专利名称：弗林蛋白酶敲减和gm-csf增强的(fang)癌症疫苗的制作方法在不限制本发明范围的前提下，结合基因修饰的全细胞癌症疫苗的开发来描述本发明的背景。更具体而言，本发明涉及能够通过GM-CSF转基因的表达增强肿瘤抗原表达、呈递和处理，以及通过弗林蛋白酶双功能shRNA转基因诱导的敲减来减弱分泌免疫抑制活性的疫苗。对于癌症疫苗的免疫耐受的流行假说包括肿瘤细胞的低免疫原性，缺乏专职抗原呈递细胞的合适呈递，抗原缺失变异体的免疫选择，肿瘤诱导的免疫抑制，和肿瘤诱导的隔·离部位。全癌细胞疫苗可潜在地引起针对明确和不明确的肿瘤抗原的广泛、多价的免疫应答，从而通过下调和/或选择抗原缺失变异体来解决肿瘤耐药性的可能性。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，通常缩写为GM-CSF，为巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、内皮细胞和成纤维细胞所分泌的蛋白。当整合为细胞因子转基因时，GM-CSF提高癌症疫苗肽，肿瘤细胞裂解物，或来自自体患者肿瘤细胞或确立的异基因肿瘤细胞系的全肿瘤细胞的呈递。GM-CSF诱导造血前体的分化并将其吸引至接种位点。GM-CSF也充当树突细胞成熟和活化过程的佐剂。然而，由肿瘤细胞产生和/或分泌的转化因子β (TGF-β )的不同同工型可抑制GM-CSF介导的免疫致敏。多功能蛋白的TGF-β家族具有众所周知的免疫抑制活性。三种已知的TGF-β配体(TGF-βΙ、β2和β 3)普遍存在于人类癌症中。TGF-β的过表达与肿瘤进展及不良预后相关。肿瘤微环境中TGF-β水平升高与无免疫性的肿瘤反应相关。TGF- β直接和间接抑制GM-CSF诱导的树突细胞的成熟及其表达II类MHC和共刺激分子。TGF-β对GM-CSF介导的免疫活化的负面影响支持在基于GM-CSF的癌细胞疫苗中消耗TGF-β分泌的依据。所有TGF-β成熟的同工型需要弗林蛋白酶介导的限制性蛋白酶切以获得适当活性。弗林蛋白酶是一种钙依赖性丝氨酸内切蛋白酶，为枯草杆菌蛋白酶样前蛋白转化酶家族的成员。弗林蛋白酶最为知名的是通过相应的免疫调节分支对TGF-β进行功能活化。除了前述的肿瘤分泌的TGF-β的免疫抑制活性，已发现T淋巴细胞中内源性表达的弗林蛋白酶的条件性缺失允许T细胞正常发育，但损坏调节和效应T细胞的功能，从而产生较少的TGF-β I0 T细胞表达的弗林蛋白酶表现为在维持外周耐受中不可缺少，这至少部分由于其在调节TGF-β I产生中具有非重复的必需的功能。已证明几乎在所有癌细胞系中均有高水平的弗林蛋白酶。发明人和其他人员发现人类结肠直肠癌，肺癌和黑色素瘤细胞产生高达10倍的较高水平的TGF-β 1，并可能较高幅度地影响免疫耐受状态。肿瘤细胞中弗林蛋白酶的存在很可能显著有助于维持肿瘤引导的TGF-β介导的外周免疫耐受。因此弗林蛋白酶敲减代表优化GM-CSF介导的免疫致敏的新颖并具吸引力的方法。干扰素-Y ( Y IFN)为重要的免疫调节细胞因子，其在宿主固有和适应性免疫应答和肿瘤控制中起关键作用。Y IFN也称为II型干扰素，为表达在多个水平上受到调节的单拷贝基因。Y IFN通过免疫相关基因的转录调节与各种不同系列的细胞程序相关。最初认为⑶4+辅助性T细胞I型(Thl)淋巴细胞，⑶8+细胞毒性的淋巴细胞，和NK细胞专有地产生YIFN。然而，现在有证据显示其它细胞，如B细胞，NKT细胞和专职性抗原呈递细胞(APC)分泌Y IFN。由局部作用的专职性APC[单核细胞/巨噬细胞，树突细胞(DC)]产生YIFN在细胞自活化及附近细胞的活化中可以是重要的。由NK细胞和可能的专职APC分泌Y IFN很可能在针对感染的早期宿主防御中起重要作用，而T淋巴细胞成为适应性免疫应答中Y IFN的主要来源。此外，已确定Y IFN在预防原发性和移植肿瘤的发展中的作用。