专利名称：在质粒序列转录过程中防止畸变rna形成的方法和组合物的制作方法业已有文献指出，多核苷酸组合物可以用于医药，主要治疗或预防哺乳动物的疾病，以及用于这些领域的研究。确切地说，现在大量活动都围绕在应用多核苷酸组合物治疗细胞外和细胞内病原性感染，如病毒、细菌、真菌感染等。例如，有文献指出，DNA疫苗可以给哺乳动物细胞体内传递一种物质，该物质可以利用哺乳动物免疫系统对抗病原体。因此，这样的疫苗被设计成表达，例如表达蛋白或多肽，在接触感染物质刺激时，可以引起体液或细胞免疫应答。另一方面，基因治疗的载体也是多核苷酸组合物，通常设计用来给哺乳动物细胞传递一种蛋白质，所述蛋白质在哺乳动物中或者不表达、或者不正常表达、或者低表达。这些载体通常必然引起针对这些多核苷酸序列的种特异性免疫应答反应，所述多核苷酸序列被识别为抗原，并可引起多余细胞免疫应答。多核苷酸组合物的其他治疗应用是将缺失的或低表达的蛋白质导入患病哺乳动物患者。而且，多核苷酸本身可以作为有用的体内反应物，用于诊断/成像方法，作为反应物用于基因治疗、反义方法、疫苗应用，或者作为药物用于治疗或预防多种疾病，如遗传缺陷、感染性疾病、肿瘤和自身免疫性疾病。多核苷酸还可作为体外反应物用于各种试验，如生物研究试验，医学、诊断、筛查和污染检测试验。一系列本领域熟知的问题阻止了多种多核苷酸组合物成为广为接受的有用医药品。因此，至今被医药界接受用于治疗哺乳动物疾病的这种DNA疫苗或治疗剂还很少。被称为转录后基因静默和转录静默的现象，业已在植物、线虫和果蝇中观察到。该现象提示，表达与调控元件具有某些同源性的多核苷酸序列的病毒、类病毒、质粒或RNA转染或感染植物、线虫或果蝇，可以导致内源性调控元件和/或基因以及外源性序列表达的永久抑制，所述调控元件如已在细胞中表达的启动子或自身基因或其一部分。这一静默效应业已显示是基因特异性的。见，例如，L.Timmons and A.Fire，Nature，395354(Oct.29，1998)；A.Fire et al.，Nature，391806-810(Feb.19，1998)；R.Jorgensen et al.，Science，2791486-1487(March 6，1998)；J.R.Kennerdell and r.W.Carthew，Cell，951017-1026(Dec.1998)；L.Misquitta and B.M.Paterson，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，961451-1456(Feb.1999)；M.K.Montgomery et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，9515501-15507(Dec.1998)]。编码全长前α1胶原基因的DNA质粒瞬时转染啮齿类动物成纤维组织细胞系后，观察到天然胶原基因的“静默”效应，以及基因的瞬时表达。[Bahramian and Zarbl，Mol.Cell.Biol.，19(1)274-283(Jan.1999)]。多核苷酸分子应用的另一个问题是形成畸变的RNA或DNA，而不是形成所需的包括基因的转录产物。业已假定，畸变RNA或DNA的形成发生在应用任何转染质粒或多核苷酸酸分子的情况下，降低靶基因表达的效率。畸变或异常RNA可能是上述静默效应的一个原因。本领域众所周知，有很多可以通过商业渠道购买的序列具有终止转录的功能。例如，RNA聚合酶II的休止位点与转录终止有关，特别是当该位点位于瞬时表达系统中强poly A信号的直接下游时。[P.Enriquez-Harris et al，EMBO J.，9(7)1833-1842(1991)；G.W.Hatfield etal，Mol.Cell.Biol.，3(10)1687-1693(1983)]。但是，直至今天，还没有建议，利用终止机制来创建一种有效的功能性组合物或方法，用于增加在医药、疫苗、基因治疗和诊断领域多核苷酸表达的效率。