专利名称：用哺乳动物细胞系生产禽呼肠孤病毒与疫苗的制作方法禽呼肠孤病毒(Avian Reovirus，简称ARV)在世界范围内广泛存在，广泛流行于鸡、火鸡中，它引起的关节炎、腱鞘炎及免疫抑制等给养鸡业带来重大经济损失。目前，我国控制禽呼肠孤病毒的主要手段是使用减毒活疫苗或全病毒灭活苗通过免疫接种来控制鸡呼肠孤病毒感染，而我国目前所用的禽呼肠孤病毒疫苗均为国外进口疫苗，使用鸡胚或鸡胚成纤维细胞培养生产病毒，使得制备的疫苗价格很高，且工艺复杂，造成养殖户防治ARV的成本升高。
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种用哺乳动物细胞系生产的禽呼肠孤病毒及禽呼肠孤病毒灭活疫苗及其方法，以提供一种鸡胚源的灭活疫苗批间差异更小，免疫效力更佳的禽呼肠孤病毒灭活疫苗，从而实现更安全、更有效地生产禽呼肠孤病毒及疫苗的目的。技术方案用哺乳动物细胞系生产禽呼肠孤病毒的方法，包括以下步骤:I)将收获的禽呼肠孤病毒，接种至长满单层的哺乳动物细胞系，使用细胞维持液培养；2)接种培养后，收获禽呼肠孤病毒优选地，用哺乳动物细胞系生产禽呼肠孤病毒的方法，上述步骤I)具体地包括:a)细胞毒种的繁殖，即:使用禽肾细胞对禽呼肠孤病毒继代；b)禽呼肠孤病毒适应哺乳动物细胞的步骤，即:将经过继代处理的禽呼肠孤病毒，接种于长满单层的哺乳动物细胞系，使用细胞维持液培养，至出现CPE大于75%时，收获禽呼肠孤病毒，作为制苗用毒种；c)制苗毒液的繁殖，即:将收获的禽呼肠孤病毒，接种至长满单层的哺乳动物细胞系，使用细胞维持液培养；优选地，上述步骤2)为制苗毒液的收获，即:接种培养6 7天后，收获禽呼肠孤病毒。本发明对所用的哺乳动物细胞系没有特别的限制，即本发明可以使用任意的哺乳动物细胞系；优选地，可以使用VeiO细胞系(非洲绿猴肾细胞系)、MDCK细胞系(马-达二氏犬肾细胞系)、ΡΚ_15细胞系(猪肾细胞系)、Marcl45细胞(上皮样细胞系，来源于猴肾细胞)、ST细胞(猪睾丸细胞系)、IBRS-2细胞(猪肾细胞系)任意一种或几种细胞系；更优选地，使用VeiO细胞系或MDCK细胞系；最优选地，使用Vero细胞系生产禽呼肠孤病毒与疫苗。优选地，本发明的禽呼肠孤病毒在接种至哺乳动物细胞系生产前，要使用禽类肾细胞继代(在本发明中也可以称为传代)14代 18代；更优选地，使用SPF鸡胚肾细胞(CK细胞)进行继代(或传代)；最优选地，在继代处理后还包括在使用前在禽肾细胞继代(或传代)一次。优选地，本发明步骤2)收获的禽呼肠孤病毒的效价为大于4X 107TCID5Q/ml。本发明对禽呼肠孤病毒没有特别的限制，即本发明的方法可以使用哺乳动物细胞系生产任意类型的禽呼肠孤病毒；优选地，本发明所述的禽呼肠孤病毒是禽呼肠孤病毒AV2311 株。本发明的另一目的在于提供一种用哺乳动物细胞系生产禽呼肠孤病毒灭活疫苗的方法，即使用上述方法获得的禽呼肠孤病毒，加入灭活剂，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂，乳化后获得禽呼肠孤病毒灭活疫苗。由上可知，本发明可以使用哺乳动物细胞系生产禽呼肠孤病毒及禽呼肠孤病毒灭活疫苗。即，发明人意外地发现在禽呼肠孤病毒在禽类肾细胞继代处理后，可以帮助禽呼肠孤病毒更适应在哺乳动物细胞 上的生长与繁殖，从而获得一种高滴度、质量批次稳定的禽呼肠孤病毒；另外，发明人还发现在利用哺乳动物细胞培养禽呼肠孤病毒前，使用至少一次的禽源细胞预培养或适应，可以使得禽呼肠孤病毒在哺乳动物细胞的生产更有利。因此，本发明可以利用哺乳动物细胞来生产禽呼肠孤病毒，而利用本发明的禽呼肠孤病毒在哺乳动物细胞系获得的禽呼肠孤病毒灭活疫苗比鸡胚源的灭活疫苗批间差异更小，免疫效力更佳。1.2SPF蛋和SPF鸡购自北京梅里亚维通生物技术有限公司。2ARV鸡胚源灭活疫苗制备方法与结果 2.1制备鸡胚源ARV灭活疫苗:a.病毒繁殖:将AV2311株毒种在鸡胚上繁殖传代，使病毒效价检测达到IO1tl 5EID5ciA).2ml ；b.疫苗灭活:甲醛灭活16h，所述甲醛溶液浓度为34%，加入量为灭活溶液体积的2%。；c.油相制备:在白油中按2%。加入硬脂酸铝，按5%。加入司本-80熬制而成；d.乳化:加入乳化剂吐温-80，吐温-80占水相体积的1%，水相与油相体积比为3: 5，其中水相即是灭活的病毒液体，油相为乳化时用的白油。用乳化机以12000转/分乳化10分钟，制成ARV鸡胚源灭活疫苗。2.2物理性状检验:肉眼观察疫苗外观，6批疫苗均为乳白色均匀乳剂；剂型均为油包水(W/0)型；取6批苗各I管(15ml)在37°C放置21日，均无破乳；用Iml吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)吸取25°C左右的疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间，结果6批疫苗流出时间分别为3.5秒、3.5秒、3.6秒、3.5秒、3.7秒、
3.5秒，均在8秒以内。2.3无菌检验按现行《中国兽药典》对6批ARV疫苗进行检验，均无细菌生长。2.4安全检验用3周龄SPF鸡120只，分为6组，每组20只，每批苗分别肌肉注射疫苗2羽份(1ml)，观察21天，结果见表I。表I安全检验结果比较


本发明提供了一种用哺乳动物细胞系生产禽呼肠孤病毒的方法，包括使用如Vero细胞系或MDCK细胞系等哺乳动物细胞系，在上述细胞系形成生长良好的细胞单层后，接种使用禽肾细胞继代的禽呼肠孤病毒，并使之吸附于上述细胞系；换用细胞维持液培养，以进行禽呼肠孤病毒的增殖，并收获禽呼肠孤病毒。使用上述方法获得的禽呼肠孤病毒，加入灭活剂，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂，乳化后获得禽呼肠孤病毒灭活疫苗。