专利名称：一种蜡质芽孢杆菌ar156可湿性粉剂及其制备方法和应用的制作方法芽孢杆菌属(Bacillus spp.)是土壤和植物微生态的优势种群,作为植物根际有益微生物，通过分泌抗生物质和生长竞争，在防治植物病害方面发挥多种有益作用。以其为有效成分开发的生物源农药因符合环境保护、食品安全和人类健康的需要，已成为当下化学农药的理想替代品，而获得性状稳定且易于运输和储存的芽孢杆菌制剂是其顺利产业化的基础。芽孢杆菌在繁殖的后期能够产生耐热抗逆的芽孢，这一特点使其在加工过程中能最大限度的减少个体的死亡，从而避免活性成分的丧失，利于菌剂的研制和剂型的加工。而可湿性粉剂是农药加工中技术比较成熟的剂型，主要通过用载体吸附原药后添加助剂并粉碎而获得，成本低廉，工艺简单，运输方便，又因其不含有有机溶剂作为助剂，不会对活体原药造成破坏，也不会对环境造成污染。将两者结合，能很好的弥补将芽孢杆菌发酵液直接当做制剂使用所带来的运输成本高、使用不便、容易污染的缺陷，故己成为当下微生物肥料及微生物农药生产的主要剂型。目前，已有百抗、亚宝等多种芽孢杆菌可湿性粉剂成功试验商品化，用于作物田间病害的防治。但是由于不同的细菌与助剂的相容性，主机对细菌的吸附性各不相同，将现有的芽孢杆菌可湿性粉剂的配方或制备工艺用于制备蜡质芽孢杆菌 AR156可湿性粉剂，制剂中有效菌的吸附量、存活率、制剂对有害菌的防治效果及制剂的稳定性均十分不理想。而配方中各种助剂的选择，既非本领域技术人员经过有限次试验适当的调整就能得到的，必须兼顾考虑各载体吸附能力、各载体吸附烘干后有效成分含量、各载体对AR156生物膜形成能力的影响、热干燥保护剂的作用、分散剂对制剂悬浮率的影响等诸多因素，才能得到制剂性能优秀、防效好、贮藏稳定的可湿性粉剂。
本发明的目的是针对将AR156发酵液直接当做制剂使用所带来的运输成本高、使用不便、容易污染的缺陷，提供一种蜡质芽孢杆菌AR156可湿性粉剂。本发明的另一目的是提供该可湿性粉剂的制备方法。本发明的又一目的是提供该可湿性粉剂的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus) AR156可湿性粉剂，所述可湿性粉剂包含乳糖、白炭黑、阿拉伯胶、磷酸二氢钾和蜡质芽孢杆菌AR156芽孢组成，所述的蜡质芽孢杆菌AR156保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO. 1929。所述可湿性粉剂通过如下方法制备取蜡质芽孢杆菌AR156发酵浓缩液，与乳糖混合，加入325目的白炭黑中，充分搅拌，置于无菌托盘上，在60 70°C条件下烘干11 13h，使最终含水量达到20 30%，对烘干产物进行粉碎，粉碎过程中加入阿拉伯胶，再粉碎，加入磷酸二氢钠将PH调整至7. O而制得；其中所述的蜡质芽孢杆菌AR156发酵浓缩液活菌含量为I 6X109CFU/ml，芽孢含量大于97%;所述的蜡质芽孢杆菌AR156发酵浓缩液与乳糖的体积质量比为180 220 1，乳糖与白炭黑的质量比为0.0135 O. 0165 1， 阿拉伯胶与白炭黑的质量比为O. 07 O. 09 I。取蜡质芽孢杆菌AR156发酵浓缩液，与乳糖混合，加入325目的白炭黑中，充分搅拌，置于无菌托盘上，在65°C条件下烘干12h，使最终含水量达到24% 26%，对烘干产物进行粉碎，粉碎过程中加入阿拉伯胶，再粉碎，加入磷酸二氢钠将PH调整至7. O而制得；其中，所述的蜡质芽孢杆菌AR156发酵浓缩液活菌含量为I 6X109CFU/ml，芽孢含量大于 97%;所述的蜡质芽孢杆菌AR156发酵浓缩液与乳糖的体积质量比为200 1，乳糖与白炭黑的质量比为O. 