YIFN产生受APC分泌的细胞因子控制，尤其是白细胞介素(IL)-12和IL-18。YlFN产生的负调节物包括IL-4、IL-10、糖皮质激素和TGF-β。 发明概述本发明还提供了自体(即患者特异性的)癌症疫苗组合物(FANG疫苗)，其包括治疗有效量的具有shRNA弗林蛋白酶/GMCSF表达载体的细胞。该载体包括编码GM-CSF的第一核酸，所述的GM-CSF其可以是人GM-CSF，和第二核酸插入物，其编码一个或多个短发夹RNA(shRNA)，所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物的区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。两个核酸插入物均可操作地连接于启动子。所述的shRNA可以是双功能的，同时包含(剪切依赖性)RISC (RNA诱导的沉默复合物)格式化siRNA和(非剪切依赖性的RISC格式化的)miRNA或miRNA样基序。在本发明的一个实施方案中，所述的shRNA为弗林蛋白酶表达的RISC剪切依赖性和RISC非剪切依赖性抑制剂。此外，所述表达载体可包含插入至第一和第二核酸插入物之间的小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽(skippeptide)，并且所述的启动子可以是包含增强子序列和内含子的CMV哺乳动物启动子。双功能shRNA所祀向的mRNA序列不限于编码序列；在一个实施方案中，shRNA可祀向弗林蛋白酶mRNA转录物的3’非翻译区域(3’ -UTR)序列，以及在一个实施方案中可同时靶向弗林蛋白酶mRNA转录物的编码序列和3’ -UTR序列。用于制备疫苗的细胞可为自体肿瘤细胞，但也可使用异种移植扩增的自体肿瘤细胞，异基因肿瘤细胞，异种移植扩增的异基因肿瘤细胞或其组合。给予患者的疫苗剂量包含Ix IO7个至2. 5x IO7个细胞。所述的FANG疫苗可与治疗有效量的Y IFN ( Y干扰素)联合给予。Y IFN的剂量范围可为50或100 μ g/m2。本发明描述了自体细胞疫苗组合物，其包括AishRNAiwiseiVGMCSF表达载体质粒和一种或多种任选的疫苗。所述载体质粒包括可操作地连接于启动子的第一核酸插入物和可操作地连接于启动子的第二核酸插入物，其中所述第一插入物编码粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的cDNA，以及其中所述第二插入物编码一个或多个短发夹RNA(shRNA),所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域,从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。在一个方面中，所述的GM-CSF为人的。在另一个方面中所述的shRNA包括siRNA (剪切依赖性RISC格式化的)和miRNA或miRNA样(非剪切依赖性的RISC格式化的)模体。如本文所述的shRNA可以是弗林蛋白酶表达的剪切依赖性RISC格式化和非剪切依赖性RISC格式化抑制剂，并进一步限定为双功能shRNA。在另一个方面中，将小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽插入至第一和第二核酸插入物之间。在再另一个方面中，所述启动子为包含CMV IE 5’UTR增强子序列和CMV IE内含子A的CMV哺乳动物启动子。在一个相关方面中CMV哺乳动物启动子。在其它方面中，shRNA所靶向的区域为弗林蛋白酶mRNA转录物的3，UTR区域序列，并且shRNA所靶向的区域为弗林蛋白酶mRNA转录物的编码区域。