专利名称：一种呼肠孤病毒疫苗及制备方法 禽呼肠孤病毒(Avianreovirus，ARV)是鸡病毒性关节炎和腱鞘炎的主要病原之一，属呼肠孤病毒科，呼肠孤病毒属的一个成员。自Fahey和Grawly(1954)首次从患慢性呼吸道病的鸡呼吸道分离到(ARV)以来，许多ARV分离株相继被报道。随着研究的深入开展，ARV与其它疾病的关系也为人们所关注。已经发现除病毒性关节炎和腱鞘炎外，ARV在呼吸道病、肠道病、心肝病损、蓝翅病、肉鸡矮小综合症、暂时性消化系统紊乱等疾病的发生上起某种程度的作用，从患这些疾病的鸡体内均能分离到ARV。ARV在世界范围内存在，广泛流行于鸡、火鸡中，其它禽类感染ARVS也有报道。经济上的损失常是由于关节炎、腱鞘炎造成废弃率高和生长抑制，饲料转化率低。随着养禽业的蓬勃发展，ARV的影响越来越大，其引起的疾病发病率上升，复杂性增大。目前，控制禽群ARV发病的主要手段是使用减毒活疫苗或灭活全病毒疫苗通过免疫接种来控制典型的鸡呼肠孤病毒感染。但由于该病毒为RNA病毒，有多个分段，在商品禽群中普遍存在，不同毒株间在抗原结构、致病性、细胞培养特性、对胰蛋白酶敏感性以及宿主特异性上存在一定的差异。在遗传进化时，容易发生变异，不同区域的两种病毒之间的差异更大。使用国外疫苗对于本土该病毒的预防和治疗并不是非常理想，且价格很高。因此，针对我国特定存在的该病毒的血清型，开发生产前者所没有的特异优势的疫苗，无疑可对控制本土禽群ARV发病起到积极的作用，且能够产生较好的经济效益。
本发明所要解决的技术问题是提供一种免疫产生迅速、持续时间长、免疫力强、针对本土禽群病毒性关节炎疾病的呼肠孤病毒疫苗及制备方法。本发明所称问题是由以下技术方案解决的 一种呼肠孤病毒，所述病毒为禽呼肠孤病毒(Avianreovirus，简称ARV)，毒株为RS13株，保藏号为CGMCC No.1713，于2006年5月16日保藏在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心。上述呼肠孤病毒，所述病毒无囊膜，呈20面体对称，基因组由10个双链RNA分段构成，能耐受60℃8～10h，对乙醚不敏感，对氯仿轻度敏感，对碱敏感，3％氢氧化钠作用1h，即可杀死病毒，无血凝特性。一种呼肠孤病毒疫苗制备方法，它包括如下步骤a.分离病毒在患有病毒性关节炎病的病鸡的粪便、泄殖腔拭子、气管、腱鞘等部位分离病毒，用PBS缓冲液洗涤，过滤，反复冻融3～5次，释放出病毒，将病毒在鸡胚或鸡胚成纤维细胞上中增殖传代，使病毒效价达到109.5ELD50/0.2ml，作为生产用病毒种子；b.血清检测用S1133阳性血清中和后，接种10日龄SPF鸡胚或鸡胚成纤维细胞中，不出现相应的鸡胚体和内脏病变或相应的细胞病变，证实该病毒的血清型与S1133相同；c.病毒繁殖将毒种通过鸡胚或鸡胚成纤维细胞繁殖传代，病毒效价检测达到109.5ELD50/0.2ml；d.混合冻干将病毒稀释到106.5ELD50/ml，按照1∶1.2比例加入5％奶粉保护剂和病毒液体，冻干，制成呼肠孤病毒冻干活疫苗。上述呼肠孤病毒疫苗制备方法，所述病毒繁殖传代50～70代。
本发明从本土禽群感染ARV的病鸡中分离出呼肠孤病毒，将分离得到的呼肠孤病毒在鸡胚上传代，制成冻干活疫苗，将其应用于免疫鸡只，1周内产生免疫应答，2周内即可产生坚强的免疫力，免疫期为2～2.5个月，免疫期间攻毒保护率为94.8％～98.8％，明显高于国外进口疫苗保护率。本疫苗对我国该病毒的预防和治疗是更为理想的选择，适应于国内各养禽场，安全可靠，具有很大实际应用价值，可弥补目前国内在呼肠孤病毒感染方面疫苗空缺的缺陷，为该病的防治提供一种可以切实可行的疫苗及制备方法。

本发明疫苗针对本土呼肠孤病毒RS13株，该病毒无囊膜，呈20面体对称，基因组由10个双链RNA分段构成，对热有抵抗力，能耐受60℃8～10h，对乙醚不敏感，对氯仿轻度敏感，对碱敏感，3％氢氧化钠作用1h，即可杀死病毒，该病毒无血凝特性。
