专利名称：提高慢病毒感染的细胞培养物的细胞密度的组合物和方法慢病毒构成一类可以在人类和动物体内导致多种疾病的病毒。在所述疾病发病之前通常会有数月甚至是数年的潜伏期。例如，与AIDS相关的病理学是由人类免疫缺陷病毒(HIVs)引起的，并且是由疾病的慢性发展所导致的，通常在感染之后数年时间导致患者的恶病质和死亡。慢病毒还与诸如猿和猴的物种，以及诸如马、驴、牛、山羊和绵羊的家畜的各种病理学相关。其中，马传染性贫血(EIA)已被鉴定为在世界范围内发生的最重要的马传染病。在世界上的大多数地方，绵羊的慢病毒是较常见的病原体，并且包括作为两种主要类型的Maedi-visna病毒和渐进性肺炎病毒。牛免疫缺陷病毒是牛生病的重要因素。其他慢病毒是诸如猫的动物病理学的重要标志。在结构上类似于HIV的猫免疫缺陷病毒能导致家猫死亡。有越来越多的医生、兽医和研究人员，将大量的时间和资源投入用于预防和治疗由这些病毒导致的疾病。一部分研究包括生长含有细胞(例如淋巴细胞)的组织培养物，所述细胞已被一种或多种已知慢病毒感染。淋巴细胞培养物或停泊依赖性(anchorage dependent)上皮样细胞，如猫肾细胞培养物可以在T烧瓶、滚瓶、旋转烧瓶和生物反应器中，使用补充了高达大约20％至大约5％的牛血清白蛋白(BSA)的培养基，诸如最低必需培养基(MEM)、Roswell Park Memorial Institute(RPMI)、Dulbecco’s MEM(DMEM)和AIM V(Gibco/LTI，Grand Island NY)生长。大规模培养物可以在添加剪切保护化合物、增稠剂、乳化剂或诸如甲基纤维素、羧甲基纤维素的化合物，以及诸如Pluronic系列的表面活性剂，例如BASF公司(Wyandotte，Michigan)生产的PLURONIC?F-68的条件下，在大的旋转烧瓶(spinner)、发酵罐和生物反应器中生长。在维持含有病毒的组织培养物时，研究人员试图清除培养物中的有害细菌，以便含有病毒的细胞能够生长和繁殖。与此同时，一个相伴的目的是最大地增加细胞培养物的生长。为了促进生长并且清除细菌，可向细胞培养物添加抗生素，通常是添加抗生素的组合物。例如US5958423提供了一种Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞培养物，在该培养物中使用了高达30mcg/ml的多粘菌素(polymixin)B和新霉素，以及高达2.5mcg/ml的两性霉素B。本领域现在需要的是含有用慢病毒感染过的细胞的新的细胞培养物组合物。特别需要这样的新型细胞培养物，其中，细胞生长可以最大化，并且能同时使诸如细菌的有害生物的存在最少化。还需要生长细胞培养物的新方法，其中，可以通过促进组织生长提高细胞密度。还需要能引起和促进包括所述培养物的细胞生长的，能优化细胞培养物密度的新型添加剂。发明概述在一种实施方案中，本发明涉及一种细胞培养物，它含有至少一种慢病毒感染的宿主细胞和生长促进数量的抗生素，所述抗生物主要由新霉素或它的生物学相容的盐组成。本发明还涉及一种细胞培养物，它包括至少一种慢病毒感染的宿主细胞，和新霉素或它的生物学相容的盐，以便在基本没有其他抗生素的情况下，所述新霉素的含量能有效抑制细菌生长，并且提高细胞培养物的密度。
还作为本发明的一部分的是一种提高细胞培养物密度的方法，所述培养物中的细胞已被慢病毒感染，该方法包括向所述细胞培养物中添加主要由新霉素或它的生物学可以接受的盐组成的抗生素。
本发明还提供了一种适合添加到被慢病毒感染的细胞培养物中的组合物。该组合物含有细胞密度提高数量的、主要由新霉素或它的生物学盐组成的抗生素，同时含有至少一种细胞培养添加剂。所述细胞培养添加剂优选是源于牛的血清。
通过下面所提供的对本发明优选实施方案的详细说明，可以更好地理解本发明的上述和其他特征和优点。
优选实施方案的详细说明本发明涉及细胞培养物。与本发明相关的细胞培养物是那些适合研究的，能够锚定(harboring)慢病毒，并且可以让它生长的细胞培养物。因此，所述细胞培养物包括可以被一种或多种慢病毒感染的淋巴细胞和其他类型的细胞。其他合适的细胞培养物包括猫淋巴细胞、成纤维细胞样细胞和上皮细胞样细胞，如猫肾细胞、Crandell猫肾或CRFK细胞、FL6、FL72和FL74(猫淋巴细胞)细胞。T细胞淋巴细胞、以及IL-2独立型FetJ和FL6淋巴细胞也可优选用于本发明中。