本领域确实存在这样一种需求，即应用相同的机制，利用多核苷酸组合物和方法，抑制畸变RNA或DNA分子的形成，增加宿主细胞中选定多核苷酸序列的表达。发明简述本发明的一个方面，提供了一种双链多核苷酸(优选脱氧核酸核酸)分子，该分子包括第一条编码链和第二条转录模板链。第一条链包括(i)至少一个表达盒序列，该序列包括，从5’端到3’端，一个启动子，一个由启动子控制表达的选定多核苷酸序列和一个poly A位点，以及(ii)至少一个第一条链的终止序列。选定表达盒多核苷酸序列可以是任何需要在细胞中表达行使某种生物功能的多核苷酸序列。第一条终止子序列优选位于启动子的5’端，位于poly A位点的3’端，位于第一条链表达盒序列的外部，或位于表达盒序列选定多核苷酸序列中。第一条链的终止序列位于既不阻止第二条链序列转录的位置，也不影响被表达多核苷酸序列功能的位置，所述第二条序列与表达盒序列互补。第二条链与第一条链互补。第二条序列中与第一条链终止子序列互补的部分，不阻止与第一条链表达盒互补的第二条链序列的转录。而且，第二条链包括至少一个第二条链终止子序列，该序列可以终止始于第二条链的转录。第二条链终止子序列优选位于第二条链与第一条链表达盒互补序列之外，并且位于既不阻止与表达盒序列互补序列转录的位置，并且当多核苷酸序列表达时，也不削弱其生物功能的位置。本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，该组合物包括上面鉴定的双链多核苷酸分子，可选的促进细胞摄入多核苷酸(如DNA)的试剂，以及适宜的药用载体。这些组合物可用于治疗细胞内病原性感染，如病毒。其他的这些组合物可以用于治疗某些肿瘤。其他的这些组合物可用于治疗某些细胞外病原体。
本发明的另一方面，提供了单链多核苷酸序列，该序列选自上述双链多核苷酸分子的第一条链或第二条链。
本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，该组合物包括上面鉴定的单链多核苷酸分子，可选的促进细胞摄入多核苷酸(如DNA)的试剂，以及适宜的药用载体。
本发明的另一方面，提供了一种方法，该方法提高宿主细胞中选定多核苷酸序列的表达效率，该方法包括以下步骤应用上述双链DNA分子或其单链转染宿主细胞，从而抑制宿主细胞中从多核苷酸分子转录的畸变多核苷酸序列的形成。
本发明的另一方面，提供了一种单链RNA分子，所述单链RNA分子包括一个具有5’端和3’端的核糖核酸序列，经由修饰防止双链或部分双链区的形成。在一个实施方案中，这个分子含有一个5’端帽。在另一个实施方案中，这个分子没有帽。在另一个实施方案中，这个分子具有3’端poly A尾。在另一个实施方案中，这个分子没有poly A尾。
本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，该组合物包括上面鉴定的单链RNA分子，可选的促进细胞摄入RNA的试剂，以及适宜的药用载体。
本发明的另一方面，提供了一种方法，该方法提高宿主细胞中选定多核苷酸序列的表达效率，该方法包括以下步骤应用上述单链RNA分子转染宿主细胞，从而抑制宿主细胞中畸变RNA分子的形成。
本发明的另一方面，提供了治疗哺乳动物的一种方法，该方法包括给予有效剂量的药物组合物，所述组合物包括上述任意多核苷酸分子，可选的促进细胞摄入DNA或RNA的试剂，以及适宜的药用载体。
本发明的另一方面，提供了一种方法，该方法防止宿主细胞中多核苷酸序列的无意关闭或下调，所述宿主细胞转染了含有选定多核苷酸序列的多核苷酸分子，所述选定多核苷酸序列与该宿主细胞中存在的多核苷酸序列同源。该方法包括以下步骤给予有效剂量的药物组合物，所述组合物包括上述多核苷酸分子，可选的促进细胞摄入多核苷酸的试剂，以及适宜的药用载体。
