专利名称：黄瓜果实苦味基因Bt紧密连锁的SSR标记及其应用的制作方法黄瓜(Cucumis sativus L.)生产中,特别是设施栽培过程中,有时会有苦味果实产生，导致收益损失(Rehm et al.，1957 ;顾兴芳等，2000 ;Kano et al.，2002)。瓜类植物的苦味是由一类称为葫芦素(Cucurbitacins)的物质引起(Rice et al. , 1981 ；Balkema etal.，2003)。葫芦素属于葫芦烷型四环三萜化合物，对大多数生物体有毒(Smyth et al.，2002)。果实苦味是影响黄瓜生产的问题之一。荷兰黄瓜育种家早在1959已经开始无苦味黄瓜的选育工作，并育成相应的品种，这些品种的营养器官和果实均无苦味(AndeweG andBruyn, 1959)。研究导致黄瓜果实苦味发生的基因的分子标记和遗传定位，对于利用分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection, MAS)技术培育无苦味黄瓜具有重要意义。已报道的控制黄瓜果实苦味的两个基因是Bt和Bt-2 (Barham, 1953 ；ffalters,2001)。本实验室保存的黄瓜材料PI183967 (基因型为BiBiBtBt)含有Bt基因。前人关于黄瓜果实苦味的研究多集中于遗传规律、基因连锁、环境影响、品种选育等方面。已有研究表明，Bt和Bt-2基因均符合单基因显性遗传，符合质量性状遗传的特点(Barham，1953 ；InGGamer and Deponti, 1981 ;Walters et al.,2001)。Bt 基因与黄瓜雌性基因 F 不存在连锁(Cowen and Helsel，1983 ;顾兴芳等，2005)。Bt_2基因与果色一致基因U、暗色果皮基因D、小刺基因ss连锁(Wehner and Liu, 1998 ；ffalters et al.，2001)。栽培条件影响黄瓜苦味的发生(Kano et al.，2003)，当土壌中的氮素过多或不足、有机肥缺乏、温度过低或过高、日光照射不足、营养不良、上壤干旱缺水、病虫害以及植株衰弱多病等条件下，都可诱发葫芦素的形成和积累，从而形成苦味果实。对于黄瓜果实苦味决定基因Bt分子水平的研究主要是由本实验室开展进行的。我们从分子水平对果实苦味基因进行了研究并获得了与Bt基因连锁的两个显性AFLP标记E23M66-101和E25M65-213。这两个标记与Bt基因的遗传距离分别为5cM和4cM，并且位于Bt基因的两侧(顾兴芳等，2006)。2011年以果实无苦味的黄瓜纯合自交系新泰密刺(btbt)和果实有苦味46GBt (BtBt)为亲本构建的含有184个单株的F2群体为试材，对其进行SSR标记遗传连锁分析，构建了 Bt基因的SSR连锁群。与Bt基因最近的两侧标记为SSR10795和SSR07081，遗传距离分别为O. 8cM和2. 5cM (张圣平等，2011)。但是上述标记还存在连锁距离相对较远，且标记的检测准确率相对较低的问题，在进行无苦味黄瓜育种筛选中的选择效率相对较低。黄瓜果实苦味的遗传比较复杂，受到营养体苦味基因Bi的影响，隐性bi基因与Bt基因存在互作效应(Gu et al.，2007)。但在纯合Bi基因背景下，Bt基因是独立遗传的(Barham, 1953 ；ffalters and Wehner, 1998 ；Gu et al.，2007)。为了排除黄瓜营养体苦味基因对果实苦味基因的互作影响，本发明中利用营养体苦味基因纯合的基因型，进行了果实苦味Bt基因的SSR分子标记及遗传定位研究。目前检测黄瓜苦味的方法多为感观品尝和化学检测，化学检测虽可检测大批材料但较为繁琐，其结果也不够准确；感观品尝仅适于少量材料的检测，并且无法进行精确定级(顾兴芳等，2004)，所以急需建立ー套快速准确鉴定苦味的方法，为培育无苦味黄瓜提供理论依据。分子标记辅助选择(MAS)技木通过找到与苦味基因紧密连锁的分子标记可在苗期或直接用种子进行鉴定，简エ节本，大大缩短育种进程。
