫苗，所述改良型粘膜疫苗与专利文献3中记载的粘膜疫苗相比具有更强的抗体产生能力，作为其结果，能够以与经皮注射疫苗相匹敌那样的少量的抗原发挥优异的效果。用于解决课题的手段作为进一步增强专利文献3的粘膜疫苗的抗体诱导的方法，本申请发明人等从滴 鼻剂或粘膜应用型疫苗中使用的凝胶化剂(CVP、HPC)中，试验了作用于AD载体，增加运送至抗原呈递细胞的抗原量并对粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的诱导效果，确认了以下内容。(I)与专利文献3的粘膜疫苗(抗原+合成肽+脂质)或专利文献5、6的粘膜疫苗(抗原+CVP)相比，由包含“抗原+合成肽+脂质+CVP”的粘膜疫苗具有特别优异的抗体诱导能力，其效果大大超过由专利文献3 (抗原+合成肽+脂质)和专利文献5、6 (抗原+CVP)的简单的组合所预测的范围。(2)与CVP同样地作为滴鼻剂或粘膜疫苗的凝胶化剂被广泛报告的HPC赋形剂在与抗原并用或者与抗原并用于AD载体的情况下，完全不具有抗体诱导能力，也无法期待诱导粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的效果。(3)即使将抗原量减少至专利文献3的粘膜疫苗(抗原+合成肽+脂质)的需要量的约1/5以下，“抗原+合成肽+脂质+CVP”的粘膜疫苗仍然具有特别强的抗体诱导效果。本发明是基于以上的新见解而完成的。S卩，本发明为一种粘膜疫苗，其特征在于，含有以下的组成(a)包含合成肽和脂质的AD载体，所述合成肽包含KnLm(其中，η为4_8，m为11-20)的氨基酸序列；(b)羧基乙烯基聚合物；及(C)抗原蛋白，所述抗原蛋白为单独不会产生引起有效的感染防御效果的量的粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的量，所述粘膜疫苗产生引起有效的感染防御效果的量的抗原特异性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG。在本发明的粘膜疫苗中，其中，抗原蛋白(C)为即使进一步利用与AD载体(a)的组合或与羧基乙烯基聚合物(b)的组合也不会产生引起有效的感染防御效果的量的抗原特异性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的量。在该粘膜疫苗中的一形态中，所述合成肽为包含序列编号I或2的氨基酸序列的肽。另外，在该粘膜疫苗中的其它的方式中，脂质为卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、月桂酸、肉豆蘧酸、棕榈酸、硬脂酸及油酸中的至少一种。进一步具体而言，脂质为二棕榈酰磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油及棕榈酸的三种脂质混合物。在该粘膜疫苗中的又一方式中，抗原包括源自病原体的钝化抗原、纯化抗原、部分纯化抗原、重组抗原或无毒化毒素、成为过敏原因的过敏原。进而，本发明为一种粘膜疫苗的制造方法，所述粘膜疫苗含有以下的组成(a)包含合成肽和脂质的AD载体，所述合成肽包含KnLm(其中，η为4_8，m为11-20)的氨基酸序列；(b)羧基乙烯基聚合物；及(C)抗原蛋白，所述抗原蛋白为单独不会产生引起有效的免疫诱导的量的粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的量，所述粘膜疫苗产生引起有效的免疫诱导和感染防御效果的量的抗原特异性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG， 所述方法的特征在于，(I)将所述(a)及(C)悬浮在水中，(2)将加温和搅拌重复I次以上，(3)进行冷冻干燥，(4)将冷冻干燥体悬浮在生理盐水中并制备成规定浓度，(5)加入所述(b)的溶液。在本发明中，所谓“引起有效的免疫诱导的量的粘膜免免疫IgA及血中免疫IgG”例如为血液的病毒感染抑制效果HI值为国际评价基准以上那样的量的IgA及IgG。