专利名称：一种抗氧化功能的全缘马尾藻提取物及制备方法活性氧(Reactive oxygen species，R0S)是外源氧化剂或细胞内有氧代谢过程中产生的具有很高生物活性的含氧化合物的总称。主要包括超氧阴离子、羟自由基、臭氧、单线态氧、过氧化氢、脂类过氧化物、次卤酸、氮氧化物等。现已明确活性氧与许多慢性进展性病理现象关系密切，如衰老、肿瘤、突变、炎症、心脑缺血、动脉粥样硬化、帕金森病等。研究发现，在病理条件下，机体的抗氧化酶活性明显下降，清除ROS的能力减弱，导致ROS增多、 损伤作用加重。因此，外源抗氧化剂在临床和保健上的应用备受关注，寻找高效低毒的抗氧化剂更好服务于人类、提高人们生活质量，已成为生命科学和医学界研究热点。如今在人类食品中，应用了大量的合成抗氧化剂，经长期和广泛研究表明，这些合成抗氧化剂如叔丁基对羟基茴香醚(BHA)、二叔丁基对甲酚(BHT)、特丁基对苯二酚(TBHQ) 等都存在潜在的健康危险性，一些合成抗氧化剂已被证实较高剂量使用时有致突变和诱导肿瘤的后果，并可能导致肝肿大和其他器官的病理性损伤，与此相比，天然抗氧化剂在使用更高剂量时也有很高的安全性，而且对人体可能还具有更多的健康益处。2008年，众多中外生物学家、医学家和化学家，包括诺贝尔奖获得者在内，共同发表了《北京宣言》，指出天然抗氧化剂在防治癌症、心血管病、老年性疾病上已积累大量科学证据，增加天然抗氧化剂的摄取可大大改善健康、预防疾病，并减少医疗费用。另一方面，天然抗氧化剂也能改善或延缓食品中脂肪酸败。因此，对当今环境污染越来越严重、生活压力越来越大的社会人来说， 研究开发具有高效低毒的天然抗氧化剂具有极其重要的意义。目前，世界各国开发的大量天然抗氧化剂产品，受到了人们普遍关注，但这些产品大多数为陆生植物来源，如胡萝卜素、番茄红素、花青素、白藜芦醇、黄酮类等，这些天然抗氧化剂对不同类型活性氧的清除能力不尽相同。目前我国对天然抗氧化剂的研究基础还较薄弱，对天然可食用抗氧化剂的开发利用亟待加强。随着现代分析和分离技术应用于海洋生物资源的开发，海藻被认为是含有新型活性次生产物最丰富的来源之一。海藻生活在特殊生态环境下，普遍含有具有特殊功效的生物活性物质如酚类、吲哚类、萜类等次生化合物，是海洋天然药物和功能食品的重要来源。 多项研究表明，海藻的多种提取物具有抗氧化、抗菌、抗突变、抗过敏、抗肿瘤、抗高血脂、 HIV-I反转录酶和蛋白酶抑制活性、抗纤维蛋白溶酶抑制活性以及酪氨酸酶抑制活性等多方面的生物活性。近十年来被报道最广泛的是海藻尤其是褐藻的抗氧化活性研究，研究表明，褐藻中的褐藻多酚、硫酸多糖、类胡萝卜素(包括虾青素和岩藻黄素)具有杰出的抗氧化能力，对各种自由基和过氧化物有显著的清除效果和抑制作用，在功能食品、新药开发、食品天然防腐添加剂以及化妆品原料方面有着具大的市场前景。全缘马尾藻是一种主要分布于广东省粤西地区海域的马尾藻属褐藻，为中国特有，可食用，野生资源较为丰富，目前已有相关的养殖研究报道，但还未见其药用价值和食用价值方面的研究报道，可见还未能对其进行有效的开发利用。在全球土地资源日益珍贵的今天，从陆生植物开发天然抗氧化物由于栽培的地理要求较严、产量低、原料价格高等因素，使得各种天然植物抗氧化剂的应用受到很大的限制，相对而言，海藻资源不会占用农业用地，天然资源丰富，养殖成本较低，因此，海藻资源的开发利用必将大有作为。
