简单高效制备人γδT细胞的方法_王宇环专利（制备,高效,细胞）-早鸽网

一种简单高效制备人γδT细胞的方法

专利名称

一种简单高效制备人γδT细胞的方法
发明者

王宇环, 罗晓玲, 马飞
公开日

2012年7月4日
申请日期

2012年2月10日
优先权日

2012年2月10日
申请人

深圳市合一康生物科技有限公司
文档编号

C12N5/0783GK102533649SQ20121003019
关键字

制备高效细胞简单
权利要求

1.一种简单高效制备人Y S T细胞的方法，其特征在于(1)用培养的结核杆菌制备结核杆菌耐热性抗原；(2)用制备的Mtb-HAg刺激PBMCs，同时加入细胞因子rhIL_2和 rhIL-21 ；(3)细胞培养72小时后进行半量更换培养液，以后根据细胞生长状态，每2 3天进行补加培养液；(4)根据细胞生长状态，第10 15天收获细胞2.根据权利要求1所述一种简单高效制备人YS T细胞的方法，其特征在于，所述结核杆菌耐热性抗原的制备方法为经高压蒸汽处理、离心超滤制备3.根据权利要求1所述一种简单高效制备人YS T细胞的方法，其特征在于，所述 Mtb-HAg的使用浓度为1 10μ g/ml，合适的刺激浓度为5μ g/ml4.根据权利要求1所述一种简单高效制备人、ST细胞的方法，其特征在于，所述 rhIL-2的使用浓度为50 500IU/ml，合适的使用浓度为200IU/ml5.根据权利要求1所述一种简单高效制备人YS T细胞的方法，其特征在于，所述 rhIL-21的使用浓度为5 20ng/ml，合适的使用浓度为lOng/ml6.根据权利要求1所述一种简单高效制备人YS T细胞的方法，其特征在于，所述细胞培养72小时后进行半量更换培养液，同时并补加等量的rhIL-27.根据权利要求1所述一种简单高效制备人YS T细胞的方法，其特征在于，所述根据细胞生长状态，每2 3天进行补加培养液，同时并补加等量的rhIL-2
技术领域

本发明属于细胞免疫学技术领域，具体地说是一种体外大量优势扩增人外周血YS T细胞的方法
背景技术
具体实施例方式

下面用实例来具体说明本发明，但本发明并不受其限制下面实例中凡未注明具体条件的实验方法，均为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行实施例1本实施例1是用培养的结核杆菌制备结核杆菌耐热性抗原包括以下步骤 1.将结核杆菌菌体种子湿重50 100克接种于200ml的苏通式液体培养基内，于 37°C培养箱内静止培养2周，然后将其分装到含有10% 30%新生牛血清的250ml的苏通式液体培养基内，每瓶50ml，分装成4瓶，再继续于37 °C培养箱内静止培养4周，收集培养的细菌悬液，经4000转/分，离心30分钟以收获结核杆菌菌体2.将收集的菌体经生理盐水洗涤2次，再用2倍体积的蒸馏水重悬浮菌体，115°C 高压蒸汽处理20分钟，4000转/分，离心30分钟收集上清液，即为Mtb-HAg实施例2本实施例2是用制备的Mtb-HAg刺激PBMCs，以获取大量、高纯度、高细胞毒活性的 Y δT细胞具体操作包括以下步骤1.无菌条件下用血细胞分离机或50ml注射器采集患者外周静脉血，经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞具体步骤为1500转/分，离心10分钟，吸取上层血浆层，56 °C灭活30分钟后离心备用，用生理盐水对倍稀释沉淀的血细胞，人淋巴细胞分离液与稀释血液按1 2的比例加入离心管中，2000转/分，离心20分钟，小心吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，转速分别为1600转/分，1300转/分，均离心7分钟，即得到外周血单个核细胞2.将上述分离的PBMCs置于含有1 10 μ g/ml的Mtb_HAg、50 500IU/ml rhIL-2,5 20ng/ml rhIL-21 和 10% 自体血菜的 RPMI1640、AIM-V 或 GT-T551 培养基内，调细胞密度为(1 2)X106/ml，优选的刺激剂和细胞因子的浓度分别为5yg/ ml Mtb-HAg、200IU/ml rhIL-2、lOng/ml rhIL-21，自体血浆的浓度为 5%，细胞的初始密度2 X 106/ml，转入细胞培养板、培养瓶或培养袋内，优选细胞培养袋，于37°C、5 % C02和饱和湿度的培养箱内培养，72小时后进行半量更换培养液并补加等量的rhIL-2，以后根据细胞生长状态每2 3天进行补加含有等量rhIL-2的培养液，以维持细胞密度为(0. 5 2. 0) XlOVml0根据PBMCs的生长状态，细胞培养时间约为10 15天在细胞培养的第 14天，培养增殖的人Y δ T细胞绝对扩增细胞倍数平均高达500倍(n = 8)实施例3本实施例3将对上述培养的Y δ T细胞进行形态学、纯度及免疫表型和细胞毒活性检测具体操作包括以下步骤1.细胞培养对小时即可见Y δ T细胞沉于培养器皿的底部，并趋于集落化，48小时集落开始变大，培养6 10天即可以看到大的集落和不规则的单个核细胞对培养10 天的细胞进行瑞姬氏染色，发现大多数细胞体积增大，呈椭圆形或不规则形，细胞核大多为椭圆形或圆形，核染色疏松，核膜不规则，有突起，每个细胞可见1个小核仁，呈深蓝色；胞质丰富，染成灰蓝色，形态不规则，有伪足，近核处有淡染现象，也有呈不规则形取培养10 天的细胞100 μ 1，加入100 μ 1 0.4%台盼蓝染色液，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，显微镜下计数本发明制备的细胞活力大于95%2.分别取第0、7、14、21和观天的细胞，用含5%新生牛血清和0. 叠氮纳的PBS 洗涤2次，调整细胞密度为1 X 106/ml，每个检测管内加入50 μ 1细胞悬液，加入荧光标记抗体(抗⑶3-FITC、抗TCR γ δ -ΡΕ)染色，4°C避光孵育30分钟，用上述PBS洗涤2次，加入含有多聚甲醛的PBS溶液固定后，用流式细胞仪进行检测，数据文件采用WinMDI软件分析本发明制备的细胞制剂，⑶3+T细胞高度富集纯度达到98%，γ δ T细胞从第10 14 天达到峰值平均为80% (n = 8)3.取对数生长期的Κ562细胞株作为靶细胞，并调整细胞密度为lX105/ml、 5XioVml,2. 5X 104/ml，每孔取100 μ 1铺于96孔培养板中，培养24小时，取本发明制备的细胞调密度为IX 106/ml，加入96孔培养板中，使效靶比分别为10 1,20 1和40 1，各密度设3个复孔并分别设置空白对照，培养48小时后每孔加入浓度为5mg/ml的MTT 20 μ 1，继续培养4小时后弃上清，每孔加入DMSO 100 μ 1，于A570nm和A630nm处测吸光度 (A)值，计算出绝对A值(A = A570-A630)，按下式计算杀伤活性杀伤活性(％ ) = (A靶细胞+A效应细胞-A效靶混合细胞)/A靶细胞X 100%结果显示本发明制备的Y δΤ细胞对Κ562细胞株具有较高的杀伤活性，杀伤率平均为82% (n = 8)

