专利名称：利用合成的、确定的胶原模拟表面进行细胞培养的方法细胞培养模型依赖于细胞在体外以与体内相当的方式粘附、增殖和功能的能力。 具体而言，在体内应用前，多种培养模型在体外利用角质形成细胞或肝细胞来检验化合物。 例如，角质形成细胞培养物用来预测皮肤刺激而肝细胞培养物用来预测肝毒性。利用胶原包被的细胞培养表面支持细胞粘附和细胞功能存在一定的问题，因为用来包被的胶原一般来自于人或其他动物来源，因此通常具有差的确定性。此外，利用衍生自人或其他动物的此类胶原在人类治疗应用中可能存在极大的问题其中可能产生免疫原性反应，其导致移植细胞的排斥。尽管分离的人胶原能够用来包被此类表面，但是相关费用很高并且仍可能导致免疫原性应答。另外，与重组胶原一样，由于其中存在的污染物的差异性，不同批次的分离的胶原可能导致细胞培养的差异性。另外，细胞培养的差异性也可能是由分离的和重组的胶原一般均采用的自我包被过程本身导致的。因此，需要利用无异种的、合成的、化学确定的模拟胶原的表面来增强细胞粘附、增殖和功能的方法。
本发明提供了利用无异种的、合成的、化学确定的表面用于细胞培养的方法，这种表面能够提供与胶原包被的表面相当的细胞粘附和功能性。特别是，角质形成细胞、胰腺癌细胞和肝细胞的细胞粘附性与胶原(即BD BioCoat胶原1)包被的表面上的细胞粘附性是相当的。此外，角质形成细胞的增殖与胶原(即BD BioCoat胶原1)包被的表面上的增殖是相当的。而且，肝细胞中的CYP450的基础活性和诱导与胶原(即BD BioCoat胶原1)包被的表面上的是相当的。这种方法是特别理想的，因为其中使用的表面避免了与人或其他动物来源的胶原相关的问题人或其他动物来源的胶原具有差的确定性并且还可能在治疗应用中引发免疫应答。同样，这种方法在细胞培养检验中是尤其优选的，因为培养条件在化学上更加明确。一方面，本发明提供了细胞培养的方法，所述方法包括将细胞悬液与表面接触，并且在适合细胞培养的条件下孵育细胞，其中所述表面的至少一部分之上含有化合物包被， 所述化合物包含氨基酸序列 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC (SEQ ID NO 1)，其中表示羟脯氨酸；其中细胞与该表面的粘附与悬浮细胞与胶原包被的表面的细胞粘附相当。在一个实施方案中，该细胞是角质形成细胞。在另一个实施方案中，该细胞是胰腺癌细胞。在另一个实施方案中，该细胞是肝细胞。在一个实施方案中，粘附至表面的细胞数量是其上没有任何细胞外基质蛋白质包被的对照表面的至少2倍。在一个实施方案中，其中细胞是角质形成细胞，粘附至表面的细胞数量是其上没有任何细胞外基质蛋白质包被的对照表面的至少3倍。在另一个实施方案中，其中细胞是胰腺癌细胞，粘附至表面的细胞数量是没有任何细胞外基质蛋白质包被的对照表面的至少10倍。在另一个实施方案中，粘附至表面的肝细胞中细胞色素P45(13A4的基础活性水平与粘附至胶原包被的表面上的肝细胞中的细胞色素P45(I3A4的基础活性水平相当。在另一个实施方案中，细胞色素Ρ45(Ι3Α4的诱导与粘附至胶原包被的表面上的肝细胞的细胞色素P45tl 的诱导水平相当。在一个实施方案中，所述表面是细胞培养容器。在另一个实施方案中，所述表面是微载体。在一个实施方案中，细胞在5% CO2的恒湿培养箱中于37°C孵育。在一个实施方案中，孵育细胞至少M小时。另一方面，本发明提供了利用本发明的方法培养的细胞。通过下面详细描述的研究将更好地理解本发明的这些和其他特征。图IA显示粘附至其上具有胶原(即BD BioCoat胶原1)包被的组织培养表面的人肝细胞(拟次170)的图像。图 IB 显示粘附至其上具有 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC (SE Q ID NO 1)包被的组织培养表面的人肝细胞(批次170)的图像，其中&表示羟脯氨酸。图IC显示粘附至具有胶原(即BD BioCoat胶原1)包被的组织培养表面的人肝细胞(批次94)的图像。图 ID 显示粘附至其上具有 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC (SE Q ID NO 1)包被的组织培养表面的人肝细胞(批次94)的图像，其中&表示羟脯氨酸。图IE显示粘附至其上具有胶原(即BD BioCoat胶原1)包被的组织培养表面的人肝细胞(197批次)的图像。图 IF 显示粘附至其上具有 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC (SE Q ID NO 1)包被的组织培养表面的人肝细胞(批次197)的图像，其中&表示羟脯氨酸。图IG显示其上没有任何细胞外基质蛋白质包被的组织培养表面上存在的人肝细胞的图像。