在一个实施方案中，多核苷酸组合物或分子通过体外酶合成法或化学合成法制备。在另一个实施方案中，该组合物或分子可以通过重组培养物如细菌细胞及其分离物产生，由其中分离，并应用下述方法。在另一个实施方案中，在将组合物导入宿主细胞后，可以体内产生多核苷酸分子。
本发明的另一方面，提供了用于研究方法的这些组合物和分子，如降低或抑制体内宿主细胞或组织中多余的多核苷酸表达，用于诊断或其他研究试验，或离体处理后移回宿主受体，用于治疗或其他医疗应用。
本发明的另外一些方面将在下面优选实施方案中给予进一步详细阐述。
附图简述

图1A显示了本发明的一个双链DNA分子，包括第一条“正义”链和第二条互补链，第一条链含有5’终止子序列(T1)，启动子(P)，选定多核苷酸序列(PN)，poly A序列(pA)和3’终止子序列(T2)，第二条链含有第二条链终止子序列(T3)，该终止子在这种情况下，位于正义链poly A序列的3’端。第一条链或第二条链都可用作本发明单链DNA分子。
图1B显示了本发明的另一个双链DNA分子，包括第一条“正义”链和第二条互补链，第一条链含有2个5’终止子序列(T1和T2)，启动子(P)，选定多核苷酸序列(PN)，poly A序列(pA)和3’终止子序列(T3)和RNA不稳定序列(RIS)，第二条链含有多个第二条链终止子序列(T3-T8)，所述终止子序列分散分布于与第一条链表达盒区域不相互补的区域。在这种情况下，终止子T4和T5位于正义链polyA序列的下游，而终止子T6-T8则位于正义链启动子(P)的上游。第一条链或第二条链都可用作本发明单链DNA分子。
图1C显示了本发明的另一个双链DNA分子，包括第一条“正义”链和第二条互补链，第一条链含有挂锁式终止子(PT)和另一个位于启动子(P)5’端的终止子(T2)，选定多核苷酸序列(PN)，poly A序列(pA)和3’终止子序列(T3)，第二条链含有多个第二条链终止子序列(T4-T6)，所述终止子序列分散分布于与第一条链表达盒区域不相互补的区域。在这种情况下，终止子T4和T5位于正义链poly A序列的下游，而终止子T6则位于正义链启动子(P)的上游。第一条链或第二条链都可用作本发明单链DNA分子。
图1D显示了本发明的另一个双链DNA分子，含有多个终止子，除了挂锁式终止子(PT)位于正义链选定多核苷酸(PN)序列之内，其他终止子位置如图1C所述。
图2A是体外制备的RNA分子示意图，该分子包括一个序列A的倒转互补重复序列(序列B)，可以碱基配对，序列本身折回形成双链或部分双链RNA。在该示意图中，密码子GCC编码丙氨酸，AAG编码赖氨酸，CUU和UUG均编码亮氨酸，GGC和GGA均编码甘氨酸。
图2B是改变变动碱基(即密码子中一种其发生改变时密码子发生变化，但编码的氨基酸不发生变化的核苷酸)的示意图，除去倒转互补重复序列。在该示意图中，密码子GCC编码丙氨酸，AAG编码赖氨酸，CUU和UUG均编码亮氨酸，GGC和GGA均编码甘氨酸。通过变动一个互补倒转重复序列，碱基配对变得不完全，因而不能形成稳定的双链分子。
图3A示意了带有发夹结构的RNA分子，以及依赖于内源RNA的RNA聚合酶作用结果。
图3B示意了经3’链终止子(*)修饰的同一分子的效应。发夹不可能通过依赖于内源RNA的RNA聚合酶延长。
图4A是双链DNA质粒的示意图。
图4B示意了在没有终止子序列的情况下，图4A质粒转录如何形成。从质粒的两条链均可获得畸变RNA链。每个箭头显示了转录方向。其中一些转录产物可以与另一些转录产物碱基配对，形成双链RNA。
图4C示意了在双链DNA质粒两条链均有终止子的情况下，转录的发生情况。编码链终止子以*代表。非编码链终止子以0代表。箭头显示了转录方向。
图5示意了一个质粒第一条(编码)链的延长区域。编码链终止子以*代表。尽管转录仍可在质粒DNA的多个神秘位点开始，但位于整个质粒的多个终止子可以防止转录产物延长超过终止子，进而防止了从双链DNA质粒中形成畸变RNA。