015 1，阿拉伯胶与白炭黑的质量比为O. 08 I。所述的白炭黑为白色疏松粉末，325目筛通过率为99%，含水量小于3%，纯度大于95% ;所述的阿拉伯胶为淡黄色粉末，纯度大于98% ;所述磷酸二氢钠为无色结晶状粉末，纯度大于97%。所述的蜡质芽孢杆菌AR156可湿性粉剂的制备方法取蜡质芽孢杆菌AR156发酵浓缩液，与乳糖混合，加入325目的白炭黑中，充分搅拌，置于无菌托盘上，在60 70°C条件下烘干11 13h，使最终含水量达到20 30%，对烘干产物进行粉碎，粉碎过程中加入阿拉伯胶，再粉碎，加入磷酸二氢钠将PH调整至7. O而制得；其中所述的蜡质芽孢杆菌AR156 发酵浓缩液活菌含量为I 6X 109CFU/ml，芽孢含量大于97%;所述的蜡质芽孢杆菌AR156 发酵浓缩液与乳糖的体积质量比为180 220 1，乳糖与白炭黑的质量比为0.0135 0.0165 1，阿拉伯胶与白炭黑的质量比为O. 07 O. 09 I。所述的蜡质芽孢杆菌AR156可湿性粉剂的制备方法优选取蜡质芽孢杆菌AR156 发酵浓缩液，与乳糖混合，加入325目的白炭黑中，充分搅拌，置于无菌托盘上，在65°C条件下烘干12h，使最终含水量达到24% 26%，对烘干产物进行粉碎，粉碎过程中加入阿拉伯胶，再粉碎，加入磷酸二氢钠将PH调整至7. O而制得；其中，所述的蜡质芽孢杆菌AR156发酵浓缩液活菌含量为I 6X109CFU/ml，芽孢含量大于97%;所述的蜡质芽孢杆菌AR156发酵浓缩液与乳糖的体积质量比为200 1，乳糖与白炭黑的质量比为O. 015 1，阿拉伯胶与白炭黑的质量比为O. 08 I。所述的白炭黑为白色疏松粉末，325目筛通过率为99%，含水量小于3%，纯度大于95% ;所述的阿拉伯胶为淡黄色粉末，纯度大于98% ;所述磷酸二氢钠为无色结晶状粉末，纯度大于97%。所述的蜡质芽孢杆菌AR156可湿性粉剂在制备防治番茄青枯病的药物中的应用。所述的蜡质芽孢杆菌AR156可湿性粉剂的最佳保存条件为4°C避光保存。有益效果本发明针对蜡质芽孢杆菌AR156在其生长后期会产生抗逆耐热的芽孢，利用具有较佳吸附能力的载体白炭黑对AR156发酵液与适量保护剂乳糖的混合物进行吸附，烘干一定时间，除去其中水分，提高芽孢的比率，对烘干产物进行粉碎，得到初产品(原粉)。在原粉中按照一定比例添加悬浮剂、润湿剂等助剂并进行再粉碎得到AR156可湿性粉剂。验证试验表明本发明蜡质芽孢杆菌可湿性粉剂有效成分含量可达1.05X101(lCFU/g，在4°C避光保存的条件下货架期长达一年，其产品对番茄青枯病的温室防效可达85. 76%。白炭黑等7种载体在可湿性粉剂制作过程中均较常见，本发明综合考虑他们的吸附能力、吸附AR156发酵液烘干后芽孢的含量影响，以及载体自身具有的流动性和润湿性， 白炭黑表现较优。本发明首次研究了可湿性粉剂载体种类与芽孢杆菌AR156生物膜形成能力之间的关系，通过结晶紫染色的方法，发现白炭黑能显著促进蜡质芽孢杆菌生物膜的形成，从而提高其施用后对病原菌的防御能力。此外，白炭黑自身对AR156芽孢也具有一定的保护作用，降低了热干燥过程对其的损伤，故此，白炭黑作为AR156可湿性粉剂的载体最为适宜。乳糖作为该制剂的热干燥保护剂，能在热干燥过程中通过氢键结合在细菌细胞膜蛋白的极性基团上，阻止蛋白质的聚集和伸展，防止细胞结构遭到破坏，因此具有极佳的保护作用。分散剂能提高制剂中有效成分的悬浮能力，使制剂的水溶液保持良好的均一性， 尤其AR156芽孢具有疏水性，且为微生物活体，对分散剂的恰当选择十分必要。