需要说明的是，在以下的说明中，有时将包含合成肽和脂质的组合物记为“AD载体”，将包含该AD载体和所述抗原的组合物记为“粘膜疫苗”。这些“AD载体”及“粘膜疫苗”与专利文献3中所公开的载体及疫苗的实施性相同。进而，有时将在该粘膜疫苗中添加了CVP的组合物记为“CVP添加粘膜疫苗”。另外，对本申请发明而言，关于所述的“脂质”，含有专利文献1-3的公开内容，关于“合成肽”及“AD载体”，含有专利文献3的公开内容。发明效果本申请发明的CVP添加粘膜疫苗具有疫苗抗原特异性IgA及IgG抗体的极强的诱导效果和远远超过所诱导的抗体的国际基准的强病毒感染抑制效果(HI效果)。即使与专利文献3中记载的粘膜疫苗或者“抗原+CVP疫苗”(专利文献5、6)相比，这些效果也极其显著，为无法由专利文献3的粘膜疫苗效果和专利文献5、6的CVP效果预测的优良效果。由于这样的强抗体诱导能力，可通过含有比现有的粘膜疫苗更少量的抗原来实现需要的感染防御效果。即，本申请发明的CVP添加粘膜疫苗即使将抗原量减少至现有的粘膜疫苗(抗原+合成肽+脂质)中使用的抗原量的1/5以下，也显示特别强的抗体诱导效果。例如如试验例2所示，专利文献3的粘膜疫苗在将流感抗原用作抗原的情况下，即使抗原量为O. 2 μ g，血液的病毒感染抑制效果HI也未达到流感疫苗的国际评价基准即HI =40，但本发明的CVP添加粘膜疫苗中的抗原量即使为O.1 μ g，进而为O. 03 μ g，也显示HI值为100以上这样的优异的病毒感染抑制效果。进而，本申请发明的CVP添加粘膜疫苗的组合物(AD载体、CVP)本身没有抗原识别细胞刺激效果，因此，引起由给药的疫苗抗原之外的抗原导致的意外的副作用，例如自体免疫性疾病、疫苗接种后的过敏恶化等的可能性极低。另外，根据本发明的粘膜疫苗制造方法，可以制造一种具有更高的抗原特异性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG产生能力的粘膜疫苗。
图1为试验I的结果即将实施例1、比较例1-5的各疫苗、HA抗原分别对小鼠经鼻给药时的鼻清洗液IgA量(左)和血清IgG量(右)；图2为试验I的结果即将实施例1、比较例1、5的各疫苗、HA抗原及作为比较对象的HA+AD载体分别对小鼠经鼻给药时的抗流感病毒HA抗体所显示的HI效价；图3为在试验2中，用内毒素(LPS)、poly(1.C.)和SF-1O (CVP+AD载体)分别刺激抗原递呈树状细胞并对细胞膜的活化表示分子(MHC I1、⑶40、⑶80(B7-1)及⑶86(B7_2))的表达水平进行测定的结果。左图表示各膜分子的表达量增加而判定为阳性的细胞(超过右侧的点图表中由用作对照的生理盐水处理而确定的中央附近的阴性值上限显示条的值的细胞)的总细胞数中的比例(％)，右图为利用流式细胞仪的测定结果对细胞膜上的活化 表示分子的量进行可视化定量的图；图4为试验4的结果，表示感染的流感病毒PFU量和生存率的关系；图5为试验4的结果，表示对小鼠(各组10只)经鼻给药实施例1、实施例5、比较例5及比较例6的各疫苗后，感染50PFU的流感病毒时的生存率的变化；图6为试验4的结果，表示对小鼠(各组10只)经鼻给药实施例1、实施例5、比较例5及比较例6的各疫苗后，感染800PFU的流感病毒时的生存率的变化；图7为表示试验6结果的透射型电子显微镜照片。㈧为比较例I的粘膜疫苗，(B)为实施例1的CVP添加粘膜疫苗和其部分扩大图(右图)；图8为在试验7中，利用流式细胞仪对由树状细胞检测的荧光标记抗原量进行测定的结果。将用单独给药HA抗原时在树状细胞中检测的抗原荧光标记量设为I时，以各自的测定条件下促进荧光标记量的倍数作为纵轴，以“Fold versus HA” =[测定各样品时的MFI]/[单独添加HA的树状细胞的MFI]的形式进行表示。MF1:平均荧光强度** p< O. Olvs. HA(n = 3)；图9为在试验8中，用poly (1. C. )、SF-1O (CVP+AD载体)分别刺激抗原递呈树状细胞并对细胞膜的活化表示分子(CD86)的表达水平进行测定的结果。□为无HA抗原蛋白，■为有HA抗原蛋白的结果。MF1:平均荧光强度，* p < O. 05vs.仅佐剂(Adjuvant alone)(η = 3)；图10为在试验9中，在抗原存在下及不存在下对小鼠经鼻给药SF-1O (CVP+AD载体)佐剂并对由鼻腔组织制备的树状细胞的CD86表达水平进行测定的结果。MF1:平均荧光强度。

