专利名称：生物催化制备6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯及菌株的制作方法手性药物在许多疾病的防治中具有重要意义，其合成研究受到学术界、企业以及政府的高度重视。具有特定功能基团的手性醇更是许多手性药物合成的关键手性砌块，并且在制药、农药、香料等精细化工方面有着十分广泛的应用。心血管疾病成为对人类最具威胁的疾病之一，其发病率和死亡率均已超过恶性肿瘤性而跃居第一。据世界卫生组织统计，全世界每年有3000多万人死于心脑血管疾病。中国每年因心脑血管疾病及并发症死亡病例超过300万。积极治疗高血脂症是预防心脑血管疾病的关键，降血脂药物开发已经成为全球药物研究的重点和热点。他汀类药物是目前主要的降血脂药物，其对胆固醇生物合成过程中的限速酶——3-羟基-3-甲基辅酶A(HMG-CoA)还原酶具有显著抑制作用，降低细胞游离胆固醇水平，反馈性上调细胞表面低密度脂蛋白受体表达，促进循环血液中极低密度脂蛋白胆固醇残粒和低密度脂蛋白的清除，最终降低血清中总胆固醇和低密度脂蛋白的水平，有效防止动脉粥样硬化和冠心病的发生。全球开发和在研的他汀类药物已有十多个品种。第一代他汀药物包括辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀，是一类结构类似的真菌代谢物。第二代他汀包括化学合成的外消旋氟伐他汀。第三代他汀是合成的光学纯他汀药物，如阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和匹伐他汀。他汀类降脂药占世界降脂药市场的85%以上份额，并仍具有提升空间。手性β，δ - 二羟基己酸(酯)结构是合成他汀药物的药效基团、手性砌块，也是合成他汀药物的重点和难点。他汀类药物的最终质量取决于手性侧链对应异构体的光学纯度，各国药监部门要求ee值大于99.5%，de值大于99%。6_氰基-(3R，5R)- 二羟基己酸叔丁酯是他汀类药物合成的手性砌块，合成工艺包括化学不对称合成和生物不对称合成。6_氰基-(3R，5R) - 二羟基己酸叔丁酯化学合成方法存在诸多缺陷，合成需要使用剧毒的三乙基硼和-85°C深冷条件，而且非对映诱导不充分，产物6-氰基-(3R，5R) - 二羟基己酸叔丁酯de值低，该反应形成的硼化物废物处理需要经过繁琐的反复甲醇淬灭、真空蒸馏等。与化学方法相比，生物合成法具有以下优点(I)立体、区域和化学选择性高，这主要是因为酶对底物、产物的严格的专一性识别；而使用化学合成方法时，只有当羰基两边的基团差异很大时才能获得较高的立体选择性；(2)安全性与环境相容性好，生物催化安全且反应条件温和，通常以水溶液作为反应体系，环境友好。 具有羰基还原酶(醇脱氢酶)活性微生物广泛存在于自然界中，但他们不对称还原羰基往往遵循Prelog还原规则、产物构型为S构型；具有反-Prelog立体选择性羰基还原酶活性的微生物在自然界中非常罕见。迄今为止，文献报道的具有不对称还原(R)_6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R，5R) - 二羟基己酸叔丁酯活性的微生物菌种有 Saccharomyces cerevisiae,Pichia angusta NCYC 495,Pichia angusta NCYCR320,Pichia angusta NCYC R322, Pichia haplophila CBS 2028,Beauveria bassiana,Pichiapastoris, Pichia membranefaciens, Pichia angusta, Candida humicola, Candidasolani, Candida diddensiae, Candida friedrichii, Kluyveromyces drosophilarum,Debaromyces hansenii。目前，未见 Pichia guilliermondii 具有(R)-6_ 氰基-5-轻基-3-羰基己酸叔丁酯非对映选择性羰基还原酶活性的报道。
本发明目的是克服现有的6-氰基_(3R，5R)_ 二羟基己酸叔丁酯生产技术的不足，提供一种从土壤中富集、筛选具有高立体选择性羰基还原酶活性微生物菌种——季也蒙毕赤酵母菌(Pichia guilliermondii) X25,及其在生物不对称还原(R)_6_氰基-5-轻基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R，5R) - 二羟基己酸叔丁酯中的应用。本发明采用的技术方案是一株具有反-Prelog非对映选择性R-羰基还原酶活性的菌株——季也蒙毕赤酵母菌(Pichia guilliermondii)X25，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮政编码430072，保藏编号为CCTCC No M 2011386，保藏日期为2011年11月11日。经鉴定，该菌株属于毕赤酵母属(Pichia)的guilliermondii种,菌株编号为X25。菌株菌落形态菌落呈乳白色，边缘整齐，圆形，不透明，表面光滑、隆起(细胞扫描电镜照片见图I)。细胞形态细胞呈卵圆或瓜子形，大小约I. 4 2. 5 μ mX I. 4 5. O μ m。生理生化特征利用Biolog微生物自动鉴定系统测定菌株X25对65种碳源的代谢情况，经Biolog读数仪分析代谢指纹，菌株X25能较强利用42种碳源，对其他23种碳源不能利用或利用能力较弱(详见表I)。表I :利用Biolog微生物自动鉴定系分析菌株X25碳源利用结果本发明提供了一种从土壤中富集、筛选具有高非对映选择性羰基还原酶活性微生物新菌种——季也蒙毕赤酵母菌(Pichia guilliermondii)X25，及其在生物不对称还原(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮政编码430072，保藏编号为CCTCC NoM 2011386，保藏日期为2011年11月11日。利用该菌产生的羰基还原酶转化(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备光学纯6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯，立体选择性高，反应条件温和，环境友好。