阿拉伯胶作为水溶性高分子物质，是由树汁凝结而成的天然植物胶，既能显著提高AR156可湿性粉剂水溶液中芽孢的悬浮能力，又具有无毒无害的特点，可以很好的解决芽孢个体大，难以悬浮的弊端。本发明AR156可湿性粉剂，成功的解决了把芽孢杆菌发酵液直接当做制剂使用所带来的负面影响(运输成本高、使用不便、容易污染等)，原料易得、成本低廉，且不含有污染环境的有机助剂，这又与生物源农药绿色健康、环境友好的宗旨相一致。通过对保存条件的摸索，可以显著提高AR156制剂的货架期。其产品对番茄青枯病的温室防效稳定可靠。另外，由于芽孢杆菌大多具有类似的特性，故本发明专利亦可进行略微修改，用于芽孢杆菌多菌合剂可湿性粉剂的开发。图I各载体及助剂对蜡质芽孢杆菌AR156存活的影响图2各载体吸附能力及吸附烘干后母粉中有效成分含量图3不同母粉载体洗脱前后形成生物膜情况对比I玉米粉，2凹凸棒土，3滑石粉，4黄豆粉，5膨润土，6高岭土，7白炭黑，8发酵液， 9空白对照。图4不同保护剂对母粉中有效成分的保护效能图5不同分散剂对母粉悬浮率的影响图6温度㈧、初始pH⑶和光照条件(C)对AR156可湿性粉剂货架期的影响图7AR156可湿性粉剂对番茄青枯病的防治效果生物材料保藏信息蜡质芽孢杆菌AR156，分类命名为芽孢杆菌Bacillus sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO. 1929，保藏日期为2007年01月26日。O.05%, K2HPO4O. I%，煮沸后过滤，调pH至7. O)中，28°C，200rpm，培养48h，再浓缩至原先体积的25% (即芽孢的含量提高了 4倍)，得到发酵浓缩液，备用。精确称量上述各载体5. Og放入50ml干燥的烧杯中，用Iml注射器缓慢往载体中滴加AR156发酵液，同时用玻棒不断搅拌，至试样开始聚成一团而不分散时停止滴加。记录滴加到载体中菌液的体积。每组试验重复3次，计算5. Og各载体对菌液的平均饱和吸附量。将发酵浓缩液按照上述确定的各载体对菌液的平均饱和吸附量，在烧杯中分别与等量各载体混合均匀，将样品置于恒温培养箱中，65°C条件下烘干，12h后取样检测菌体及芽孢含量。可湿性粉剂中，载体对制剂的理化性质影响很大。原药为液态的制剂，选择吸附性能强的载体对制剂加工极为重要。由图2可知，在备选的8种载体中，白炭黑对发酵浓缩液的吸附能力最强，达到294. 17ml/100g,且流动性极佳，而陶土几乎难与发酵液互溶。用各载体吸附发酵液后烘干，得到母粉。以白炭黑作为载体的母粉，因其自身吸附的发酵液多，加之其结构本身对芽孢具有一定的保护作用，致使该母粉中芽孢含量可达7. 56X 109CFU/g， 其余载体制作的母粉中有效成分含量均显著低于白炭黑。I. 2. 2各载体对AR156生物膜形成能力的影响在96孔板中按180 μ L/孔加入LB液体培养基，将不同载体制成的可湿性粉剂按照有效成分含量相等的原则接入其中，以只添加发酵浓缩液和不添加制剂的LB培养基为对照，混匀，加盖，于25°C温室中静置培养，待产生肉眼可见生物膜后，利用结晶紫染色法进行检测，每处理五次重复。将不同载体制成的可湿性粉剂中菌体分离，得到纯培养后重复上述实验。由图3可知，以白炭黑为载体的母粉在LB培养液表面能形成致密的生物膜，其染色液在570nm下吸光值最高，而滑石粉、凹凸棒土及玉米粉则会削弱AR156形成生物膜的能力。将各载体洗脱之后，利用菌体纯培养重复上述实验，发现生物膜形成致密程度以及生物膜染色液的吸光值均无显著差异。综合以上的实验结果，选定白炭黑作为蜡质芽孢杆菌AR156可湿性粉剂的载体。I. 3助剂的筛选I. 3. I热干燥保护剂在发酵浓缩液中分别添加I. 5%葡萄糖、I. 5%蔗糖、I. 5%乳糖、I. 5%纤维二糖、
