专利名称：一种通过促进活性蛋白聚集体解聚提高淀粉脱支酶产量的方法淀粉脱支酶(E. C. 3. 2. I. 41)是一类能够水解支链淀粉、a _极限糊精等分子中 a _1，6葡萄糖苷键的淀粉水解酶。淀粉脱支酶通常和其它淀粉酶复配用于生产葡萄糖、果糖、麦芽糖、麦芽糊精、低聚糖等产品。淀粉脱支酶可以切断淀粉中的分支点，加速后续酶的反应，缩短反应时间，提高淀粉的转化率，降低其它糖化用酶制剂的使用量，从而达到增加产量、提高设备利用率、降低生产成本的目的。目前能够在最适温度和最适PH上同时实现与糖化酶进行较好配合的商品化淀粉脱支酶主要是美国杰能科公司的Optimax L-1000。我国虽然对淀粉脱支酶进行了大量的研究，但是还没有实现该酶的工业化生产，还需要依赖进口。近年来国内外学者把淀粉脱支酶的开发研究作为非常重要的研究主题。Bunzo Mikami等对来源于Klebsiella pneumoniae的淀粉脱支酶蛋白晶体结构进行解析,发现该酶具有GH13淀粉水解酶家族共有的(P/a)8桶状结构。近年来国外学者从极端嗜热微生物中分离出具有可以耐受接近100°C高温的淀粉脱支酶，但是这些酶往往只有在pH 6.0以上才具有较高的活性。R Koch等从Fervidobacterium pennavorans中分离到最适pH在4.5到5. 0，而且能够在70°C条件下具有较高稳定性的淀粉脱支酶。国内主要研究了产淀粉脱支酶野生菌的筛选鉴定、重组菌构建、发酵条件优化以及在淀粉原料酶解中的应用。唐宝英等人从土壤中分离出一株产淀粉脱支酶芽孢杆菌，通过诱变和产酶条件优化，酶活从I.6U/mL提高到8. 8U/mL，该酶最适反应温度和pH分别为75°C和4. 6，在55°C反应条件下， 在pH4. 0-8. 0范围内活性稳定。张明炎等将来源于地衣芽孢杆菌的淀粉脱支酶编码基因克隆大肠杆菌中进行表达，摇瓶发酵产酶最高达到6. 5U/mL。苏品等实现了来源于Thermotoga maritima的淀粉脱支酶编码基因在枯草芽孢杆菌中的成功表达，该酶最适温度90°C，最适 pH 6.0，发酵酶活可达89. lU/mL。但是这些菌株的产酶水平仍然较低，生产成本高。
本发明要解决的技术问题是提供一种通过促进活性蛋白聚集体解聚提高淀粉脱支酶产量的方法，以解决现有发酵工艺中胞外酶活较低、生产成本高、无法实现工业化生产的问题。为解决上述问题，本发明的技术方案如下(I)重组菌构建根据NCBI上登录的pulB的基因序列(Genbank号JN872757. I)，采用化学全合成方法合成淀粉脱支酶基因序列pulB。用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET20b (+)，带有17启动子。将pET20b(+)质粒和含有pulB基因的质粒分别进行Nco I和HindIII双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶连接，连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，经 37°C培养8h，挑转化子在含有100mg/L氨苄青霉素液体的LB中振荡培养，提取质粒，酶切验证得到表达质粒pulB/pET20b (+)。将质粒pulB/pET20b(+)转化E.coli BL21 (DE3)宿主菌，涂布含氨苄青霉素 (100mg/L)的LB平板上，37°C培养8h，命名为pulB/pET20b (+)/BL21 (DE3)。挑单菌落至液体LB中，37°C培养过夜，保存甘油管。(2)种子制备将_80°C甘油管保存的菌株接入种子培养基中，使用回转恒温调速摇床进行培养， 控制转速200rpm/min，培养温度37°C，初始pH值7. 10，培养时间10小时。⑶发酵工艺将活化后的种子培养液接种入发酵培养基中，通过控制搅拌转速和通风量使溶氧维持20-30 %，控制温度为30土 1°C，流加质量浓度为25 %的氨水控制pH 7. 0±0. 5，培养 5-6小时；待溶氧上升至80-100%，以指数流加的方式补加补料液使溶氧维持在20-30%， 温度维持在30± I °C，流加氨水控制pH 7. 0±0. 5，当菌体OD6tltl达到15-30时补加0.75-1.5% (m/V)的甘氨酸；继续培养至菌体吸光度OD6tltl达到45-60时，降温至23_30°C，通过补加浓度为 200g/L乳糖溶液，使发酵液剩余乳糖浓度控制在4-6g/L。