序列编号I (K6L 16) KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLL序列编号2 (K6L11) KKKKKKLLLLLLLLLLL序列编号I (K6L16)由N端侧的6个K(Lys)残基和C端侧的16个L残基构成,序列编号2(K6L11)由N端侧的6个K(Lys)残基和C端侧的11个L残基构成。这些合成肽使用依据公知的化学合成法所制备的纯度95%以上的材料。MM作为磷脂质，优选使用肺表面活性物质含有的磷脂质，例如卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油等。另外，可以使用磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸及鞘磷脂等。另外，作为脂肪酸，可以使用月桂酸、肉豆蘧酸、棕榈酸、硬脂酸、棕榈油酸及油酸等。进而可以使用源自肺的膨胀活跃的鲸、海豚等水生动物的脂质。 羧某乙烯某聚合物(CVP)
CVP为以丙烯酸作为主要成分进行聚合而得到的亲水性聚合物，可以使用HIVISffAKO 103, HIVISffAKO 104, HIVISffAKO 105、Sigma 公司制 pAA130 (Sigma, St. Louis,MO, CatNo. 181293)、pAA450 (Sigma, CatNo. 181285)、pAA1250 (Sigma, CatNo. 306215)等市售品。其中，优选化妆品及医药品用凝胶的制作中所通用的HIVISWAKO 104、Sigma公司制pAA130、pAA1250。可以用纯水或者生理盐水在超声波处理下将CVP制作0. 2-2. O重量％溶解液后，用NaOH中和液进行pH 5. 0-10. 5的制作，但优选选择不会影响疫苗抗原的稳定性的pH。例如在流感裂解疫苗抗原的情况下，pH被调节为6. 8-8. 0，优选pH为7. 0-7. 2。技厘抗原含有用于疫苗的经高度纯化的纯度为约90%以上的源自细菌的抗原、病毒抗原、类毒素等蛋白质、糖蛋白质、过敏原、高分子糖质及核酸等抗原分子。例如为水痘病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、流感病毒、腺病毒、疱疹病毒、严重急性呼吸综合征(SARS)病毒、西尼罗病毒、汉坦病毒、登革病毒、日本脑炎病毒、黄热病毒、蜱传脑炎病毒、HIV病毒、C型肝炎病毒、百日咳菌、脑膜炎菌、流感b型菌、肺炎菌、霍乱弧菌、疟疾病原体、昏睡病病原体等的疫苗用的抗原。这些抗原制备即使其单独、特别是与AD载体(a)或与羧基乙烯基聚合物(CVP)组合也不会产生引起有效的免疫诱导的量的抗原特异性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的量进行使用。另外，在流感抗原蛋白的情况下，除HA抗原分子以外，含有M蛋白、神经氨酸酶及核蛋白等。在以下的说明中，抗原蛋白量是指含有这些抗原分子的蛋白质总量。对使用的批量流感疫苗而言，HA抗原分子自身的量为抗原总蛋白量的约50 %。接着，对由这些材料制备AD载体及CVP添加粘膜疫苗的方法进行说明。AD载体的制备以任意比例混合上述脂质中的几种，作为脂质量，例如以成为10mg/mL的浓度的方式悬浮于氯仿甲醇(2 : l(v/v))混合液，作为脂质成分。另外，合成肽以浓度为例如5. 0mg/mL的方式溶解于乙醇。接着，混合该脂质成分和合成肽。对混合比而言，合成肽为约0. 2 约12. O干燥重量％，脂质为约88 约99. 8干燥重量％。使用旋转蒸发器将该混合物在约40°C下进行干固，以任意浓度再悬浮于10%乙醇，在约45°C的水浴中振荡混合15分钟左右，制备均匀分散液并冷冻干燥。将该干燥物在约_30°C下保存，每次在使用时加入纯水或生理盐水使其悬浮后，使用超声波、均化器、混合器、振荡仪等制成均匀分散液。