I.5%海藻糖、2%蛋白胨、2mol/L甘油、O. 25mol/L谷氨酸钠，与I. 2中确定的载体混合，烘干后制得各种不同的母粉，检测其中芽孢含量，以不加保护剂作对照，每个处理重复3次。 实验结果见图4，糖类对AR156的芽孢具有较好的保护作用。制剂添加O. 5%的乳糖作为热干燥保护剂，经12h热干燥后，母粉中有效成分含量最高，达I. 05X 101(lCFU/g。I. 3. 2分散剂的筛选在母粉中分别添加一定量的分散剂，按照GB/T 14825-2006的方法测定各制剂的悬浮率，每个处理重复3次。结果见图5，可见在备选的五种分散剂中，除聚乙二醇对AR156 可湿性粉剂的悬浮能力没有显著改善以外，其余分散剂对制剂悬浮率的提高均随着添加量的增加而呈现不同程度的增加。阿拉伯胶作为分散剂，当添加量达到8%时，悬浮率可达 77. 14%。实施例22. 1AR156发酵浓缩液的制备挑取AR156(CGMCC NO. 1929)单菌落，置于装有LB培养液的试管中，28°C，200rpm， 培养24小时，作为种子液。按照5%的接种量，将种子液接种于优化培养基(麦芽糖 O. 25%,玉米粉 O. 5%,黄豆粉 O. 5 %，胰蛋白胨 O. 5 %，CaCl2 · 2H20 O. 05%, MnSO4 · H2O O. 05%, K2HPO4O. I%，煮沸后过滤，调pH至7. O)中，28°C，200rpm，培养48h，得到芽孢含量约为I X 109CFU/mL的发酵液，浓缩至原先体积的25% (即芽孢的含量提高了 4倍)，得到发酵浓缩液，备用。芽孢含量的检测方法采用平板菌落计数法取100 μ L AR156发酵液，加入到 900 μ L灭菌水中，震荡混匀后，从中吸取100 μ L加入到900 μ L灭菌水中，再震荡混匀。如此反复，直至将AR156发酵液稀释到原先浓度的10_7。选取浓度为原先10_7 10_4四个梯度的稀释液，每个梯度吸取10 μ L，点于LB平板上，置于28°C培养箱中黑暗培养12h后计数， 得到活菌数量(X);将该IOOyL AR156发酵液置于80°C水浴中处理IOmin后取出，依据同样方法梯度稀释，点板培养，得到芽孢数量(y)。芽孢含量) = x/yX100。上述制备的发酵浓缩液中芽孢含量大于97%。2. 2AR156可湿性粉剂的制备(以IOg为例)量取30ml I. I中制备的新鲜的AR156发酵浓缩液(有效成分含量约为4X IO9CFU/ml)，与O. 15g乳糖充分混合，加入IOg 325目的白炭黑中，充分搅拌，置于无菌托盘上，在 65°C条件下烘干12h，使最终含水量达到25%左右。对烘干产物进行粉碎，期间加入O. 8g 阿拉伯胶，再粉碎，加入O. 7g磷酸二氢钠，将pH调整至7. 0，得到成品。将上述制备的AR156可湿性粉剂溶解于无菌水中，进行梯度稀释，利用滴液法检测AR156可湿性粉剂中有效成分含量。对成品的各指标进行测定，润湿时间测定参考GB/T 5451-2001，悬浮率测定参考GB/T 14825-2006，细度测定参考GB/T16150-1995，水分测定参考 GB/T1600-2001，pH 值测定参考 GB/T1601-1993。结果显示蜡质芽孢杆菌AR156可湿性粉剂芽孢含量为I. 05X 10lclCFU/g，pH值7. 0， 水分含量25%,悬浮率77. 14%,润湿时间41s，细度通过率91. 74%。实施例3AR156可湿性粉剂储存条件及货架期检测3. I温度对制剂货架期的影响按上述方法制作菌剂，将其分别置于4°C、25°C和37°C条件下保存。