专利名称：一种芽孢杆菌及采用该菌种生产透明质酸酶的方法透明质酸酶是能够降解透明质酸的一类酶，Karl Meyer根据透明质酸酶的作用机制，将透明质酸酶分为三类(1)内切β_Ν-乙酰氨基葡糖苷酶为水解酶，作用于β_1，4糖苷键，终产物主要为四糖，也可作用于软骨素或硫酸软骨素，并有转糖苷酶活性，睾丸、蜂毒以及溶酶体透明质酸酶属于此类。(2)水蛭、十二指肠虫来源的透明质酸酶，为内切β-葡糖苷酸酶，作用于β _1，3糖苷键，也是水解酶，主要降解产物是四糖，特异性降解透明质酸。(3)细菌透明质酸酶，也称透明质酸裂解酶，作用于β_1，4糖苷键。目前市场上的透明质酸酶主要是动物来源的透明质酸酶，用于人体暂时降低细胞间质的粘性，可促使皮下输液、局部积贮的渗出液或血液加快扩散而利于吸收，为一种重要的药物扩散剂。临床用作药物渗透剂，促进药物的吸收，促进手术及创伤后局部水肿或血肿消散。由于动物来源的透明质酸酶成本高，而且人们担心动物病毒感染的风险，多家提取法制备透明质酸酶制剂的厂家已停止该制剂的生产，人们希望使用更安全价廉的透明质酸酶。微生物来源的透明质酸酶不受来源限制，提取容易，纯度高，不易产生免疫反应，可以满足人们的这种需求，因此多家研究机构致力于研究微生物发酵法制备透明质酸酶。自透明质酸酶发现以来，人们发现多种微生物可以产生透明质酸酶，包括 Streptococcus、Staphylococcus、Clostridium、Propionibacterium^ Peptostreptococcus 以及Streptomyces等，但是迄今为止，文献中报道的微生物产的透明质酸酶酶活均较低， 较高的酶活报道出现在专利W02010130810A1中，该专利中透明质酸酶生产菌是链霉菌，最高酶活是1. 3 X 102IU/ml，其余文献的酶活均低于100IU/ml，因此制备透明质酸酶及酶法制备低分子透明质酸及寡聚透明质酸都处于实验室规模，不能用于大规模生产。
为了解决现有透明质酸酶生产工艺少，且所得的透明质酸酶酶活低的问题，本发明提供了一种生产高活性透明质酸酶的菌种——芽孢杆菌OfeciBm )A50。本发明还提供了采用该芽孢杆菌OfeciBm) A50生产透明质酸酶的方法，以该菌种生产透明质酸酶，酶活高，可用于大规模生产，并且解决了动物来源的透明质酸酶成本高的问题，便于大规模工业化生产。所得的透明质酸酶可用于降解高分子透明质酸，生产低分子透明质酸及寡聚透明质酸，应用前景广阔。本发明的芽孢杆菌(ifeciBm) A50是从空气中分离得到，因为无法重复得到，所以该菌种已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏，保藏号为CGMCC NO. 5744，保藏时间为2012年2月8日。菌种芽孢杆菌UaciBm)A50 CGMCC NO. 5744的获取过程为将装有富集培养基的平皿打开盖，放置于空气中，收集空气中沉降菌，约1小时后，盖上盖，置于25 40°C 培养箱中有氧培养，培养M小时后，将分离得到的单菌落接种于筛选培养基中，25 40°C， 150rpm，有氧培养12 16小时，采用中国药典方法测定透明质酸酶活力，选择酶活力最高的菌种作为本发明的菌种，菌种酶活力可达IO5 IU/ml。上述所采用的各培养基组成如下富集培养基(IOOml)蛋白胨0. 2 2. 0g，酵母粉0. 2 2. Og, K2HPO4 · 3H20, MgSO4 · 7H20 0. 05 0. 15g、透明质酸钠 0.01 ~ Ig,琼脂粉 2g。筛选培养基(100ml):蛋白胨0. 2 2. 0g，酵母粉 0. 2 2. 0g，K2HPO4 ·3Η20 0. 05 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. 05 0. 15g，透明质酸钠 0. 01 Igo筛选所得的芽孢杆菌UaciBm)A50 CGMCC NO. 5744具有如下的特征 1、形态特征菌体杆状，单个或链状。菌落乳白色，有皱褶。2、分子生物学特征菌种A50的16S rDNA序列如SEQ NO: 1所示。本发明菌种适于在25、0°C下进行有氧培养，该菌种可以用来生产透明质酸酶，方法是将芽孢杆菌CGMCC No. 5744经斜面培养、种子培养、发酵培养制得透明质酸酶。具体包括以下步骤(1)将芽孢杆菌CGMCC No. 5744菌种进行斜面培养，得斜面菌种；
(2)取斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在25 40°C、100 200rpm的条件下培养10 Mh，得种子液；