图6是实施例1-4中应用的质粒示意图，该质粒含有一个表达盒，该表达盒包括呼吸道合胞病毒增强子(RSVenh)和人巨细胞病毒启动子(HCMV)，鼠IL-12 p40选定多核苷酸序列，和SV40 poly A位点。该质粒还含有卡那霉素耐药基因(KanR)，和复制起始点(ori)。限制性内切酶的限制位点以它们分别的核酸位点数显示。该质粒每条链的长度为4709个碱基。
图7显示了实施例5应用的双链质粒，该质粒含有2个启动子猿巨细胞表达(SCMV)启动子和HCMV启动子，其中，SCMV启动子指导第一条链一个方向的转录，而HCMV启动子指导第二条链相反方向的转录。箭头表示转录方向。终止子和不稳定RNA序列以·表示；第二条链的终止子以·1表示；第一条链的终止子以·2表示。A区如图示，位于·1与·2之间。
发明详述本发明提供了疾病和功能紊乱的治疗、预防、研究和诊断的新多核苷酸组合物和方法，所述疾病和功能紊乱影响非脊椎动物和脊椎动物，特别是哺乳动物，其目的是提高选定多核苷酸序列的表达效率，降低或抑制多余或畸变多核苷酸种类的形成。这些组合物和方法也可用来防止某种多核苷酸序列的无意关闭或下调，该现象可以在宿主细胞中自然发生，或由于在该序列的插入而导致。这里应用的术语“宿主细胞”或“宿主”有意指脊椎动物或非脊椎动物细胞或由这些细胞制备的生活有机体。因此，本发明对哺乳动物、优选人类，家养动物如犬类、猫类和马类，动物园饲养的动物、家畜、实验室动物、以及其他脊椎动物，如鸟类、鱼及其细胞有效。本发明还对真核细胞、原核细胞、其他非脊椎动物细胞等有效。本发明组合物和方法还可用于植物细胞以及其他有机体。
这些组合物和方法业已用于体外、活体外和体内。例如，特别用于体外的本发明细胞包括干细胞、稳定细胞系和原代细胞。特别用于活体外的本发明细胞包括干细胞和原代细胞。上述任意一种细胞类型均可用于这里所述方法和组合物的体内应用。这些组合物和方法还可进一步利用细胞的分子机理，达成治疗、疫苗、诊断或研究目标。
1.本发明的DNA分子用于达成本发明目标的多核苷酸分子实施方案是一个双链或部分双链DNA分子，该分子由第一条“编码”链和第二条互补“转录模板”链构成，将在下面给予详细阐述。除非有其他特别指示，这里应用的术语“互补”是指双链DNA的传统含意，即第一条链的每个嘌呤，即腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，在第二条链的相应位点存在一个嘧啶，即胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)，通过氢键与第一条链的每一个A连接，或胞嘧啶(C)与第一条链的每一个G连接。
这一双链或部分双链分子可能是DNA载体、DNA质粒或任意双链DNA构建物，设计成将多核苷酸序列导入细胞，并在细胞中表达。在一个实施方案中，这一双链分子是线性的；而在另一个实施方案中，这一双链分子是环状的。本发明DNA分子可以是双链质粒或载体，包括由RNA pol I，RNA pol II或RNA pol III控制的序列，根据本发明，该分子可以在细胞内转录成RNA分子。当启动子是RNA pol II启动子时，优选编码RNA分子的序列具有一个超过大约300核酸的开放阅读框，避免通过无义mRNA监督降解机制而在核内降解。这些质粒或载体可以包括细菌、病毒或噬菌体序列。这些载体包括染色体、游离基因和病毒获得性载体，如细菌质粒、噬菌体、酵母游离基因、酵母染色体元件和病毒获得性载体，以及上述联合的获得性载体，如质粒和噬菌体基因元件、粘粒和phagemid获得性载体。这样，一个示例性载体是双链DNA噬菌体载体。另一个示例性载体是双链DNA病毒载体。