同时溶氧控制在20-30 %，控制 pH 7. 0±0. 5，诱导15小时左右，添加0. 1-1. 0%浓度的Tween 80，继续发酵1-10小时。所述种子培养基的组成为工业级蛋白胨10g/L，工业级酵母粉5g/L，NaCL IOg/ L，pH 7. 10，种子培养基还可以添加100mg/L氨苄青霉素。所述发酵培养基的组成为甘油6g/L，工业级蛋白胨12g/L，工业级酵母粉24g/L， KH2P042. 31g/L，K2HP043H20 16. 43g/L，微量元素液 10mL/L，发酵培养基还可以添加 100mg/L氨苄青霉素。所述微量元素液为=FeSO4 7H20 10g/L，ZnSO4 7H20 2. 25g/L，CuSO4 5H20 I. Og/ L, MnSO4 4H20 0. 5g/L, Na2B4O7 IOH20,0. 23g/L, CaCl2 2. Og/L, (NH4)6Mo7O24O. lg/L。所述补料液为甘油500g/L，MgSO4 7H20 20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L。所述甘油补料液质量分数为50% (500g/L);甘油含量的测定方法采用HPLC : Zorbax Extend_C18 (4. 6mmX 250mm, 5 u m),柱温 35 °C，进样量10 u L,差不折光检测器温度35°C,流速1. OmL/min，流动相纯水；发酵培养4小时后，每隔I小时,对发酵液中甘油浓度进行一次测定，根据测定结果加入一定体积的补料液，使发酵液中甘油浓度维持在2-5g/L。所述发酵液中乳糖浓度的测定方法参见GB/T 5413. 5-1997 ;每隔I小时，对发酵液中乳糖浓度进行测定，根据结果加入一定体积的乳糖诱导液，使发酵液中乳糖浓度维持在 4-6g/L。本发明采用添加Tween 80结合其它发酵控制工业(如分段控温发酵工艺、恒定溶氧控制工艺、PH控制工艺、补料分批发酵控制工艺、诱导控制工艺)，促进重组大肠杆菌活性蛋白聚集体解聚，实现了胞外高效发酵生产淀粉脱支酶，发酵结束后胞外重组淀粉脱支酶酶活为386U/mL。由于淀粉脱支酶分泌到培养基中，菌体经过简单的过滤就可得到酶液，工艺简单易行，减少了后续提取成本，适合工业化生产。

5
补料发酵阶段待溶氧上升至80-100%，批式培养结束后，以指数流加的方式补加以甘油为碳源的补料液(甘油500g/L，MgSO4 *7H20 20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)， 使菌体以021T1的比生长速率进行生长，控制温度30°C，溶氧维持在30%，当菌体0D_达到 15，采用一次性添加的方式，加入0. 75%甘氨酸(质量体积分数)，流加质量浓度为25%的氨水控制pH 7. 0 ；诱导培养阶段当菌体0D_达到50时，将温度降为25°C，溶氧维持在30%，连续补加0. 3g L-1 IT1乳糖,每5h降低10%的乳糖流速,通过补加浓度为200g/L乳糖溶液， 使发酵液剩余乳糖浓度控制在4-6g/L。同时溶氧控制在20-30%，控制pH 7.0±0. 5，诱导 15小时左右，添加0. 5%浓度的Tween 80，继续发酵5小时。发酵培养结束后，离心获得菌体和胞外上清液，菌体经过超声破碎后离心，得到超声破碎上清和超声破碎沉淀，沉淀用0. IM pH4. 5醋酸buffer悬浮。分别测定胞外上清液、 超声破碎上清和超声破碎沉淀悬浮液的淀粉脱支酶活力。胞外上清酶活为386U/mL，超声破碎上清酶活为82U/mL，超声破碎沉淀悬浮液酶活为51U/mL。结果表明，TweenSO的添加促进了胞内活性蛋白聚集体的解聚，提高了淀粉脱支酶的胞外分泌效率。


本发明公开了一种通过促进活性蛋白聚集体解聚提高淀粉脱支酶产量的方法，属于发酵工程技术领域。本发明以重组大肠杆菌pulB/pET20b(+)/BL21(DE3)为生产菌株，在工业级发酵培养基中连续流加甘油进行分批补料发酵，发酵后期通过添加Tween 80来促进活性蛋白聚集体解聚提高酶的分泌，发酵35小时，胞外酶活可达386U/mL。采取本策略进行发酵实现了酶的高效胞外表达，大幅提高了生产强度。由于酶分泌到培养基中，菌体经过简单的过滤就可得到酶液，工艺简单易行，减少了后续提取成本，适合工业化生产。