(3)将种子液接种到已灭菌的发酵培养基中，在25 40°C、100 300rpm的条件下培养12 Mh，得透明质酸酶。上述生产透明质酸酶的方法中，每100ml斜面培养基中含有以下成分蛋白胨 0. 2 2. 0g，酵母粉 0. 2 2. 0 g, K2HPO4 ·3Η20 0. 05 0. 15 g, MgSO4 ·7Η20 0. 05 0. 15 g，葡萄糖0. 5 1. 5 g，琼脂粉2g，pH调至6. 0 8. 0，斜面培养的温度为25 40°C。上述生产透明质酸酶的方法中，每100ml种子培养基中含有以下成分蛋白胨 0. 2 2. 0g，酵母粉 0. 2 2. 0 g, K2HPO4 ·3Η20 0. 05 0. 15 g, MgSO4 ·7Η20 0. 05 0. 15 g，葡萄糖0. 5 1. 5 g, pH调至6. 0 8. 0。上述生产透明质酸酶的方法中，每100ml发酵培养基中含有以下成分蛋白胨 0. 2 2. Og,酵母粉 0. 2 2. 0 g, K2HPO4 · 3H20 0. 05 0. 15 g, MgSO4 · 7H20 0. 05 0. 15 g，葡萄糖 0. 5 1. 5 g，吐温 80 0. 05ml，pH 调至 6. 0 8. 0。上述生产透明质酸酶的方法中，斜面种子培养和发酵培养的接种量可以通过现有技术得到，不需付出创造性的劳动。种子培养基的接种量能够达到发酵培养所需接种量的种子液即可，发酵培养基的接种量一般在3-15%即可。上述生产透明质酸酶的方法中，可采用盐酸、硫酸或磷酸中的一种或一种以上调节斜面培养基、种子培养基和发酵培养基PH。本发明提供了一种高活性的芽孢杆菌菌种，该菌种是从空气中富集、筛选而来的， 可用于生产透明质酸酶，在现有技术中未见报道。该芽孢杆菌所产生的透明质酸酶活性高，可达到105IU/ml，与现有技术相比，采用本发明中的芽孢杆菌制备的透明质酸酶活性高， 热稳定高，PH稳定性高，可用于大规模生产，同时得到的透明质酸酶可降解高分子透明质酸，用来制备低分子透明质酸及寡聚透明质酸，成本显著降低，解决了动物来源的透明质酸酶成本高的问题，在生化研究领域及低分子透明质酸和寡聚透明质酸的生产方面有广阔的应用前景。保藏信息
本发明芽孢杆菌(ifeciBm) A50已于2012年2月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC NO. 5744。

斜面培养基组成(100ml):蛋白胨 0. 2g，酵母粉 2. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. 05g, MgSO4 · 7H20 0. 05g，葡萄糖0. 5g，琼脂粉2g，用盐酸将pH调至6. 0。种子培养基组成(100ml)蛋白胨0. 2g，酵母粉 2. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. 05g, MgSO4 ·7Η20 0.05g，葡萄糖0. 5g，用盐酸将pH调至6. 0。发酵培养基组成(100ml)蛋白胨0. 2g，酵母粉 2. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. 05g, MgSO4 · 7H20 0. 05g，葡萄糖0. 5g，Tween80 (吐温80) 0. 05ml。所有培养基均以水为溶剂。取斜面菌种(芽孢杆菌UaciBm)A50 CGMCC NO. 5744)接种于已灭菌的种子培养基中，25°C，150rpm培养M小时，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为 10%, 250C，200rpm培养M小时，发酵过程中用硫酸将pH维持在6. 0，发酵生产得到发酵液， 发酵液中含有透明质酸酶，可以直接应用，也可以为了满足要求纯化后再应用。采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力，透明质酸酶的活力为1. 2X105IU/ml。实施例2