本发明提供了预防，治疗和/或减轻患者癌症症状的方法，其包括步骤确定需要预防，治疗和/或减轻癌症症状的患者，并给予自体细胞疫苗，所述自体细胞疫苗包含bishRNAiwsesVGMCSF表达载体质粒，其中所述载体质粒包括可操作地连接于启动子的第一核酸插入物，可操作地连接于启动子的第二核酸插入物和一种或多种任选的疫苗佐剂，其中所述第一插入物编码粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) cDNA，其中所述第二插入物编码一个或多个短发夹RNA(shRNA)，所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。该方法进一步包括步骤通过测量一个或多个癌细胞中的转化生长因子beta(TGF-beta或TGF-β )和GM-CSF的水平来监控治疗进展和根据TGF-β和GM-CSF的水平改变自体细胞疫苗的给予，其中TGF-β水平下降和GM-CSF水平升高表明治疗成功。按照本发明所述方法，TGF-β选自TGF-β I、TGF-P2或TGF-P3中至少一种。在一个方面中， 癌症选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、胆囊癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肝癌转移和尤因氏肉瘤以及来自患者的产生TGF-β的其他癌症。在另一个方面中，shRNA包含siRNA(剪切依赖性RISC格式化的)和miRNA或miRNA样(非剪切依赖性RISC格式化的)基序，并且shRNA为弗林蛋白酶表达的剪切依赖性RISC格式化和非剪切依赖性RISC格式化抑制齐U。在又一个方面中，将shRNA进一步限定为双功能shRNA。在另一个实施方案中，本发明公开了自体弗林蛋白酶敲减和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)增强(FANG)的癌症疫苗组合物，其包括bishRNA·$θι#/GMCSF表达载体质粒，其中所述载体质粒包括可操作地连接于启动子的第一核酸插入物，可操作地连接于启动子的第二核酸插入物和一种或多种任选的疫苗佐剂其中所述第一插入物编码GM-CSF cDNA，以及其中所述第二插入物编码一个或多个短发夹RNA (shRNA)，所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。本发明所述组合物用于预防，治疗和/或减轻癌症症状，其中所述癌症选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、胆囊癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肝癌转移和尤因氏肉瘤以及来自患者的产生TGF- β的其他癌症。在又一个实施方案中，本发明为通过给予弗林蛋白酶敲减和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)增强(FANG)的癌症疫苗来治疗、预防和/或减轻患者的非小细胞肺癌(NSCLC)症状的方法，其包括步骤确定需要预防，治疗和/或减轻NSCLC症状的患者，和给予FANG疫苗，所述FANG疫苗包括MshRNAiwiseiVGMCSF表达载体质粒，其中所述载体质粒包括可操作地连接于启动子的第一核酸插入物，可操作地连接于启动子的第二核酸插入物和一种或多种任选的疫苗佐剂，其中所述第一插入物编码GM-CSFcDNA，以及其中所述第二插入物编码一个或多个短发夹RNA (shRNA)，所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域,从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。本发明所述方法进一步包括步骤通过测量一个或多个NSCLC细胞中的转化生长因子β (TGF-beta或TGF-β )和GM-CSF的水平来监控治疗进展和根据TGF-β和GM-CSF的水平改变自体细胞疫苗的给予，其中TGF-β水平下降和GM-CSF水平升高表明治疗成功。