本发明的目的在于提供具有抗氧化功能的马尾藻属马尾藻科海洋植物——全缘马尾藻提取物及其制备方法。为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是 全缘马尾藻为海洋植物，为中国特有种；具有抗氧化功能的全缘马尾藻提取物，是将全缘马尾藻经甲醇浸提、不同的溶剂萃取并经过超滤，最终获得不同溶剂不同分子量的提取物。一种抗氧化功能的全缘马尾藻提取物，是以全缘马尾藻为原料，经过甲醇浸提，得到粗提取液水相，将粗提液水相用正己烷洗涤得到粗提液水相，再将用正己烷洗涤得到的粗提液水相用乙酸乙酯萃取，得到水层和乙酸乙酯层提取物，将得到的水层和乙酸乙酯层提取物分别进行超滤，得到的高分子量水层提取物、低分子量水层提取物、高分子量乙酸乙酯提取物和低分子量乙酸乙酯提取物，即得到抗氧化功能的全缘马尾藻提取物。上述的全缘马尾藻提取物是以全缘马尾藻为原料，经如下具体步骤获得(1)甲醇浸提将全缘马尾藻洗净干燥，研成2(Γ30目的粉末，将粉末和甲醇按质量和体积比1 :6 10混合均勻，置摇床上室温避光提取2 3次，每次2(T30 h，过滤得到的液体经减压蒸馏浓缩除去甲醇，得粗提液水相I，所述的质量单位为克，体积单位为毫升；(2)水相I用等体积的正己烷洗涤2 3次后取水相，得粗提液水相II，用等体积的乙酸乙酯萃取粗提液水相II 2^3次，得水层提取物和乙酸乙酯层提取物；(3)将步骤(2)得到的水层提取物和乙酸乙酯层提取物分别进行超滤，得高分子量水层提取物、低分子量水层提取物、高分子量乙酸乙酯提取物和低分子量乙酸乙酯提取物，即得到抗氧化功能的全缘马尾藻提取物，所述的高分子量水层提取物和高分子量乙酸乙酯层提取物为分子量>10 K的提取物，所述的低分子量水层提取物和低分子量乙酸乙酯层提取物为分子量分子量<10 K的提取物。一种抗氧化功能的全缘马尾藻提取物的制备方法，包括如下步骤(1)甲醇浸提将全缘马尾藻洗净干燥，研成2(Γ30目的粉末，将粉末和甲醇按质量和体积比1 :6 10混合均勻，置摇床上室温避光提取2 3次，每次2(T30 h，过滤得到的液体经减压蒸馏浓缩除去甲醇，得粗提液水相I，所述的质量单位为克，体积单位为毫升；
(2)水相I用等体积的正己烷洗涤2 3次后取水相，得粗提液水相II，用等体积的乙酸乙酯萃取粗提液水相II 2^3次，得水层提取物和乙酸乙酯层提取物；
(3)将步骤(2)得到的水层提取物和乙酸乙酯层提取物分别进行超滤，得高分子量水层提取物、低分子量水层提取物、高分子量乙酸乙酯提取物和低分子量乙酸乙酯提取物，即得到抗氧化功能的全缘马尾藻提取物，所述的高分子量水层提取物和高分子量乙酸乙酯层提取物为分子量>10 K的提取物，所述的低分子量水层提取物和低分子量乙酸乙酯层提取物为分子量分子量<10 K的提取物。上述的甲醇溶液的的体积比为50、0%，所述的浓缩采用冷冻干燥方法。本发明相对于现有技术的有益效果是首次以全缘马尾藻为原料，通过不同溶剂萃取和超滤获得四种具有抗氧化功能的全缘马尾藻提取物，为全缘马尾藻的开发利用奠定 ■石出。


图1全缘马尾藻提取流程；
图2全缘马尾藻提取物对DPPH ·自由基的清除作用； 图3全缘马尾藻提取物对超氧离子的清除作用。

本实施例中，采于湛江市硇洲岛海域的全缘马尾藻为原料，洗净风干至恒重，然后研成 20目粉末备用，具体提取操作步骤如下
(1)甲醇浸提将全缘马尾藻洗净干燥，研成20目的粉末，将粉末和50%的甲醇按质量和体积比1 :6混合均勻，置摇床上室温避光提取2次，每次20 h，过滤得到的液体经减压蒸馏浓缩除去甲醇，得粗提液水相I，所述的质量单位为克，体积单位为毫升；