本发明另一个实施方案的DNA分子是单链DNA序列，包括，例如，双链DNA分子的第一条链或第二条链。这些链将在下面详述。该单链DNA分子还可以是合成的，如下详述，这条单链被设计成编码第一条编码链的所有信息，包括构成第二条互补链上存在的任何终止子序列的互补序列。此外，单链DNA分子还可合成为非编码链或第二条转录模板链。如下详述，该第二条链被设计成编码第一条链所有互补信息的单链，包括部分构成第一条链的终止子序列的互补成分，以及构成该非编码链上的终止子序列的序列。单链分子可以是DNA载体，环状单链DNA如从噬菌体M13中分离获得的环状单链DNA，或任意单链DNA构建物，该构建物被设计成可以将多核苷酸序列导入细胞，并在细胞中表达。如上双链分子所述，该单链质粒或载体可以包括细菌、病毒或噬菌体序列。这样，一个示例性分子是单链DNA噬菌体载体。另一个示例性分子是单链DNA病毒载体。在一个实施方案中，单链分子是线性的；而在另一个实施方案中，单链分子是环状的。
这些DNA分子可用来体内、活体外和体外以一种有效的形式表达选定多核苷酸序列，同时降低构建物中多余序列的表达。
A.第一条链本发明双链、部分双链或单链分子包括含有至少一个表达盒序列的第一条链(也称为正义或编码链)。如果第一条链是双顺反子的，它包括超过一个表达盒序列。按照惯例，这样的一个表达盒序列包括一个选定多核苷酸序列，该序列与调控成分操作性连接，连接方式允许其在宿主细胞中转录。这里应用的“操作性连接”序列包括与选定多核苷酸序列邻近的表达调控序列，以及存在于多核苷酸序列中或远距离控制多核苷酸序列的表达调控序列。因此，表达盒包括最低限度，从5’端到3’端，一个启动子，一个选定多核苷酸序列和一个多聚腺苷酸(poly A)位点。
其他表达调控序列包括适宜的转录起始点、终止点、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号如剪接和多聚腺苷酸(poly A)信号；稳定胞浆mRNA的序列；提高反应效率的序列(如Kozak共识序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及在需要的时候，增强编码产物分泌的序列。DNA构建物的第一条链需要可以进一步提供核内定位信号，该信号可以把选定多核苷酸序列导向到该分子转染的细胞核中，在那里发生转录。适宜的核定位信号是本领域技术人员熟知的，不是本发明的限制因素[见，如D.A.Dean，Exp.Cell Res.，230(2)293-302(Feb.1，1997)]。
为达成本发明目的，本发明应用的适宜启动子选自本领域熟知的构建、诱导和/或组织特异性启动子。在本发明一个实施方案中，表达盒中应用的启动子需要弱启动子，如在备选宿主细胞中缓慢启动的启动子；如示例，在一些情况下，弱启动子位于腺相关表达ITR。有用的构建启动子示例包括但不限于逆病毒Rous肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(可选的带有RSV增强子)，巨细胞病毒(CMV)启动子(可选地带有CMV增强子)[见，如Boshart et al，Cell，41521-530(1985)]，SV40启动子，双氢叶酸还原酶启动子，β-肌动蛋白启动子，磷酸甘油激酶(PGK)启动子，以及EF1α启动子[Invitrogen]。诱导性启动子通过外源供应的化合物调控，包括锌诱导性羊metallothionine(MT)启动子，地塞米松(Dex)诱导性鼠乳腺癌病毒(MMTV)启动子，T7聚合酶启动子系统[国际专利申请号WO 98/10088]；昆虫蜕皮激素启动子[No et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，933346-3351(1996)]，四环素抑制系统[Gossen et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895547-5551(1992)]，四环素诱导系统[Gossen et al，Science，2681766-1769(1995)，还见Harvey et al，Curr.Opin.Chem.Biol.，2512-518(1998)]，RU486诱导系统[Wang et al，Nat.Biotech.，15239-243(1997)和Wang et al，Gene Ther.，4432-441(1997)]，以及rapamycin诱导系统[Magari et al，J.Clin.Invest.，1002865-2872(1997)]。