在本发明的一个方面中，TGF-β选自TGF- β I、TGF- β 2或TGF- β 3中的至少一种。在又一个实施方案中，本发明描述了制备弗林蛋白酶敲减和粒细胞巨噬细胞聚落刺激因子(GM-CSF)增强(FANG)的癌症疫苗，其包括步骤(i)从患者中无菌采集一个或多个癌细胞，(ii)将所采集的细胞置于无菌容器中的抗生素溶液中，(iii)由所采集的溶液形成细胞悬浮液，其中细胞形成(iv)悬浮液通过酶分解，机械解聚或两者来实现，(V)通过对细胞悬浮液进行电穿孔而对细胞进行基因修饰，以制备具有MshRNAiwiseieAMCSF表达载体质粒的疫苗，其中所述载体质粒包括可操作地连接于启动子的第一核酸插入物和可操作地连接于启动子的第二核酸插入物，其中所述第一插入物编码GM-CSF cDNA,以及其中所述第二插入物编码一个或多个短发夹RNA (shRNA)，所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域,从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达，(vi)收获该疫苗，(vii)辐照该疫苗和(vii)冷冻该疫苗。在该方法的一个方面中，一个或多个癌细胞采集自患有癌症的患者，所述癌 症选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、胆囊癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肝癌转移和尤因氏肉瘤以及来自患者的产生TGF-β的其他癌症。在另一个方面中，通过辐照使基因修饰的细胞无法增殖。在又一个方面中，基因修饰的细胞为自体、异基因或异种移植扩增细胞。在一个方面中，异基因细胞为确立细胞系。在另一个方面中，将基因修饰的细胞每月给予受试者一次，剂量可达12次，其中给予受试者的基因修饰细胞的剂量为Ix IO7个细胞/次注射至5x IO7个细胞/次注射，并且基因修饰细胞的给予是与另一种治疗剂联合治疗的部分。在再另一个方面中，用于联合治疗的另一种治疗药物为YIFN，其中在联合治疗中给予受试者的Y IFN的剂量为50或100 μ g/m2。本发明的方法进一步包括转染后使用YIFN温育基因修饰的细胞的步骤，其中转染后施加于基因修饰的细胞的Y IFN的剂量为250U/ml (500U/ml 施加 24 小时至 100U/ml 施加 48 小时)。本发明的另一个实施方案为通过敲减弗林蛋白酶来抑制转化生长因子β(TGF-β )表达的siRNA介导的方法。该方法包括选择靶细胞并使用表达载体转染该靶细胞的步骤，所述的表达载体包括启动子以及可操作地连接于该启动子的核酸插入物。该插入物编码一个或多个短发夹RNA (shRNA)，所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。shRNA可为双功能的，即其可同时包含siRNA (剪切依赖性RISC格式化的)和miRNA或miRNA样(非剪切依赖性RISC格式化的)基序，并以剪切依赖性RISC格式化和非剪切依赖性RISC格式化两者的方式抑制弗林蛋白酶表达。另外，表达载体可靶向弗林蛋白酶mRNA转录物的编码区域，或其可靶向弗林蛋白酶mRNA转录物的3’ UTR区域序列,或其可同时革巴向弗林蛋白酶mRNA转录物的编码区域和3’ UTR序列两者。本发明还提供了在靶细胞中增强抗原表达、呈递和处理，以及减弱转化生长因子β (TGF-beta或TGF-β )的分泌免疫抑制活性的方法。该方法包括选择靶细胞并使用包括两个插入物的表达载体转染靶细胞的步骤。用于转染靶细胞的技术可为质粒载体电穿孔。