CVP添加粘膜疫苗的制备以任意比例混合上述AD载体、CVP及抗原。即，在流感疫苗的情况下，以使AD载体量(V)相对于疫苗中的抗原蛋白量(A)的干燥重量比V/A为期望的值的方式在疫苗原液中添加混合AD载体液进行制备。对每只小鼠给药的抗原蛋白的干燥重量(A)为约0.01 约10 μ g/kg体重，优选为约O. 03 约5. O μ g/Kg体重。该抗原量为专利文献3的粘膜疫苗(抗原+AD载体)中的抗原量(约O.1 50 μ g/kg体重，优选为约O. 3 30 μ g/Kg体重)的1/5以下。在这样的抗原量中，用于优先且选择性地诱导IgA抗体产生的V/A优选为约O.1 约1. O。另外，用于诱导IgA及IgG两种抗体产生的V/A为约1. O 约100，优选采用约5 约20的范围。在如上所述的V/A中，抗原的约60%以上与AD载体结合，由此得到的粘膜免疫疫苗可有效地诱导IgA抗体产生及/或IgG抗体产生。另外，加入了 CVP的最终经鼻给药疫苗液中的CVP浓度为约O. 1% 1. 0%，优选以O. 3 % O. 8 %的比例添加。另外，为了均匀地混合AD载体、抗原及CVP，可以使用均化器、混合器、振荡仪及搅拌器等。具体而言，如下述实施例1所示，可以如下制备CVP添加粘膜疫苗在混合抗原蛋白和AD载体后，进行3分钟超声波处理，进一步在室温下旋转混合2小时后，最后加入等量的I % CVP生理盐水溶液。除了添加CVP之外，该方法与专利文献3中记载的方法相同。但是，该方法存在如下不良情况有时由于超声波处理产生的发热使病毒抗原失活；有时由于使用机器和材料的种类、振荡器的大小、振荡器的状态等，超声波处理行程难以保持一定的条件。因此，优选由实施例7所示那样的以下工序构成的制造方法。(I)将AD载体和抗原蛋白悬浮在水(纯水)中(2)将加温和搅拌重复I次以上(3)冷冻干燥(4)将冷冻干燥体悬浮在生理盐水中并制备成规定浓度(5)添加溶解在生理盐水中的CVP溶液该方法不仅解决了由超声波处理引起的上述问题点，而且如后述试验5中所示那样可以更高地产生抗原特异性的IgA及IgG，是优异的方法。制备的CVP添加粘膜疫苗也可以以一次给药使用，但优选以二次给药(初次免疫和二次免疫)或三次给药(初次免疫、二次免疫、三次免疫)的形式使用。通过这样的多次免疫处置，可以显著地增加IgA及IgG的抗体效价。另外，二次或三次疫苗给药以I周 3周，优选以约2周的间隔进行。进而，本申请发明的CVP添加粘膜疫苗的给药路径除鼻腔之夕卜，也可以对口腔内或阴道给药(例如Lubrizol Pharmaceutical Bulletin,Polymers forPharmaceutical Applications, Lubrizol Advanced Materials, Inc.2008)。以下，示出实施例对本申请发明进行更详细且具体的说明，但本申请发明并不限定于以下的例子。实施例1[包含超声波处理的制造工序]
首先，如下制备AD载体。以75 : 25 : 10 (w/w/w)的比例混合二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰甘油(PG)及棕榈酸(PA)，以磷脂质量计为10mg/ml的浓度的方式悬浊于氯仿甲醇(2 : l(v/v))混合液，作为脂质成分。另外，将纯度95%以上的合成肽K6L16 (KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLL) (GenScript 公司制)以成为 5. Omg/mL 的方式溶解在甲醇中。以重量比计磷脂质成分K6L16= 100 2的方式混合脂质成分(DPPC PG PA =75 : 25 : 10，w/w/w)溶液和K6L16肽溶液，使用旋转蒸发器在40°C下进行干固。将其以磷脂质量计为4mg/mL的方式再悬浮于10%乙醇，在45°C的水浴中振荡混合15分钟，制备均匀分散液。对其进行冷冻干燥并作为AD载体在_30°C下进行保存。接着，使用上述AD载体如下制备CVP添加粘膜疫苗。冷冻干燥后的AD载体必须悬浮在生理盐水中使用。