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专利名称：一种简单高效制备人γδT细胞的方法T淋巴细胞根据表达T细胞抗原受体(T cell receptor, TCR)的不同分为两类 TCRa β T细胞和TCR γ δ T细胞，分别简称为α β T细胞和γ δ T细胞。其中γ δ T细胞是介于特异性免疫与非特异性免疫之间的一种特殊类型的细胞，大多数为CD4和CD8分子双阴性，少数可表达⑶8分子。γ δ T细胞主要分布于皮肤和黏膜组织，一般不超过T细胞总数的5%。γ δ T细胞具有特异性识别抗原而无MHC限制性，具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等功能，是机体免疫监视的第一道防线。但由于Y ST细胞在外周血和肿瘤组织中含量不高，要获得大量高细胞毒活性的Y S T细胞是十分困难的。虽然已有技术通过抗TCR γ δ 抗体或非肽磷酸类抗原获得大量Y S T细胞，这无疑会增加其制备的成本。经广泛查阅国内外专利文献和各种出版物，迄今为止，均未见有实用、高效、快速体外大量优势扩增人外周血Y δT细胞的发明或报道。因此发明一种实用、高效、快速体外大量优势扩增人外周血YST细胞的方法，对于γ δ T细胞免疫功能的研究，并用其提高病人免疫力、抵抗肿瘤和抗感染能力是非常重要的，对于攻克人类渴望解决的恶性肿瘤性疾病这一难题也是十分有价值的。
本发明的目的是为了提供一种实用高效的体外大量扩增人外周血Y δΤ细胞的方法。克服现有制备Y S T细胞数量不足、细胞毒性低、成本高的限制。本发明所采用的技术方案是一种制备人Y δΤ细胞的方法，包括如下步骤培养结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)并制备结核杆菌耐热性抗原 (Mycobacterium tuberculosis heated antigen, Mtb—HAg),采集并分离夕卜周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，用 Mtb-HAg 激活，同时加入细胞因子 rhIL-2和rhIL-21，置于37°C，5% C02和饱和湿度的培养箱内培养，72小时后进行半量更换培养液并补加等量的rhIL-2，以后根据细胞生长状态每2 3天进行补加含有等量 rhIL-2的培养液，以维持细胞密度为(0. 5 2. 0) X 106/ml。10 15天即可以获得大量、高细胞毒活性的Y S T细胞。根据本发明，所述的Mtb培养基为苏通式液体培养基或者Middlebrook7H9，Mtb经过高压蒸汽处理，并经离心超滤制备成Mtb-HAg。所述的PBMCs是采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心法分离收集，并用生理盐水洗涤2次，低速离心后获得。所述Mtb-HAg的终浓度为5 10μ g/ml,rhIL-2的终浓度为50 500IU/ml，rhIL_21的终浓度为5 20ng/ ml。根据PBMCs的生长状态，细胞培养时间约为10 15天。本发明所用的原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得。本发明的有益效果是利用Mtb-HAg作为刺激剂，激活γ δ T细胞，并联合细胞因子rhIL-2和rhIL-21共同刺激培养γ δ T细胞，使获得的γ δ T细胞具有数量大、纯度高、细胞毒性强等特点，从而能够满足临床的需要，同时与IPP等非肽磷酸类抗原、抗TCR γ δ 抗体等刺激剂相比培养成本大大降低。解决了现有技术体外培养Y ST细胞数量低、毒性弱、成本高等问题。
本发明属于细胞免疫学技术领域，具体地说是一种体外大量优势扩增人外周血γδT细胞的方法。本发明包括以下步骤(1)用培养的结核杆菌制备结核杆菌耐热性抗原；(2)用制备的结核杆菌耐热性抗原，联合细胞因子rhIL-2和rhIL-21刺激扩增γδT细胞；(3)通过显微镜进行形态学观察、流式细胞仪进行纯度和免疫表型分析、MTT实验进行细胞毒活性检测。本发明的优点是培养条件和操作较为简便，能在短时间内制备出大量、高纯度、高细胞毒活性的γδT细胞，并且成本较为低廉。

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