本发明的目的在于克服现有技术不足，提供了与黄瓜果实苦味基因Bt紧密连锁的SSR标记，并提供了其在选择无苦味黄瓜种质资源上的应用，采用本发明获得的SSR标记，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行果实苦味或果实无苦味的筛选，具有高效、限制少、准确的优点，为黄瓜育种选择无苦味材料提高了选择效率和准确性。 黄瓜果实苦味基因Bt紧密连锁的SSR标记，序列如下SSR2I558-F/SSR2I558-R:GTGGGGGATGTGATTCAGAC/CATCATCCATTCCCCTCAAC (SeqID No. 5和SEQ ID No. 6)，其扩增的特征条带如Seq ID No. I和Seq ID No. 2所示。其中Seq ID No. I所示175个核苷酸的片段与果实苦味基因Bt连锁，Seq ID No. 2所示192个核苷酸的片段与果实不苦基因bt连锁。SSR20054-F/SSR20054-R:GTTTGTGAGGGAAACGCAAT/TCAAAAAGCTTCCTTCCTTCA (SeqID No. 7和SEQ ID No. 8)，其扩增的特征条带如Seq ID No. 3和Seq ID No. 4所示。其中Seq ID No. 3所示的127个核苷酸的片段与果实苦味基因Bt连锁，Seq ID No. 4所示108个核苷酸的片段与果实不苦基因bt连锁； 上述SSR标记在筛选含有无果实苦味基因Bt的黄瓜种质资源中的应用，其步骤如下(I)采用上述SSR标记为引物对黄瓜品种待选材料的基因组DNA分别进行PCR扩士豳>曰，(2)对扩增结果进行凝胶电泳检测，(3)从凝胶电泳检测的结果中选出没有出现所述果实苦味特征条带的材料。所述PCR扩增的体系Green Master Mix 5 μ L, 15ng DNA,正向、反向引物各30nG，其余以ddH20补足至IOyL;PCR扩增的程序为94°C预变性4min ;94°C变性15s ;55°C退火15s ;72°C延伸30s 35个循环；72°C保温5min。所述凝胶电泳检测指采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于160V恒功率电泳分离，最后银染显色。本发明以果实有苦味的野生黄瓜PI183967 (Cucumis sativus var. hardwickii)和果实无苦味的黄瓜931纯合新泰密刺选系(btbt)为亲本构建的含有189个单株的F2群体为试材，对其进行SSR标记遗传连锁分析(图1，2)，构建Bt基因的SSR连锁群(图3)。该连锁群中与Bt基因最近的两侧的连锁标记之ー为SSR21558，遗传距离为O. 5cM ;另ー标记SSR20054，遗传距离为I. OcM0经不同遗传背景材料验证，标记SSR21558检测结果与田间表现型相比验证的准确率为为95%，SSR20054标记的准确率为75%，使用两标记相互印证进行验证的准确率可达95%。与Bt基因紧密连锁的标记SSR21558和SSR20054可用于对黄瓜品种候选材料快速筛选，特别是可以对黄瓜苗期的材料或种子直接进行分子鉴定从而选出无果实苦味基因的黄瓜材料，不需要等到黄瓜开花结果时对其果实进行品尝来判断。分子鉴定比人工品尝的结果更准确，不受其它因素干扰，而且省エ省时，不受季节影响，大大地缩短了育种周期。为了达到本发明上述的进行黄瓜果实无苦味材料的筛选目的，两个SSR标记可单独用于候选材料的筛选。本发明进一歩提供了两个SSR标记相互印证的筛选方法，提高了候选材料的选择准确性。
图I. SSR21558对黄瓜亲本材料及F2群体随机单株的检测结果 P1 :PI183967(苦);P2:931(不苦)；图2. SSR20054对对黄瓜亲本材料及F2群体随机单株的检测结果P1 :PI 183967(苦);P2:931(不苦)；图3.黄瓜Bt基因F2群体连锁图