流感疫苗(HA)抗原使用由 阪大微生物病研究会提供的A/NewCaledonia/20/99 (HlNl)、1. 94mg蛋白质/mL(磷酸钠缓冲液、氯化钠、乙基汞硫代水杨酸钠溶液=ImL中溶解磷酸氢钠水合物3. 53mg、磷酸二氢钠O. 54mg、氯化钠8. 50mg及乙基汞硫代水杨酸钠O. 008mg)。对疫苗和AD载体的混合量而言，以AD载体溶液的磷脂质量(V)相对于抗原溶液的蛋白量㈧的量比V/A = 10的方式进行混合，以30秒的间隔对超声波处理重复三次开启关闭，进行由合计90秒的开启和90秒的关闭构成的合计3分钟的超声波处理(model S_250D、Branson Ultrasonics Danbury),进一步在室温下旋转混合2小时后，溶解在生理盐水中，以最终浓度为O. 5%的方式加入调节成中性的I % CVP (HIVISWAKO 104)。即，对每只小鼠单鼻孔给药2 μ L进行两鼻孔给药合计4 μ L，该4 μ L中所含组成为流感疫苗(HA)抗原蛋白量/AD载体溶液的磷脂质量/CVP重量=0. 2 μ g/2. O μ g/20 μ go另夕卜，该CVP添加粘膜疫苗的pH设为维持HA抗原蛋白的抗原性的范围(7. 0-7. 2)。以下，将该CVP添加粘膜疫苗记为“HA+SF-10”。另外，如上所述，SF-10量为AD载体(2. Oyg)+CVPQOyg) = 22 μ g，但在下述说明中，用作为佐剂的载体作用的基本骨架的AD载体的磷脂质量进行表记，记为SF-10(2. 0μ g)。其它的实施例中的SF-10量也用除CVP量以外的值进行记载。实施例2根据实施例1的方法制备HA抗原蛋白量为0.1 μ g的CVP添加粘膜疫苗。HA抗原蛋白、AD载体及CVP的混合比与实施例1相同(即，含有抗原蛋白量10倍的AD载体和最终浓度0.5%的CVP)。实施例3根据实施例1的方法制备HA抗原蛋白量为0. 03 μ g的CVP添加粘膜疫苗。HA抗原蛋白、AD载体及CVP的混合比与实施例1相同(即含有抗原蛋白量10倍的AD载体和最终浓度0.5%的CVP)。比较例I制备专利文献3的粘膜疫苗(HA+AD载体)。HA抗原蛋白及AD载体使用与实施例1相同的物质，根据实施例1制备疫苗。HA抗原蛋白量为0.2 μ g，AD载体量为2.0. μ g。比较例2
制备专利文献5、6中所公开的粘膜疫苗(HA+CVP)。HA抗原蛋白及CVP使用与实施例I相同的物质，根据实施例1制备疫苗。HA抗原蛋白量为O. 2 μ g，CVP为最终浓度O. 5 %。比较例3制备专利文献4中所公开的粘膜疫苗(HA+HPC)。HA抗原蛋白使用与实施例1相同的物质，HPC使用市售的HPC 6. 0-10. O (和光纯药)。根据实施例1制备疫苗。HA抗原蛋白量为O. 2 μ g，HPC量为20 μ g。比较例4·制备在专利文献3的HA+AD载体中进一步添加了 HPC的粘膜疫苗(HA+AD载体+HPC)。HA+AD载体使用与比较例I相同的物质，HPC使用与比较例3相同的物质，根据实施例I制备疫苗。HA抗原蛋白量为O. 2 μ g，AD载体量为2. O μ g，HPC量为20 μ g。比较例5根据文献((Asah1-OzakiY et al. , Microbes Infect 2006;8:2706-2714，Ichinohe T，et al.，J Virol 2005 ；79(5) :2910-2919)中记载的方法制备含有树状细胞的Toll样受体(TLR)的配合基、即强烈刺激抗原呈递细胞而促进抗体产生的poly(1.C.)(Alexis Corp)的粘膜疫苗(HA+poly (1. C.))。HA 抗原蛋白量为 0. 2 μ g，poly (1. C.)量为2 μ g0比较例6用生理盐水稀释HA抗原并将其用作疫苗。每只的HA抗原蛋白给药量为0. 2 μ g。[试验I]使用小鼠，对经鼻粘膜疫苗的抗体产生增强作用进行试验。1.粘膜疫苗· HA+SF-10 (实施例1)· HA+AD载体(比较例I)· HA+CVP (比较例 2)· HA+HPC (比较例 3)· HA+AD 载体 +HPC (比较例 4)· HA+poly (1. C.)(比较例 5)· HA单独(比较例6)2.