图2显示来源于三个不同供体的粘附至其上具有GPCGPPGPPGPPGPPGPPGFXAERGP PGPPGPPGPPGPPGPC(SEQ ID NO :1)(其中X1表示羟脯氨酸)包被的表面(用“M”表示)，或具有胶原(即BD BioCoat胶原1)包被的表面(用“C”表示)的人肝细胞中的细胞色素 P4503A4(CYP3A4)诱导的基础水平和酶活性水平(以pmol/分钟/毫克蛋白质表示)以及倍数诱导。图3A显示在确定的、无动物成分的培养基中粘附至具有胶原(即BD BioCoat胶原1)包被的组织培养表面的人角质形成细胞的图像。图;3B显示在确定的、无动物成分的培养基中粘附至具有GPCGPPGPPGPPGPPGPPGFX !GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC(SEQ ID NO :1)包被的表面的人角质形成细胞的图像，其中&表示羟脯氨酸。图3C显示在确定的、无动物成分的培养基中存在于没有任何细胞外基质蛋白质包被的组织培养表面的人角质形成细胞的图像。图 4 的图显示了存在于具有 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGFXiGERGPPGPPGPPGPPGPPGPC^S EQ ID NO :1)(其中&表示羟脯氨酸)包被的表面(用“Mimetic”表示)，或具有胶原(即 BD BioCoat胶原1)包被的表面(用“BD BioCoat Coll”表示)上的人角质形成细胞的MTS 定量检验后490nm处的吸光度水平。图5A显示在确定的培养基中粘附至具有GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPP GPPGPPGPC(SEQ ID NO 1)包被的表面的人角质形成细包的图像，其中&表示羟脯氨酸。图5B显示在确定的培养基中粘附到具有胶原(即BD BioCoat胶原1)包被的组织培养表面的人角质形成细胞的图像。图5C显示在确定的培养基中存在于没有任何细胞外基质蛋白质包被的组织培养表面的人角质形成细胞的图像。图 6 的图显示了存在于具有 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC( SEQ ID NO :1)(其中&表示羟脯氨酸)包被的表面(用“A”表示)，或具有胶原(即BD BioCoat胶原1)包被的表面(用“B”表示)，或没有任何细胞外基质蛋白质包被的组织培养表面(用“C”表示)上的人角质形成细胞的MTS定量检验后490nm处的吸光度水平。图 7A 显示其上具有 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC(SEQ ID NO 1)包被的表面上存在的人胰腺癌细胞的图像，其中表示羟脯氨酸。图7Β显示其上具有胶原(即BD BioCoat胶原1)包被的组织培养表面上存在的人胰腺癌细胞的图像。图7C显示其上没有任何细胞外基质蛋白质包被的组织培养表面上存在的人胰腺癌细胞的图像。图 8 的图显示了存在于其上具有 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPG PC (SEQ ID NO :1)(其中&表示羟脯氨酸)包被的表面(用“Mimetic”表示)，或其上具有胶原(即BD BioCoat胶原1)包被的表面(用“Coll”表示)，或没有任何细胞外基质蛋白质包被的组织培养表面(用“TC”表示)上的人胰腺癌细胞的MTS定量检验后490nm处的吸光度水平。

人(新生儿的)表皮角质形成细胞购于hvi trogen公司(Cat#C-001-5C)，并根据生产商的说明书，在添加了 EDGS(含动物成分)或者S7(无动物成分)补充物的Epilife 培养基中，在以动物来源的胶原(即BD BioCoat胶原1)包被的表面或以具有氨基酸序列 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGFX1GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC(SEQ ID NO 1)的化合物(其中 ^C1 表示羟脯氨酸)包被的表面上进行培养。简单的说，将细胞以25，000/cm2的密度接种后在5% CO2的恒湿细胞培养箱中37°C培养。用显微镜观察细胞并捕捉图像。铺板后的第四至第五天用MTS检验定量分析细胞粘附到表面的情况。简言之，吸去培养基后在M孔板的每个孔中加入300 μ 1含有MTS (ftOmega目录序号G3582)的完全培养基。将细胞在37°C，5% CO2 的恒湿细胞培养箱中孵育1小时。孵育后，将0. Iml培养基转入BD Falco 96孔板中并测量490nm处的吸光值。