本文所使用的术语“慢病毒”，包括所有已知的和尚有待发现的慢病毒，包括但不局限于马传染性贫血病毒、Maedin-visna病毒、渐进性肺炎病毒、山羊关节炎-脑炎病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)、能感染诸如猕猴、非洲猴和狒狒的猿猴(simian)免疫缺陷病毒、以及I型和II型人类免疫缺陷病毒(HIV)。术语“慢病毒”还包括上述任意病毒的类似物、衍生物和肽序列。本发明优选使用非人慢病毒，特别是猫免疫缺陷病毒(FIV)。
可以用本领域已知方法培养本发明的细胞培养物。例如，可以通过公认的方法，用一种或多种上述慢病毒对诸如淋巴细胞的宿主细胞进行慢性感染，然后在合适的培养基中生长。优选地，所述培养基大体上是液体培养基，所述培养基更优选是最初以基本上不含血清的培养基形式提供的。例如，可以将宿主细胞悬浮在液体培养基中。培养的细胞培养物的细胞密度可以根据特定的宿主细胞、培养基、生长箱而改变，不过，可以在每毫升细胞培养物(包括培养基)中有大约1×104-大约1×106合适细胞的范围内。所述细胞密度更优选为大约每毫升2×105-大约5×105细胞。
作为本发明的另一部分，所述细胞培养物含有能在所述培养物中有效抑制细菌生长的合适的抗生素，与此同时，提高了细胞的生长，并由此提高了细胞培养物的密度。本发明优选使用的抗生素是新霉素，可以包括新霉素的生物学相容的盐和衍生物，如硫酸新霉素。“生物学相容的”表示它的盐或衍生物基本上不会对所述细胞产生不利的生物学影响。
在细胞培养物中添加的新霉素的量可以根据技术人员的需要加以改变，不过，通常以能提高细胞培养物密度的用量添加。大约5微克/毫升细胞培养物至大约60微克/毫升细胞培养物(包括培养基)范围内的新霉素用量通常是优选的。在一种更优选的实施方案中，以至少大约10微克/毫升的用量将新霉素添加到细胞培养物中，更优选至少大约20微克/毫升。更优选的是，新霉素的用量可以在大约30微克/毫升至大约60微克/毫升的范围内。
优选在不添加诸如多粘菌素B和庆大霉素的其他抗生素的情况下，用新霉素增强细胞培养物的生长和密度。多粘菌素B可以是由多粘菌素B1和B2衍生的，它是通过生长多粘芽孢杆菌(Prazmowski)Migula(芽孢杆菌科)而产生的。已发现，与单独使用新霉素相比，在细胞培养物中添加新霉素和多粘菌素B，在很多场合下能导致细胞密度明显较小程度的提高。
本发明细胞培养物的其他成分通常包括至少一种培养添加剂。所述培养添加剂可以是来源于牛的，如源于牛血清，并且可以包括牛血清和牛血清白蛋白(BSA)。所添加的培养添加剂的量，可以占最终细胞培养物体积的大约0.1-大约10％。
正如本文所披露的，与不含任何抗生素的慢病毒感染的宿主细胞的相同细胞培养物相比，使用新霉素可以将细胞密度提高至少大约20％，更优选提高至少大约331/3％。可以通过可接受的方法评估细胞密度，包括使用台盼兰排阻在血细胞计数器上测定。
提供下面的实施例，是为了说明本发明的一个优选方面，而不应当被理解成对本发明的范围的限定。
实施例在本实施例中，在诸如补充了源于BSA的2.5毫克/毫升ALBUMAX?的改性DMEMF12培养基或AIM V培养基的无血清培养基中，生长用猫免疫缺陷病毒(FIV)慢性感染的Fet-J细胞。在37℃下，让细胞在三角烧瓶的悬浮液中，在以150rpm的速度旋转的旋转摇床上生长。以3×105活细胞/毫升的细胞密度培养细胞。通过在血细胞计数器上进行台盼兰排阻测定细胞密度。通过用抗FIV Gp120单克隆抗体进行酶联免疫吸附测定(ELISA)完成了Gp120表达测定。评估FIV补充物(supplementation)的抗生素包括庆大霉素、新霉素和多粘菌素B。以30微克/毫升的浓度将相应的抗生素掺入培养基中。通过上述方法，以24小时为基础测定细胞密度。结果如下面的表1所示。
表1

来自表1的结果表明，补充了新霉素的细胞培养悬浮液具有最佳的总体生长和细胞密度的提高。庆大霉素没有明显的作用，每天的细胞密度大体上与对照的相同。与不使用抗生素的培养物相比，添加多粘菌素B或同时添加新霉素和多粘菌素B的培养物，实际上抑制了细胞密度，并因此可能比仅使用新霉素本身的细胞密度更小。
尽管已结合本发明的特定实施方案对本发明进行了说明，但是应当理解的是，在不超出本发明构思或范围的前提下，可以进行多种改变和改进。因此，本发明应不被视为是由上述说明书所限定的，而仅仅是由所附权利要求书的范围限定的。


用于加强细胞生长并且提高含有慢病毒感染的宿主细胞的细胞培养物的密度的组合物和方法，包括向培养物中添加合适量的抗生素，以便清除有害细菌。