专利名称：用于检测甲基化dna的试剂盒和方法用于检测甲基化DNA的试剂盒和方法 本申请是申请日为2005年11月观日、发明名称为“用于检测甲基化DNA的试剂盒和方法”的中国专利申请200580047184. 6 (国际申请号PCT/EP2005/012705)的分案申请。本发明涉及检测甲基化DNA的体外方法，其包括(a)用能够结合甲基化DNA的多肽包被容器；(b)将所述多肽与含有甲基化和/或未甲基化的DNA的样品接触；和(c)检测所述多肽与甲基化DNA的结合。在优选实施方案中，所述方法还包括步骤(d)通过测序分析所检测的甲基化DNA。本发明的另一方面是用于根据本发明的方法检测甲基化DNA的试剂盒，其包含(a)能够结合甲基化DNA的多肽；(b)可以用所述多肽包被的容器；(c)包被所述容器的手段；和(d)检测甲基化DNA的手段。产生所有活的生物的细胞的信息包含在它们的DNA中。DNA由简写为G、A、T和C 的四种碱基组成并且像非常长的梯子一样构造，这些字母对组成梯子的每个“横档”。字母 G与C配对，A与T配对。这些对的字符串将信息像编码的信息一样储存，组成分组为区域的特定分子的信息称作基因。二倍体动物的每个细胞含有每个基因的两个拷贝，每个基因的一个拷贝来自母亲并且一个拷贝来自父亲。(该规则的唯一例外是染色体上决定生物发育成“雄性”还是“雌性”的基因)。DNA甲基化和基因调节除了“拼出”我们的基因组的四种碱基-腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶之外， 还存在第五种碱基，其通过复制后DNA的修饰产生。DNA甲基转移酶(DNMTs)可以催化甲基从甲基供体S-腺苷甲硫氨酸向胞嘧啶环的转移，并从而产生碱基5-甲基胞嘧啶。特定胞嘧啶残基在哺乳动物中被修饰，所述胞嘧啶残基在DNA序列中鸟嘌呤残基之前(CpG 二核苷酸)(Singal，Blood 93 (1999)，4059-4070) ；Robertson, Nat. Rev. Genet. 1 (2000)， 11-19 ；Ng, Curr· Opin. Genet. Dev. (2000)，158-163 ；Razin, EMBOJ. 17(1998)，4905-4908)。 CpG 二核苷酸的甲基化通常与稳定的转录抑制相关并且可能导致大部分非编码基因组和潜在可能的序列如转座子、重复或者病毒插入片段不转录这一事实。有趣的是CpG 二核苷酸在基因组中分布非常不均(Singal (1999)，在上述引文中，Robertson(2000)，在上述引文中，Ng(2000)，在上述引文中，RaZin(1998)，在上述引文中)。基因组的大部分含有比统计预期的少得多的CpG。这可能是由于5-甲基胞嘧啶比较容易地脱氨成胸苷，其在进化过程中导致CpG 二核苷酸的数目相对减少。然而，再次，有更多数目的CpG分布在基因组中，即所称作的CpG岛。这些区域通常含有转录起始点和基因启动子并且通常不甲基化，相比之下，CpG不与CpG岛有关。在正常细胞中，CpG岛的甲基化仅在罕见的病例中观察到，如雌性细胞的χ染色体的第二个拷贝和亲本印记基因组的失活(Singal (1999)，在上述引文中， Robertson (2000)，在上述弓丨文中，Ng (2000)，在上述引文中，Razin (1998)，在上述弓丨文中)。DNA甲基化的调节仅仅部分理解DNA甲基化模式怎样在胚胎发生过程中建立起来和CpG甲基化怎样在基因组中保持和受到调节(Singal (1999)，在上述引文中，Ng(2000)，在上述引文中， Razin (1998)，在上述引文中)。在哺乳动物物种中，已知有三种DNA甲基转移酶(DNMTl、3a和3b)，其催化DNA甲基化过程。然而，必须澄清每种DNMT对于CpG甲基化的维持和调节所做贡献的对应份额。然而，所有三种酶显然对于胚胎发生都是必需的，对应的敲除小鼠在子宫内(in utero)死亡或者出生后不久死亡(Bestor,Hum. Mol. Genet. 9 (2000), 2395-2402 ； El Osta, Bioessays 25 (2003), 1071-1084) 同时已经几次显示了 DNA甲基化、染色质结构的修饰和某些组蛋白修饰之间的联系。DNA的甲基化多数与组蛋白脱乙酰作用和组蛋白 H3 的赖氨酸 9 残基的甲基化相关(Sims，Trends Genet. 