表达盒的任何组分都可选自基因工程学领域惯常应用的启动子和调控序列。见，如Sambrook et al，“Molecular CloningA LaboratoryManual.”，Cold Spring Harbor，NYCold Spring Harbor Laboratory Press(1989)和其他该领域文献。表达盒组分的选择不是本发明的限制因素。
同样，选定多核苷酸序列可以是编码多肽、蛋白、或其他任何感兴趣产物或产生感兴趣生物功能的任何多核苷酸序列，并优选可在体外、活体外或体内细胞中优先并有效表达的多核苷酸序列，用于治疗、预防、基因治疗或研究、诊断。这些选定多核苷酸序列的宿主可以由本领域技术人员根据将要治疗或预防的疾病作出选择。多核苷酸序列的选择有赖于获得分子的应用。例如，一种选定多核苷酸序列包括一个通讯子序列，该序列表达时产生一个可检测信号。这些通讯子序列包括但不限于编码β-内酰胺酶、β-牛乳糖酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸腺嘧啶脱氧核酸激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶、膜结合蛋白以及融合蛋白的DNA序列；所述膜结合蛋白包括，例如CD2，CD4，CD8，流感血凝素蛋白和其他本领域熟知的蛋白，其定向高亲和力抗体业已存在或可以通过惯常方法制备；所述融合蛋白包括与血凝素或Myc等抗原附属功能区适度融合的膜结合蛋白。
这些序列在与驱动它们表达的调控元件联合时，产生通过惯用方法可以检测到的信号，所述方法包括酶试验、放射照相试验、比色试验、荧光试验或其他光谱照相试验、荧光激活细胞分类试验和免疫试验，所述免疫试验包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫试验(RIA)和免疫组化试验。例如，在标记序列是LacZ基因的地方，可以通过检测β-牛乳糖酶活性的试验探察协助病毒的存在。在选定多核苷酸是荧光素酶的地方，协助病毒可以通过光度计产生的光来检测。
但是，选定多核苷酸优选无标记序列，编码用于生物或医药的产物，如蛋白质、肽、反应核酸(如RNAs)、酶或催化RNAs。选定多核苷酸可以用来矫正或改善基因缺陷，所述基因缺陷可包括正常基因低于正常水平表达，或功能基因产物不表达。优选的选定多核苷酸序列类型编码在宿主细胞中表达的治疗性蛋白或多肽。本发明还进一步包括应用多种选定多核苷酸，例如，来矫正或改善由多个亚单位蛋白导致的基因缺陷。在某些情况下，可应用不同的选定多核苷酸编码蛋白质的每个亚单位，或编码不同的肽或蛋白。当编码蛋白亚单位的DNA较大时，优先考虑上述方法，所述蛋白如编码免疫球蛋白、血小板衍生生长因子或dystrophin蛋白。为使细胞产生多个亚单位蛋白，应用包括每个不同亚单位的重组病毒感染细胞。此外，一个蛋白质的不同亚单位也可以由相同的选定多核苷酸编码。在这种情况下，单独的选定多核苷酸包括编码每个亚单位的DNA，其中每个亚单位的DNA为内部的核酶进入位点(IRES)分隔。当编码每个亚单位的DNA较小时，优先考虑上述方法，例如，编码亚单位的DNA与IRES的总量少于5000碱基。但是，选定多核苷酸可以编码任意需要的研究产物。选定多核苷酸序列的选择不是本发明的限制因素。