该病毒容易在鸡胚中生长，初次分离时可选用卵黄囊接种，一般在接种后3～5天鸡胚死亡，鸡胚因广泛皮下出血而呈紫色。绒毛尿囊膜接种时，通常7～8天死亡，绒毛尿囊膜有稍隆起的、分散的白色病灶，鸡胚轻度发育不良。
该病毒也可在鸡胚成纤维细胞上繁殖，但需要适应，即吸附细胞1h，常形成合胞体，最早出现于24～48小时，随后单层细胞变性后出现空洞，巨细胞悬浮于培养基中。
以下给出制备疫苗的实施例a.分离病毒从病鸡的腱鞘中分离病毒，将病鸡的腱鞘(若为其它病鸡，则在其它病变部位提取)搅碎，使用5ml PBS(磷酸盐缓冲液)稀释，稀释液中加入青链霉素，以消除其他杂菌污染。反复冻融5次，将病毒从组织中释放出来。3000转/min离心20分钟，去除组织块。上清液中含有病毒，即为分离到的病毒。将此病毒在鸡胚上连续繁殖70代，检测病毒效价，达到109.5ELD50/0.2ml，取第70代收获病毒，作为生产用病毒种子。
呼肠孤病毒的效价检测，其检测方法为TCID50(细胞半数感染量)和ELD50(鸡胚半数致死量)。鸡胚传代病毒在10-8和10-9出现病变孔分别为5孔和2孔，即TCID50＝10-8.9/0.1ml，鸡胚传代病毒在10-9梯度全部死亡，即ELD50＝10-9.5/0.2ml。
b.血清检测用S1133阳性血清中和后，接种10日龄SPF(无特定病原微生物)鸡胚，不出现相应的鸡胚体和内脏病变，证实该病毒的血清型与S1133相同。
c.病毒繁殖将毒种通过鸡胚繁殖，取发育良好的SPF鸡胚20枚，0.2ml/枚注射，在鸡胚大血管附近抽出人工气室，将用PBS缓冲液稀释到1∶10000(重量比例，即g/ml)的病毒注入到人工气室中，37.5℃～38.5℃条件培养，收获24小时以后死亡鸡胚和有病变的活鸡胚的绒毛尿囊膜，1∶10比例稀释，-20℃冻存备用。连续传代。
在本发明进行的试验中，当病毒经连续传代70代，毒力明显比刚分离时减弱。将传代病毒从第50代到70代连续20代的病毒进行效价检测，均可达到很高的数值，即109.5ELD50/0.2ml左右，说明该病毒已经适应在鸡胚中增殖，且非常稳定。从毒力减弱、病毒增殖稳定、安全、有效，证明该病毒适合在生产上大规模应用。同时，临床试验的研究结果也与此结论一致。
d.混合冻干将病毒稀释到106.5ELD50/ml，按照1∶1.2比例加入5％奶粉保护剂和病毒液体，冻干，制成呼肠孤病毒冻干活疫苗。
所制备的冻干活疫苗，每西林瓶中含病毒量106.5ELD50/1000羽份。
安检取使用剂量的10倍量即104.5ELD50/0.2ml足垫免疫1日龄SPF鸡，观察2周，足垫接种部位无炎症反应等情况出现。
效检取使用剂量即103.5ELD50/0.2ml颈背部皮下免疫1日龄鸡，2周后，用强毒攻击，保护率达到100％。冻干疫苗免疫鸡只1周内，即可产生坚强的免疫力，免疫期为2.5个月，免疫期间攻毒保护率为94.8％～98.3％。
真空度检测随机取10瓶冻干疫苗，用高频火花真空测定器测定该样品的真空度，疫苗瓶中均出现紫色辉光，说明该冻干疫苗的真空度合格。
剩余水分测定采用真空烘干法测定，具体操作参阅《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)438页进行。各随机抽样检测冻干疫苗样品的剩余水分均低于4.0％，说明该冻干疫苗剩余水分合格，达到标准。


一种呼肠孤病毒疫苗及制备方法，属医用制品技术领域，用于解决本土禽群呼肠孤病毒感染的疫苗问题。所分离的呼肠孤病毒保藏号为CGMCC No.1713，于2006年5月16日保藏在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心。该疫苗通过从病鸡器官中分离病毒、血清检测、病毒繁殖传代、冻干等步骤制备而成。本发明从本土禽群感染ARV的病鸡中分离出病毒并制成疫苗，将其应用于免疫鸡只，1周内产生免疫应答，2周内即可产生坚强的免疫力，免疫期为2～2.5个月，免疫期间攻毒保护率为94.8％～98.8％，明显高于国外进口疫苗保护率，可弥补目前国内在呼肠孤病毒感染方面疫苗空缺的缺陷。