19 (2003), 629-639, Fahrner, Cancer Res. 62 (2002)，7213-7218)。因此，DNMT与组蛋白乙酰基转移酶(HDACs)或者携阻抑物复合体有关。还几乎不知道甲基是怎样从CpG残基除去的。在增殖细胞中，DNA甲基化还可能在复制期间被动地发生。然而，也有在有丝分裂后细胞中DNA甲基化的实例，其可以通过存在活性的迄今还未知的脱甲基酶来解释(Wolffe，Proc. Natl. Acad. Sci. 96(1999)， 5894-5896)。CpG甲基化和基因沉默启动子(但不是非调节序列)的甲基化与稳定的转录阻抑相关(Singal (1999)，在上述引文中，Ng(2000)，在上述引文中，RaZin(1998)，在上述引文中)。5-甲基胞嘧啶的阻抑性质可以通过两种机制介导。首先，DNA甲基化可以直接损害转录因子的结合。第二种可能性(其可能造成最大部分的阻抑)是甲基-CpG-结合蛋白(MBPs)的募集(Ballestar， Eur. J. Biochem. 268 (2001)，1-6)。MBP 如 MECP2 或 MBD2 (MeCPl 复合体的组分)伴随着协阻抑物复合体和HDAC，其具有阻抑效果并且负责转录因子不能接近的稠密染色质结构(异染色质)的形成(BallestaH2001)，在上述引文中)。肿瘤发生中的外遗传改变正越来越清楚的是肿瘤的形成不仅受到遗传损伤(例如，突变或者易位)而且受到外遗传改变的支持。异常的染色质结构或者DNA甲基化可以影响癌基因或者肿瘤抑制基因的转录状态并且可以促进肿瘤生长。DNA甲基化的改变包括正常甲基化序列中甲基化的损失(低甲基化)或者正常的未甲基化序列的甲基化(超甲基化)(ROberStOn(2000)，在上述弓丨文中，Herman, N. Engl. J. Med. 349 (2003)，2042-2054 ；Momparler, Oncogene 22 (2003)， 6479-6483 ；Esteller, Science 297(2002)，1807-1808 ；Plass, Hum. Mol. Genetl1(2002), 2479-2488)。低甲基化已经对几乎所有类型的肿瘤描述了总体DNA低甲基化。在肿瘤组织中，5-甲基胞嘧啶的含量与正常组织相比降低，甲基化事件的主要份额在染色体的重复卫星序列或者着丝粒区域中发现。然而，在单个情况中，还已经描述了原癌基因如bcl-2或c-myc的去甲基化和活化(Costello, J. Med. Genet. 38 (2001)，285-303)。超甲基化或者CpG岛CpG岛通常发挥基因调节功能。这是为什么甲基化状态的改变最直接地与有关基因座的转录活性的改变相关的原因(Robertson(1999) ；Herman(2003) ；Esteller(2002)； Momparler (2003) ；Plass (2002)，所有都在上述引文中)。多数CpG岛以未甲基化形式存在于正常细胞中。然而，在一些情况下，CpG岛也可以在基因调节事件中被甲基化。雌性细胞的失活的X染色体的CpG岛的多数是例如甲基化的(Goto，Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (1998)，362-378)。CpG岛还可以在正常的衰老过程中被甲基化(Issa，Clin.Immunol. 109(2003)，103-108)。尤其在肿瘤中，通常不甲基化的CpG岛可以以超甲基化形式存在。在许多情况中， 受到超甲基化影响的基因编码抵消肿瘤的生长的蛋白质，如肿瘤抑制基因。下表列出了基因的实例，可以表明这些基因在肿瘤中通过超甲基化的外遗传的机制被失活。表肿瘤中超甲基化基因(实例)本发明涉及检测甲基化DNA的体外方法，其包括(a)用能够结合甲基化DNA的多肽包被容器；(b)将所述多肽与含有甲基化和/或未甲基化DNA的样品接触；和(c)检测所述多肽与甲基化DNA的结合。在优选实施方案中，所述方法还包括步骤(d)通过测序分析所检测的甲基化DNA。本发明的另一方面是用于根据本发明的方法检测甲基化DNA的试剂盒，其包含(a)能够结合甲基化DNA的多肽；(b)可以用所述多肽包被的容器；(c)包被所述容器的手段；和(d)检测甲基化DNA的手段。