斜面培养基组成(100ml)蛋白胨 1. 0g，酵母粉 1. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. lg, MgSO4 · 7H20 0. lg，葡萄糖1.(^，琼脂粉28，用磷酸将？!1调至7.0。种子培养基组成(100ml)蛋白胨1. 0g，酵母粉 1. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. lg, MgSO4 · 7H20 0. lg,葡萄糖1. Og用磷酸将pH调至7. 0。发酵培养基组成(100ml)蛋白胨1. 0g，酵母粉 1. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. lg, MgSO4 · 7H20 0. lg，葡萄糖 1. 0g, Tween80 0. 05ml,。取斜面菌种(芽孢杆菌UaciB^s)A50 CGMCC NO. 5744)接种于已灭菌的种子培养基中，300C，IOOrpm培养15小时，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为 10%, 350C，300rpm培养16小时，发酵过程中用硫酸将pH维持在7. 0，发酵生产得到透明质酸酶，采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力，透明质酸酶的活力为2. SXlO5IU/ ml ο实施例3
斜面培养基组成(100ml):蛋白胨 1. 5g，酵母粉 1. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. 15g，葡萄糖1.58，琼脂粉28，用硫酸将？!1调至8.0。
5
种子培养基组成(100ml)蛋白胨1.5g，酵母粉 1.5g，Κ2ΗΡ04· 3H20 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. 15g，葡萄糖1. 5g，用硫酸将pH调至8. 0。
发酵培养基组成(100ml)蛋白胨0. 5g，酵母粉 1. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. lg, MgSO4 · 7H20 0. 05g，葡萄糖 1. 5g, Tween80 0. 05ml。
取斜面菌种(芽孢杆菌UaciB^s)A50 CGMCC NO. 5744)接种于已灭菌的种子培养基中，350C，200rpm培养13小时，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为 10%, 400C，IOOrpm培养12小时，发酵过程中用盐酸将pH维持在7. 0，发酵生产得到透明质酸酶，采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力，透明质酸酶的活力为1.8X105IU/ ml ο
实施例4斜面培养基组成(100ml):蛋白胨 2. 0g，酵母粉 0. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 05g, MgSO4 · 7H20 0. 05g，葡萄糖1. Og,琼脂粉2g，用硫酸将pH调至6. 5。
种子培养基组成(100ml)蛋白胨2. 0g，酵母粉 0. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 05g, MgSO4 · 7H20 0. 05g，葡萄糖1. 0g，用硫酸将pH调至6. 5。
发酵培养基组成(100ml)蛋白胨1. 5g，酵母粉 0. 2g，K2HPO4 · 3Η200· 15g, MgSO4 · 7H20 0. 15g，葡萄糖 1. 5g, Tween80 0. 05ml。
取斜面菌种(芽孢杆菌UaciB^s)A50 CGMCC NO. 5744)接种于已灭菌的种子培养基中，400C，ISOrpm培养10小时，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为 10%, 360C，280rpm培养15小时，发酵过程中用磷酸将pH维持在8. 0，发酵生产得到透明质酸酶，采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力，透明质酸酶的活力为1.5X IO5IU/ ml ο
实施例5斜面培养基组成(100ml):蛋白胨 0. 5g，酵母粉 1. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. lg，葡萄糖0.58，琼脂粉28，用磷酸将？!1调至7.5。
种子培养基组成(100ml)蛋白胨0. 5g，酵母粉 1. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. lg，葡萄糖0. 5g，用磷酸将pH调至7. 5。