从ATCC获得的PANC-1 (人胰腺癌细胞系)细胞用添加了 10 %胎牛血清的 DMEM(Invitrogen Cat No. 11885-084)培养基在37°C,5% CO2的恒湿细胞培养箱中培养。为了进行接种，除去培养基，用PBS清洗细胞，然后向装有细胞的T-75烧瓶中加入 3ml 0. 25%的胰蛋白酶-EDTA。显微镜下检查烧瓶，一旦细胞从表面脱离，加入IOml培养基以中和胰蛋白酶。将细胞特移到15ml BD i^ilcon管中然后以200x g离心10分钟。除去上清后用含有200μ g/ml BSA的DMEM(Invitrogen目录序号#11885-084)洗涤细胞沉淀一次。然后将细胞重悬于含有200 μ g/ml BSA的DMEM中，以50，000个细胞/cm2的密度接种到每孔有0. 5ml培养基的对孔板中。培养表面为作为阳性对照的BD BioCoat胶原1，或通过具有氨基酸序列 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC (SEQ ID NO 1)的肽进行修饰的表面，其中&表示羟脯氨酸。此外，BD组织培养处理表面作为阴性对照。细胞在5% CO2的恒湿细胞培养箱中37°C培养。接种后孵育M-48小时之后，使用显微镜观察细胞并捕捉图像。值得注意的是，在具有氨基酸序列 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC (SEQ ID NO 1)的化合物(其中&表示羟脯氨酸)进行包被的表面和用胶原(即BD BioCoat胶原1)进行包被的表面上培养时，二者的细胞粘附、扩散和增殖是相当的；而在没有包被的组织培养处理表面培养的细胞的粘附、扩散和增殖显著降低。这种模式在人肝细胞(见图1A-G)、人角质形成细胞(见图3和5)和人胰腺癌细胞(见图7)中是明显的。除了上述提到的视觉分析，还在铺板后第4天至第5天利用MTS分析法对细胞数量进行量化分析。简单的说，吸去培养基后在M孔板的每个孔中加入300μ 1含有 MTS(Promega目录序号G3582)的完全培养基。在37°C，5% CO2的恒湿培养箱中孵育细胞1 小时。孵育后，将0. Iml培养基转入BD Falco 96孔板中并测量490nm处的吸光值。
与上述视觉观察相符的是，用 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGF&GERGPPGPPGPPGPPGPPGPC ( SEQ ID NO 1)(其中表示羟脯氨酸)包被的表面或用胶原(即BD BioCoat胶原1)包被的表面上的细胞数量是相当的，而使用没有任何包被的组织培养表面上的细胞数量显著减少。这种模式在人角质形成细胞(见图4和6)和人胰腺癌细胞(见图8)中是明显的。
按照供应商(BD Biosciences)的流程说明、包括推荐的诱导浓度，使用利福平作为诱导剂，在人肝细胞在铺板后18到M小时进行CYP3A4诱导。阴性对照中仅使用DMS0。 诱导期间将细胞在37°C，5% CO2的恒湿细胞培养箱中孵育M小时士6小时。该诱导步骤在随后的两天进行重复，一共3天时间。
新鲜铺板的肝细胞诱导 72小时士8小时后，吸去培养基并用预温的 H印ato-STIM培养基洗细胞，然后用睾酮作为底物进行CYP3A4酶检验。按照供应商(BD Biosciences)的说明配制睾酮反应混合物。吸去培养基后，往M孔板的每个孔中加入 400μ1睾酮反应混合物。将细胞在37°C，5% CO2的恒湿细胞培养箱中孵育30分钟。孵育结束后，从每个孔中取出300 μ 1转入印pendorf管中在冰上储存。往每个管中加入150 μ 1 乙腈以终止反应。样品在室温下14，OOOrpm离心5分钟，然后将上清转入另一个管中。然后对上清进行HPLC分析。用6-β -睾酮绘制标准曲线，然后从中量化细胞产生的6-β -睾酮的量。将剩下的反应混合物从平板中移出后，用PBS+1 % SDS裂解细胞，用BCA试剂盒 (Pierce)确定细胞裂解液中的总蛋白的量。酶活性用pmol产物/分钟/毫克蛋白表示。如图2 所示，在具有胶原(即 BD BioCoat 胶原 1)或 GPCGPPGPPGPPGPPGPPGFXpER GPPGPPGPPGPPGPPGPC (SEQ ID NO 1)(其中&表示羟脯氨酸)包被的表面上，CYP3A4的基础活性水平以及倍数诱导是相当的。在不偏离本广泛发明思想基础上对上述实施方案进行的改变是本领域技术人员可以想到的。因此，本发明不限于公开的特定实施方案，而应该覆盖如所附权利要求所限定的本发明精神和范围内的所有改变。


本发明公开了利用模拟胶原包被的表面的表面增强细胞粘附、细胞增殖和细胞功能的方法。有利地，该方法采用了无异种的、合成的、化学确定的表面。