动物从日本SLC株式会社(日本静冈)购入6-8周龄的雌BALB/c雌小鼠后使用。全部的动物实验由德岛大学医学部实验动物中心的感染动物舍(P2水平)进行，按照德岛大学医学部动物实验委员会的操作规则来进行。3.免疫法在疫苗的经鼻给药中，将上述I的5种粘膜疫苗以单鼻孔2μ L进行两侧给药，将合计4μ L的疫苗向用氯胺酮(62. 6mg/Kg)及甲苯噻嗪(12. 4mg/Kg)麻醉的小鼠的两侧鼻腔点鼻给药。对照使用与疫苗液等量的生理盐水给药组及比较例6 (HA抗原蛋白单独给药组)。各组由9_10只小鼠构成。免疫对于初次免疫后第二周的由同样的组成构成的样品，对各组作为2次免疫进行等量经鼻给药。在二次免疫后在第二周通过同样的方法进行三次免疫，然后，在第二周采集样品。另外，疫苗给药合计进行三次，但即使以二次免疫结束也可得到基本相同的结果。4.小鼠鼻腔·肺泡清洗液及血清的制备制备三次免疫后第二周的小鼠的鼻腔·肺泡清洗液及血清并对病毒HA抗原特异性的 IgA、IgG进行测定。根据文献(Mizuno D, Ide-Kurihara M, Ichinomiya T,Kubo I,KidoH. Modified pulmonary surfactant is a potentadjuvant that stimulates the mucosalIgA production in response to the influenza virus antigen. J Tmmunol.2006 ； 176 1122-30)记载的方法如下进行。在戊巴比妥麻醉下对疫苗给药小鼠进行剖腹剖胸，切开气管，向肺插入Atom静脉导管带节3Fr(Atom Medical株式会社日本 东京)，注入生理盐水ImL,回收该液体。对其反复采液三次，将得到的液体计3mL用作肺泡清洗液。在采取肺清洗液后，从切开后的气管向鼻腔方向插入Atom静脉导管，注入ImL的生理盐水，对从鼻子流出的液体进行采液。将该液体用作鼻清洗液。进而对心脏采血，通过5，OOOrpmUO分钟的离心分离制备血清。 5.抗流感抗体的定量依据上述文献(MizunoD, et al. J Immunol. 2006 ; 176 :1122-30)的记载并通过ELISA分析对鼻腔、肺泡清洗液及血清中的抗流感IgA、IgG含量进行定量。ELISA分析按照BETHYL LABORATORIES公司(美国德克萨斯)的小鼠ELISA定量试剂盒的方法来进行。在 96 孔 Nunc-1mmuno plate (免疫板)(Nalgen Nunc International美国纽约)各孔中加入疫苗I μ g、牛血清白蛋白(BSA，SIGMA美国密苏里)lyg/mL PBS溶液100 μ L，在4°C下进行一晚固层化反应。然后，用清洗液(50mM Tris, O. 14M NaCl, O. 05%Tween 20，ρΗ8· O)清洗三次，除去疫苗液。在各孔中加入含有O. 15Μ NaClU % BSA的50mMTris-HCl缓冲液(pH 8. O) 200 μ L，在室温下进行I小时的封闭反应。用清洗液对各孔冲洗三次后，添加以样品结合缓冲液(50mM Tris,O. 15M NaCl, I % BSA, O. 05% Tween 20，pH8. O)适量稀释了的鼻清洗液 肺清洗液或血清ΙΟΟμ L，在室温下反应2小时。将羊抗小鼠IgA或IgG-辣根过氧化物酶(HRP) (BETHYL LABORATORIES INC.)用作二次抗体，使用TMBMicrowell Peroxidase Substrate System(Kirkegaard&Perry Laboratories, Inc.美国马里兰州)进行显色反应。在各孔中添加100 μ L 2Μ H2SO4 (和光纯药株式会社)，由此停止反应，用SPECTRAmax PLUS 384测定450nm的吸光度。作为用于定量的标准，使用对从上述肺清洗液纯化的抗流感IgA及IgGlOng进行同样操作而得到的吸光度。6.结果将抗流感HA抗体的诱导结果示于鼻清洗液中的IgA (左图1)及血液中的IgG (右图1)。另外，将各自的测定值示于表I。另外，图2及表2表示各试验组的HI效价。