发酵培养基组成(100ml)蛋白胨2. 0g，酵母粉 0. 2g，K2HPO4 · 3H20 0. 05g, MgSO4 · 7H20 0. 05g，葡萄糖 0. 5g, Tween80 0. 05ml。
取斜面菌种(芽孢杆菌UaciB^s)A50 CGMCC NO. 5744)接种于已灭菌的种子培养基中，360C，120rpm培养14小时，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为 10%, 300C，ISOrpm培养20小时，发酵过程中用磷酸将pH维持在7. 5，发酵生产得到透明质酸酶，采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力，透明质酸酶的活力为2. 5X105IU/ ml ο
实施例6斜面培养基组成(100ml)蛋白胨 1. 0g，酵母粉 1. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. lg, MgSO4 · 7H20 0. 15g，葡萄糖1.58，琼脂粉28，用盐酸将？!1调至7.0。
种子培养基组成(100ml)蛋白胨1. 0g，酵母粉 1. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. lg, MgSO4 ·7Η20 0. 15g，葡萄糖 1.58，用盐酸将？!1调至7.0。
发酵培养基组成(100ml)蛋白胨1. 5g，酵母粉 0. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 05g,MgSO4 · 7H20 0. 15g，葡萄糖 1. 5g, Tween80 0. 05ml。
取斜面菌种(芽孢杆菌UaciB^s)A50 CGMCC NO. 5744)接种于已灭菌的种子培养基中，320C，150rpm培养18小时，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为 10%, 280C，200rpm培养22小时，发酵过程中用盐酸将pH维持在8. 0，发酵生产得到透明质酸酶，采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力，透明质酸酶的活力为1.6X105IU/ ml ο
实施例7斜面培养基组成(100ml):蛋白胨 2. 0g，酵母粉 1. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 05g, MgSO4 · 7H20 0. 15g，葡萄糖0.58，琼脂粉28，用磷酸将？!1调至7.0。
种子培养基组成(100ml)蛋白胨2. 0g，酵母粉 1. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 05g, MgSO4 ·7Η20 0. 15g，葡萄糖0. 5g，用磷酸将pH调至7. 0。
发酵培养基组成(100ml)蛋白胨0. 5g，酵母粉 1. 5g，K2HPO4 · 3Η200· 15g, MgSO4 · 7H20 0. lg，葡萄糖 1. Og, Tween80 0. 05ml。
取斜面菌种(芽孢杆菌UaciB^s)A50 CGMCC NO. 5744)接种于已灭菌的种子培养基中，300C，200rpm培养20小时，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为 10%, 34°C，220rpm培养14小时，发酵过程中用磷酸将pH维持在7. 5，发酵生产得到透明质酸酶，采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力，透明质酸酶的活力为2. IXlO5IU/ ml ο


本发明公开了一种芽孢杆菌(Bacillus)A50 CGMCC No.5744及采用该菌种生产透明质酸酶的方法，该方法为将芽孢杆菌(Bacillus)A50 CGMCC No.5744经斜面培养、种子培养、发酵培养制得透明质酸酶。该芽孢杆菌所产生的透明质酸酶活性高，可达到105IU/ml,与现有技术相比，采用本发明中的芽孢杆菌制备的透明质酸酶活性高，热稳定高，pH稳定性高，可用于大规模生产，同时得到的透明质酸酶可降解高分子透明质酸，用来制备低分子透明质酸及寡聚透明质酸，成本显著降低，解决了动物来源的透明质酸酶成本高的问题，在生化研究领域及低分子透明质酸和寡聚透明质酸的生产方面有广阔的应用前景。