第一核酸插入物编码GM-CSF，而第二插入物编码一个或多个短发夹RNA (shRNA)，所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。两种插入物均可操作地连接于启动子。敲减弗林蛋白酶表达可阻止其活化的TGF-β同工型包括TGF- β -I，TGF- β -2和TGF- β -3。靶细胞可以包括自体或异基因细胞，其可为确立的人类细胞系。本发明也包括通过给予患者FANG疫苗而预防、治疗和/或减轻癌症症状的方法。该方法包括步骤(i)确定需要治疗的受试者；(ii)从受试者中采集癌组织样本；(iii)对所采集的癌症样本中的癌细胞进行基因修饰jP(iv)将治疗有效量的基因修饰的细胞给予受试者。用于转染细胞的表达载体包括两个核酸插入物。第一核酸插入物编码GM-CSF并可操作地连接于启动子。第二核酸插入物也可操作地连接于启动子，并且其编码一个或多个短发夹RNA(shRNA)，所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。在本发明的一个实施方案中，靶向治疗的癌症为人黑色素瘤或非小细胞肺癌。为使基因修饰的细胞无法增殖，可对其进行辐照。在FANG疫苗中的基因修饰的细胞可为自体细 胞、异基因细胞、异种移植扩增细胞、确立的人类细胞系或这些细胞类型的组合。将细胞每月给予受试者一次以进行接种，剂量可达12次，各剂量含有IxlO7个细胞至2. 5xl07个细胞。剂量增加至5xl07个细胞显示安全。基因修饰细胞可作为独立疗法进行给予；然而其也可作为联合治疗的部分进行给予。在本发明的该实施方案中，FANG疫苗可与另外的一种治疗剂(或多种治疗剂)组合给予，所述治疗剂例如但不限于IL-12、IL-15和/或Y IFN。当使用FANG疫苗的治疗中包括YIFN时，方法包括在转染后分别使用约100U/ml的、IFN温育基因修饰的细胞48小时，或使用500U/ml温育24小时的另一步骤。在联合治疗中，将细胞每月一次，多达12剂地给予受试者，各个剂一般地含有IxlO7个细胞至2. 5xl07个细胞(虽然高达5xl07个细胞的剂量显示安全)加上剂量为50或100 μ g/m2的Y IFN。该方法进一步包括在转染后使用Y IFN温育基因修饰的细胞的步骤，其中转染后施加于基因修饰的细胞的Y IFN的剂量为约250U/ml ο本发明包括通过RNA干扰弗林蛋白酶来抑制TGF-β的独特方法，所述弗林蛋白酶为前蛋白转化酶，其关键性地参与所有TGF-β同工型的功能性加工。FANG载体独特地包括特异性地敲减弗林蛋白酶的双功能小发夹构建体(shRNA弗林蛋白酶)。本发明所述双功能shRNA弗林蛋白酶包括具有miR-30a骨架的两个茎环结构。第一茎环结构为siRNA前体组分,而第二茎环结构为miRNA样前体组分。在该实施方案中,策略为使用RNA干扰的剪切和螯合两者机制的单一靶向位点。在一个实施方案中，策略为使用两个不同的靶向位点，其中一个用于剪切，一个用于螯合组分，分别包括但不限于mRNA转录物的编码区域和mRNA转录物的3’UTR区域。在该实施方案中，双功能shRNA弗林蛋白酶由具有miR-30a骨架的两个茎环结构组成；第一莖环结构具有完全互补的引导链(guiding strand)和乘客链(passengerstrand),而第二莖环结构在乘客链的9至11位具有三个碱基对(bp)错配。在一个实施方案中，双功能shRNA弗林蛋白酶由具有miR-30a骨架的两个茎环结构组成；第一茎环结构具有完全互补的引导链和乘客链，而第二茎环结构在引导链的9至11位具有三个碱基对(bp)错配。在其它实施方案中，碱基对(bp)错配可占据防止Ago 2介导的剪切的位置，使其在热力学上有利于乘客链脱离。在其它实施方案中，碱基对错配会占据引导链的位置。FANG构建体包含GM-CSF和在驱动整个盒的哺乳动物启动子(CMV)控制下的双功能shRNA弗林蛋白酶转录物。