(I) HA抗原单独给药组(比较例6)的IgA量为24. 77ng/mL, IgG量为O. 54 μ g/mL,与此相对，在HA+SF-10 (实施例1)给药组中，IgA量为3307. 60ng/mL, IgG量为568. 75 μ g/mL，鼻清洗液中的IgA增强至132倍，血清中的IgG增强至1137倍。确认到本申请发明的CVP添加粘膜疫苗(HA+SF-10)具有极强的抗体诱导效果(图1、表I)。(2)对HA+SF-10 (实施例1)给药组中的抗体产生量而言，与HA+AD载体(比较例I)相比IgA为15. 6倍，IgG为150倍，与HA+CVP (比较例2)相比IgA为10. 7倍，IgG为115. 4倍(图1、表I)。HA+SF-10中的这样的显著优异的抗体诱导效果远远超过由专利文献3中公知的粘膜疫苗(HA+AD载体)和专利文献5、6中公知的CVP的单纯组合所预测的范围。(3) HA+HPC (比较例3)给药组的抗体产生量与HA单独给药组(比较例6)相同或在其以下。另外，HA+AD载体+HPC (比较例4)给药组的抗体产生量比HA+AD载体(比较例I)低(图1、表I)。由以上结果确认到与CVP同样地在滴鼻剂或粘膜疫苗中作为凝胶化剂众所周知的HPC在与抗原并用或与AD载体并用时不具有免疫诱导增强效果。因此可推断AD载体的佐剂效果的增强为不是以仅具有增稠效果的载体而是以AD载体特性为基础的其增强效果。(4)HA+SF_10(实施例1)给药组中的抗体产生量与HA+poly (1. C.)(比较例5)相t匕，鼻清洗液中的IgA为11. 4倍，血清中的IgG为2. 3倍(图1、表I)。由该结果确认到本申请发明的CVP添加粘膜疫苗(HA+SF-10)与通过强烈刺激抗原呈现细胞从而促进抗体产生的poly(1.C.)相比，具有更强免疫诱导效果。[表I] 抗体效价
热消洗液 IgA(ngZmL)Illi 丨gA(pg/mL)
mean S.D.1 S.E.1 I mean I S.D.1 S.E.1 生理盐水 7.45 4.79 1.51 0.06 0.14 0.04 HA24.77 25.83 8.17 0.54 0.48 0.15
HA+AD 载体 211.94 167.90 53.10 3.84 0.91 0.29r HA+HPC 8.82 4.96 1.65 1.51 1.12 0.37-------
HA+AD 载体 56.92 89.05 29.68 2.46 1,67 0.56
I HPP
HA+CVP 309.34 231.08 77.03 4.93 1.61 0.54 HA+SF-10 3307.6 882.55 294.18 568.75 95.18 31.73
0
HA+poiy([() 289.78 136.40 43.13 246.04 90.93 28.76(5)根据流感疫苗的国际评价基准，将血液的病毒感染抑制效果HI超过40的疫苗判定为有效，但在HA+AD载体(比较例I)中，超过HI = 40的样品为50%，以平均值计表示HI = 39。与此相对，在HA+SF-10(实施例1)中，全部例子的超过HI = 40，以平均值计表示HI = 213. 3的高值，另外，与HA+poly (1.C.)(比较例5)的HI = 137. O相比，显示1. 56倍的强病毒感染抑制效果(图2、表2)。[表2]HI 效价


本发明提供一种粘膜疫苗，其特征在于，含有以下的组成(a)包含合成肽和脂质的AD载体，所述合成肽包含KnLm的氨基酸序列，其中，n为4-8，m为11-20；(b)羧基乙烯基聚合物；及(c)抗原蛋白，所述抗原蛋白为单独不会产生引起有效的免疫诱导和感染防御效果的量的粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的量，所述粘膜疫苗产生引起有效的免疫诱导和感染防御效果的量的抗原特异性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG。本发明的粘膜疫苗与现有的粘膜疫苗相比，具有更强的抗体产生能力，作为其结果，能够以极少量的抗原发挥优异的效果。