(2)水相I用等体积的正己烷洗涤2次后取水相，得粗提液水相II，用等体积的乙酸乙酯萃取粗提液水相II 2次，得水层提取物和乙酸乙酯层提取物；
(3)将步骤(2)得到的水层提取物和乙酸乙酯层提取物分别进行超滤，得高分子量水层提取物、低分子量水层提取物、高分子量乙酸乙酯提取物和低分子量乙酸乙酯提取物，即得到抗氧化功能的全缘马尾藻提取物，所述的高分子量水层提取物和高分子量乙酸乙酯层提取物为分子量>10 K的提取物，所述的低分子量水层提取物和低分子量乙酸乙酯层提取物为分子量分子量<10 K的提取物；
按上述方法，对200 g全缘马尾藻粉末进行了提取，获得4种提取物。实施例2
全缘马尾藻洗净风干至恒重，然后研成30目粉末备用，具体操作步骤如下
(1)甲醇浸提将全缘马尾藻洗净干燥，研成30目的粉末，将粉末和90%的甲醇按质量和体积比1 :10混合均勻，置摇床上室温避光提取3次，每次30 h，过滤得到的液体经减压蒸馏浓缩除去甲醇，得粗提液水相I，所述的质量单位为克，体积单位为毫升；
(2)水相I用等体积的正己烷洗涤3次后取水相，得粗提液水相II，用等体积的乙酸乙酯萃取粗提液水相II 3次，得水层提取物和乙酸乙酯层提取物；
(3)将步骤(2)得到的水层提取物和乙酸乙酯层提取物分别进行超滤，得高分子量水层提取物、低分子量水层提取物、高分子量乙酸乙酯提取物和低分子量乙酸乙酯提取物，即得到抗氧化功能的全缘马尾藻提取物，所述的高分子量水层提取物和高分子量乙酸乙酯层提取物为分子量>10 K的提取物，所述的低分子量水层提取物和低分子量乙酸乙酯层提取物为分子量分子量<10 K的提取物。按上述方法，对500 g全缘马尾藻粉末进行了提取，获得4种提取物。实施例3
全缘马尾藻洗净风干至恒重，然后研成25目的粉末备用。具体操作步骤如下
(1)甲醇浸提将全缘马尾藻洗净干燥，研成25目的粉末，将粉末和70%的甲醇按质量和体积比1 :8混合均勻，置摇床上室温避光提取3次，每次M h，过滤得到的液体经减压蒸馏浓缩除去甲醇，得粗提液水相I，所述的质量单位为克，体积单位为毫升；
(2)水相I用等体积的正己烷洗涤3次后取水相，得粗提液水相II，用等体积的乙酸乙酯萃取粗提液水相II 2次，得水层提取物和乙酸乙酯层提取物；
(3)将步骤(2)得到的水层提取物和乙酸乙酯层提取物分别进行超滤，得高分子量水层提取物、低分子量水层提取物、高分子量乙酸乙酯提取物和低分子量乙酸乙酯提取物，即得到抗氧化功能的全缘马尾藻提取物，所述的高分子量水层提取物和高分子量乙酸乙酯层提取物为分子量>10 K的提取物，所述的低分子量水层提取物和低分子量乙酸乙酯层提取物为分子量分子量<10 K的提取物。下面结合具体实验数据对本发明全缘马尾藻提取物的抗氧化活性做进一步说明。验证实验1 全缘马尾藻提取物的抗氧化物质含量检测
以R)lin - Ciocalteu比色法分别对实施例1中的全缘马尾藻4种提取物进行抗氧化物质含量检测(以没食子酸作为含量衡量标准)。结果显示，高分子量水层提取物、低分子量水层提取物、高分子量乙酸乙酯提取物和低分子量乙酸乙酯提取物的含量分别为1. 16、 0. 6、0. 25 和 0. 34 mg /g 海藻干品。验证实验2 全缘马尾藻提取物的总抗氧化能力检测