该构建体用于产生经基因修饰以敲减弗林蛋白酶并表达GM-CSF的自体(SP患者特异性)癌症疫苗。本发明中用于制备FANG疫苗的构建体包括包含两个核酸插入物的双功能shRNA弗林蛋白酶/GMCSF表达载体质粒。第一核酸插入物可操作地连接于启动子，并且编码粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的cDNA。第二核酸插入物也可操作地连接于启动子，并且编码一个或多个短发夹RNA(shRNA)，所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。本发明所述双功能shRNA具有两种作用机制途径，siRNA的作用机制途径和miRNA的作用机制途径。因此，本发明所述双功能shRNA与传统shRNA不同，即通过siRNA作用机制发挥作用的DNA转录衍生的RNA，或与“成对shRNA”不同，所述成对shRNA指各自针对两种不同基因的表达但以传统siRNA模式发挥作用的两个shRNA。在本发明的一个实施方案中，GM-CSF为人的。shRNA为双功能的，并同时包括siRNA (剪切依赖性RISC格式化的)和miRNA或miRNA样(非剪切依赖性RISC格式化的)基序之一。在本发明的一个实施方案中，shRNA为弗林蛋白酶表达的剪切依赖性RISC格式化和非剪切依赖性RISC格式化抑制剂。表达载体可包含插入至第一和第二核酸插入物之间的小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽，并且启动子可为包含CMV IE 5’UTR增强子序列和CMV IE内含子A的CMV哺乳动物启动子。双功能shRNA所靶向的mRNA序列不限于编码序列；在一个实施方案中，shRNA可祀向弗林蛋白酶mRNA转录物的3’未翻译区域(UTR)序列，在一个实施方案中可同时靶向编码序列和弗林蛋白酶mRNA转录物的3’ UTR序列。 本发明也包括可用于特异性敲减靶细胞中弗林蛋白酶表达的载体。该shRNA弗林蛋白酶表达载体包括可操作地连接于启动子的核酸插入物。该插入物编码一个或多个短发夹RNA (shRNA)，所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。双功能shRNA可同时包括siRNA(剪切依赖性RISC格式化)和miRNA或miRNA样(非剪切依赖性RISC格式化)基序，并以剪切依赖性RISC格式化和非剪切依赖性RISC格式化方式抑制弗林蛋白酶表达。此外，表达载体可靶向弗林蛋白酶mRNA转录物的编码区域，或其可靶向弗林蛋白酶mRNA转录物的3’UTR区域序列，或其可同时靶向编码序列和弗林蛋白酶mRNA转录物的3’ UTR序列。附图的简要说明为了更全面地了解本发明的特征和优点，在此参照本发明的详述以及附图，其中

图1A-1C为图表，其显示FANG质粒转染前后(IA) TGF-β 1，(IB) - β 2，和(1C)GMCSF蛋白产生的概况。第4天起测定的人造自体癌细胞产生细胞因子14天ELISA值。数据代表由经历FANG加工的10名患者独立生成的自体疫苗(FANG 001-010)。图2A-2F为图表，其显示FANG cGMP质粒转染前后FANG-004肿瘤细胞中的(2A)TGF-β 1，(28)了6 -0 2，和(20 61 ^ 表达，及了46 cGMP质粒转染前后TAG-004肿瘤细胞中的(2D)TGF-β 1，(2E)TGF-P 2，和(2F)GMCSF 表达。FANG-004 和 TAG-004 来自相同肿瘤并依次在相同的两天中进行加工以表示为可比的表达谱；图3A-3C为图表，其显示患者肿瘤细胞中的FANG质粒(cGMP疫苗制造过程)与TAG质粒的电穿孔的并排比较，证明(3C)产生GMCSF蛋白并随附显示(3A)由FANG并非TAG敲减的TGF- β I表达，和(3Β) FANG和TAG两者敲减的TGF- β 2 (重合线)；图4Α为示意图，其显示bi-shRNA*#$eBI包括具有miR_30a骨架的两个茎环结构(SEQ ID NO. : I);第一莖环结构具有完全互补的引导链和乘客链,而第二莖环结构在乘客链的9至11位具有三个碱基对(bp)错配；图4B显示弗林蛋白酶mRNA的siRNA靶向区域。