于第0、3、7、 15、30d取样检测有效成分含量。每个处理重复3次。AR156可湿性粉剂在不同的保存条件下放置一定时间后，芽孢含量会出现不同程度的下降。温度与该下降速率成正相关，低温条件能抑制芽孢的萌发，使芽孢能持续保持休眠状态，因此，该制剂4°C条件下保存30天后，芽孢含量依然能维持较高水平(图6，A)。3. 2初始pH对制剂货架期的影响按上述方法制作菌剂，用磷酸二氢钠将其pH值调至酸性(6. O)、中性(7. O)和碱性 (8. O)，以自然pH为对照。置于25°C恒温环境中保存，于第0、3、7、15、30d取样检测有效成分含量。每个处理重复3次。在中性条件下保存30天后，制剂中芽孢含量显著高于其他处理(图6，B)，由此可见，环境条件过酸或过碱均不利于芽孢的存活。3. 3光照对制剂货架期的影响按上述方法制作固体菌剂，分别封装于镀膜包装袋和透明包装袋中，置于25°C恒温环境中保存，于第0、3、7、15、30d取样检测有效成分含量。每个处理重复3次。自然光中含有一定量的紫外线，对芽孢具有较强的杀伤作用，通过避光处理，可以免除紫外线对芽孢的伤害，从而减缓芽孢含量下降速率(图6，C)。3. 4货架期检测取IOg枯草芽孢杆菌AR156可湿性粉剂，调整至最适pH，置于最优温度及光照条件下储存，定期检测样品中有效成分含量，测定时长为360d，从而确定制剂储存360d期间有效成分含量的变化，与常温下这一指标的变化进行比较。综合以上最适条件(4°C、pH7. O、避光)，检测ARl56可湿性粉剂的货架期，保存360 天时，其有效成分含量依然能达到6. 21 X 109CFU/g,其他条件不变，常温保存时，有效成分含量仅为到2. 13X109CFU/g。实施例4AR156可湿性粉剂温室防效验证病原细菌爺科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)先于YPGA平板上培养2-3天， 收集菌体进行扩繁，配制浓度为0D600 = 2. O (约2. O X 108CFU/ml)的菌悬液备用。番茄(品种为上海903)苗育于穴盘中。30天后，用芽孢含量均为1.0X108CFU/ ml的蜡质芽孢杆菌ARl56可湿性粉剂的水溶液和ARl56发酵液的稀释液分别浇灌番茄苗， 每棵苗20ml。3天后，每棵苗浇灌浓度为I. OX 108CFU/ml病原细菌茄科劳尔氏菌的培养液15ml。对照组的番茄苗浇灌等量清水后，以同样的方法接种病原菌。试验全过程中，番茄生长条件为28 °C，相对湿度30%，光周期12h/12h。每个处理设3个重复，每个重复由24株苗构成。每个温室试验均重复3次。按照Kempe于1983年提出的病级标准记录病级数0级，没有青枯症状；1级，
1-25%的叶片出现萎蔫症状；2级，26-50%的叶片出现萎蔫症状；3级，51-75%的叶片出现萎蔫症状；4级，76-100%的叶片出现萎蔫症状。病害严重度和防效的计算公式如下


本发明公开了一种蜡质芽孢杆菌AR156可湿性粉剂及其制备方法和应用。该蜡质芽孢杆菌AR156可湿性粉剂包含乳糖、白炭黑、阿拉伯胶、磷酸二氢钾和蜡质芽孢杆菌AR156芽孢组成。取蜡质芽孢杆菌AR156发酵浓缩液，与乳糖混合，加入325目的白炭黑中，充分搅拌，置于无菌托盘上，在60～70℃条件下烘干11～13h，使最终含水量达到20～30％，对烘干产物进行粉碎，粉碎过程中加入阿拉伯胶，再粉碎，加入磷酸二氢钠将pH调整至7.0而制得所述的AR156可湿性粉剂。本发明AR156可湿性粉剂，成功的解决了把芽孢杆菌发酵液直接当做制剂使用所带来的负面影响，对番茄青枯病的温室防效稳定可靠。