采用三价铁还原抗氧化能力(Ferric reducing antioxidant potential, FRAP)—紫外分光光度法检测。该方法是基于氧化还原反应，在较低的PH值下!^3+与TPTZ形成复合物(Fe3+-TPTZ),在还原物质的作用下，复合物被还原为二价铁的形式，呈现明显的蓝色，在 593 nm有最高吸收峰，并且其吸光度的变化与还原物质的含量呈比例关系，可根据吸光度大小计算样品还原能力的强弱。结果表明，实施例1中的4种提取物中(顺序如上排列)， 在相同浓度时(1. 5mg/L)总抗氧化能力分别相当于1. 724、1. 379、1. 833,0. 695 mg/L Fe2+ 的还原能力，其中最强的为高分子量乙酸乙酯层提取物。验证实验3 全缘马尾藻提取物对DPPH ·自由基的清除作用
DPPH 是一类较稳定的自由基，常用于抗氧化成分的体外抗氧化活性评价。检测结果表明，实施例1中的4种全缘马尾藻提取物都具有一定的清除DPPH ·的能力，且随着提取物浓度增加，清除率逐渐增大。如图2所示，水层提取物的清除活性高于乙酸乙酯层提取物，但高浓度时均达到了 80%以上，其中高分子量水层提取物对DPPH ·的清除能力最强，在70mg/ L时抑制率达95.58%，与阳性对照没食子酸的最高抑制率相当。EC50依次为没食子酸 (1. 35mg/L) <高分子量水层提取物(11. 610 mg/L) <低分子量水层提取物(13. 835 mg/L) <高分子量乙酸乙酯层提取物(18. 374 mg/L) <低分子量乙酸乙酯层提取物(20. 364 mg/ L)。表明实施例1中的提取物对DPPH ·具有显著的清除活性。验证实验4 全缘马尾藻提取物对超氧阴离子自由基的清除作用
采用邻苯三酚自氧化一分光光度法检测实施例1中的4种提取物对超氧阴离子自由基的清除作用(以Vc作为阳性对照)(图3)。超氧阴离子自由基是活性氧自由基链中的第一个自由基，可以经过一系列反应生成其它氧自由基，是人体中寿命较长的自由基，危害性大。 因此，也常用于抗氧化活性评价。结果表明，4种全缘马尾藻提取液都能降低邻苯三酚的自氧化速率，且随着提取物浓度增加，清除率逐渐增高。低浓度时(3mg/L)，4种提取物对超氧阴离子自由基的清除能力相当于或略高于同浓度的Vc，高浓度时，高分子量乙酸乙酯提取物对超氧阴离子的清除能力最强，可达72. 15%。其EC50依次为Vc (5. 9i;3mg/L) <低分子量乙酸乙酯层提取物(10. 331mg/L) <高分子量乙酸乙酯层提取物(17. 8iang/L) <低分子量水层提取物(24. 829 11^/1)<高分子量水层提取物(32.讨mg/L)，且在低浓度时(3mg/ L)，各提取物对超氧阴离子自由基的清除能力相当于或略高于同浓度的Vc。以上数据表明， 全缘马尾藻提取物具有显著的清除超氧阴离子作用。


本发明涉及一种抗氧化功能的全缘马尾藻提取物及制备方法，该提取物是以全缘马尾藻为原料、通过不同溶剂萃取、超滤所获得的不同分子量段的、具有抗氧化活性的有效成分；具体方法是将全缘马尾藻干燥粉碎，经过甲醇浸提，得到粗提取液水相，将粗提液水相用正己烷洗涤得到粗提液水相，再将用正己烷洗涤得到的粗提液水相用乙酸乙酯萃取，得到水层和乙酸乙酯层提取物，将得到的水层和乙酸乙酯层提取物分别进行超滤，得到的高分子量水层提取物、低分子量水层提取物、高分子量乙酸乙酯提取物和低分子量乙酸乙酯提取物，即得到抗氧化功能的全缘马尾藻提取物；这些提取物具有极佳的抗氧化活性，从而为全缘马尾藻的开发利用奠定了良好基础。