弗林蛋白酶mRNA的3’UTR和编码区域中可能的siRNA祀向区域和各siRNA所祀向的序列；图5为显示TAG表现为显著应答后，患者进行11个循环的PET CT的图像。用MRI扫描及活检追踪L 2处的残余摄取，显示无恶性肿瘤；图6A-6C显示对GMCSF表达和TGF- β I和-β 2敲减的评估，总结为FANG或TAG(TAG 004)质粒转染前后的(64)了6 -3 1，(68灯6 -3 2，(6061 ^ 蛋白产生。值代表经FANG转染的所采集的自体癌细胞中细胞因子产生的ELISA测定值。数据代表由经历FANG加工的9名患者独立产生的自体疫苗(FANG 001 - 009)。一名患者具有足以构建FANG (蓝色)和TAG疫苗(红色)的组织(FAN G 004/TAG 004)；图7显示了在FANG转染前后/辐照的肿瘤细胞中由RT-qPCR测得的GMCSF mRNA。某些泳道中缺少条带是由于RNA降解。(FANG-009中的额外条带是载样两次的第O天样品)；图8显示了来自患者转染和辐照mRNA前和转染和辐照mRNA后，由PCR测得的FANG疫苗细胞。在转染前后的样品中未检测到TGF-β 2的信号；图9显示了转染mRNA前和转染/辐射mRNA后由PCR测得的FANG-009疫苗细胞；图10显示了晚期患者的群组I与群组2和3的总生存率(n=61 ；P=. 0186)；图11显示了 GM-CSF-TGF-β 2反义(TAG)质粒的示意图；图12显示了包含pUMVC3-GM-C SF-2A-TGF- β 2反义载体的NCI-H-460鳞状细胞和NCI-H-520大细胞(NSCLC)中的GM-CSF的体外表达；图13 显示具有 pUMVC3-GM-CSF-2A-TGF- β 2 反义(TAG)载体的 NCI-H-460 鳞状细胞和NCI-H-520大细胞(NSCLC)中TGF-β 2水平降低；图14显示251个碱基对的探针特异性检测在NCI-H-460和NCI-H-520细胞中体外表达的GM-CSF-2A-TGF- β 2 (TAG)转录物(第6和10道)；图15显示GM-CSF在TAG疫苗中的表达；图16显示TGF- β I在TAG疫苗中的表达；图17显示TGF- β 2在TAG疫苗中的表达；图18Α和18Β显示在siRNA弗林蛋白酶敲减后(HA)TGF-P I和(HB)TGF-P 2在人类癌细胞系中的表达；和图19显示FANG的质粒构建体。发明详述虽然以下详细讨论本发明的各种实施方案的制备和使用，但应认识到本发明提供了许多在多种特定环境中可实现的适用的发明构思。本文所讨论的具体实施方案仅描述制备和使用本发明的具体方式，并不限定本发明的范围。为了便于理解本发明，以下定义了多个术语。本文所定义的术语具有与本发明相关领域的普通技术人员一般地理解的含义。术语如“一个(a) ”，“一个(an ) ”和“该(the ) ”不仅指单个实体，而且包括一般类别，其中使用特定实例进行说明。本文所述术语用于描述本发明的具体实施方案，但除了在权利要求中概述外，其使用不限定本发明。考虑可实施本说明书所讨论的关于本发明的任何方法，试剂盒，试剂，或组合物的任何实施方案，反之亦然、此外，本发明所述组合物可用于实现本发明所述方法。表I :缩写表


本发明包括用于癌症治疗的组合物和方法。更具体而言，本发明描述了经基因修饰用于弗林蛋白酶敲减和GM-CSF表达的自体癌症疫苗。本文所述疫苗通过使用双功能shRNA敲减癌细胞中的弗林蛋白酶表达来减弱TGF-β的免疫抑制活性，并通过GM-CSF转基因的表达增强肿瘤抗原的表达，呈递和加工。