在超净工作台上加样，混匀反应物，暂短离心，16°C连接约lh，过夜也不影响连接效率。(4)连接产物的转化I)取出感受态细胞，SolutionA, SolutionB，置于冰上融化；2)感受态(50 μ L) +5 μ L SolutionA+4 μ L SolutionB+46 μ L 预冷去离子水;3)用冷却的无菌枪头将上述悬浮液分装到I. 5mL离心管，每管加入105 μ L，再加入5 μ L的目的DNA，轻旋混匀；4) 42°C水浴热激90s，注意不要晃动离心管；5)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却3 5min ；6)加入500 μ L LB液体培养基。在37°C，150rpm摇床上预培养Ih ；7)将菌液涂布到含有 100 μ G ^mr1Amp,25 μ G ·ι じ1 IPTG 和 40 μ G mL^X-GAL 的 LB固体培养基上，用一无菌的弯头玻棒轻轻的将菌液均匀涂开，置于室温直至液体被吸收；8)倒置平板，37°C培养12 16h。(5)重组质粒的蓝白斑筛选经37°C培养后，在涂布X-Gal/IPTG的LB平板上出现少量蓝色菌落和较多的白色菌落，其中白色菌落为重组克隆子。挑取白色单菌落涂抹在划好方格的LB液体培养基中，37°C,150rpm过夜培养。(6)菌落PCR的检测吸取I μ L菌液作为模板进行PCR扩增。取4 μ L PCR产物，经I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，与PCR Marker标准分子量相比较检测插入片段的大小，与插入目的片段大小一致的克隆即为阳性克隆。(7)克隆后载体的测序与分析取3个阳性克隆菌液在甘油(330 μ L甘油中加入1000 μ L菌液)中各保存两份，一份-20°C保藏，ー份送去测序。实施例2. Bt基因双侧翼SSR标记的验证利用本课题收集的20份不同生态类型的黄瓜材料，对与Bt基因两侧紧密连锁标记进行验证确定标记SSR21558和SSR20054用于分子标记辅助选择的准确性。这20个单株的表型为18株果实不苦；2株果实苦。利用标记SSR21558分析结果表明，在20份材料中均扩增出目的条带，与田间表现型相比，检测的正确率为95. 0%。将与Bt基因连锁的另ー标记SSR20054对上述材料进行验证，在20份DNA中均扩增出目的条带，与田间表现型相比，检测的正确率为75. 0%，使用两标记相互印证进行验证的准确率可达95. 0 %。本研究中构建了黄瓜果实苦味Bt基因的SSR连锁图，所获得的SSR标记(SSR21558和SSR20054)与Bt的遗传距离分别O. 5cM和I. OcM，这两个与黄瓜果实苦味基因紧密连锁的SSR标记为黄瓜分子标记辅助选择育种奠定良好的基础。


本发明“黄瓜果实苦味基因Bt紧密连锁的SSR标记及其应用”，涉及生物育种辅助技术。标记序列如下SSR21558-F/SSR21558-R:GTGGGGGATGTGATTCAGAC/CATCATCCATTCCCCTCAAC，其扩增的特征条带如Seq ID No.1所示(175bp)和Seq ID No.2所示(192bp)。SSR20054-F/SSR20054-RGTTTGTGAGGGAAACGCAAT/TCAAAAAGCTTCCTTCCTTCA，其扩增的特征条带如Seq ID No.3所示(127bp)和Seq ID No.4所示(108bp)。本发明的两个标记与Bt基因的连锁更加紧密，对于黄瓜果实苦味的分子标记辅助育种体系的建立更有帮助；采用本发明获得的SSR标记，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行果实苦味或果实无苦味的筛选，具有高效、限制少、准确的优点，为黄瓜育种选择无苦味材料提高了选择效率和准确性。