选定多核苷酸编码的其他有用产物包括激素，生长和分化因子，所述生长和分化因子包括但不限于胰岛素，胰高血糖素，生长激素(GH)，甲旁素(PTH)，生长激素释放因子(GRF)，卵泡刺激素(FSH)，黄体素(LH)，人绒毛膜促性腺激素(hCG)，血管内皮生长因子(VEGF)，血管生成素，血管抑素，粒细胞集落刺激因子(GCSF)，促红细胞生成素(EPO)，结缔组织生长因子(CTGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子α(TGFα)，血小板衍生生长因子(PDGF)，胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)，转化生长因子β超家族中的任一种，包括TGFβ，activins，抑制素，或骨形态形成蛋白(BMP)BMPs1-15中的任一种，heregulin/neuregulin/ARIA/生长因子neu分化因子(NDF)家族中任一种，神经生长因子(NGF)，脑衍生神经营养因子(BDNF)，神经营养素NT-3和NT-4/5，纤毛神经营养因子(CNTF)，神经胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)，neurturin，agrin，semaphorins/collapsins家族中任一种，netrin-1和netrin-2，肝细胞生长因子(HGF)，ephrins，noggin，sonic hedgehog和酪氨酸羟化酶。
其他有用的选定多核苷酸产物包括调节免疫系统的蛋白，包括但不限于细胞因子和淋巴因子，如促血小板生成素(TPO)，白细胞介素(IL)IL-1-IL-17，单核细胞趋化蛋白，白血病抑制因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，Fas配体，肿瘤坏死因子α和β，干扰素α、β和γ，干细胞因子，flk-2/flt3配体。免疫系统产生的基因产物在本发明也有用途。这些基因产物包括但不限于免疫球蛋白IgG，IgM，IgA，IgD和IgE，嵌合免疫球蛋白，人性化抗体，单链抗体，T细胞受体，嵌合T细胞受体，单链T细胞受体，I型和II型MHC分子，以及经工程学修饰的免疫球蛋白和MHC分子。有用的基因产物还包括补体调节蛋白，如补体调节蛋白，膜辅因子蛋白(MCP)，衰变加速因子(DAF)，CR1，CF2和CD59。
其他选定多核苷酸产生的产物如激素、生长因子、细胞因子、淋巴因子、调节蛋白和免疫系统蛋白的任意一种受体。选定多核苷酸可以是胆固醇调节的一种受体，包括低密度脂蛋白(LDL)受体，高密度脂蛋白(HDL)受体，极低密度脂蛋白(VLDL)受体和清除剂受体。本发明有用的选定多核苷酸序列还可以编码的产物，如类固醇激素受体超家族中成员，包括糖皮质激素受体和雌激素受体，维生素D受体和其他核受体。此外，有用的多核苷酸序列还包括编码以下产物的序列，所述产物如转录因子如jun，fos，max，mad，血清反应因子(SRF)，AP-1，AP-2，myb，MyoD和myogenin，ETS盒所含蛋白，TFE3，E2F，ATF1，ATF2，ATF3，ATF4，ZF5，NFAT，CREB，HNF-4，C/EBP，SP1，CCAAT盒结合蛋白，干扰素调节因子(IRF-1)，Wilms肿瘤蛋白，ETS结合蛋白，STAT，GATA盒结合蛋白，如GATA-3，和翼旋蛋白forkhead家族。
选定多核苷酸序列表达盒编码的其他有用产物包括氨基甲酰合成酶I，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨琥珀酸盐合成酶，精氨琥珀酸盐裂解酶，精氨酸酶，延胡索酰乙酰乙酸水解酶，苯丙氨酸羟化酶，α1抗胰蛋白酶，葡萄糖-6-磷酸酶，胆色素原脱氨酶，因子VIII，因子IX，cystathioneβ合成酶，支链酮酸脱羧酶，白蛋白，异戊酰-coA脱氢酶，丙酰CoA羧化酶，甲基丙二酰CoA变位酶，glutaryl CoA脱氢酶，胰岛素，β葡萄糖苷酶，丙酮酸羧酸酯，肝磷酸化酶，磷酸酶激酶，氨基乙酸脱羧酶，H蛋白，T蛋白，囊性纤维化跨膜调控子(CFTR)序列，以及dystrophincDNA序列。
有用核酸酸编码的其他产物包括非天然存在的多肽，如包括插入、缺失或氨基酸替代物的具有非天然存在氨基酸序列的嵌合或杂交多肽，例如，经工程学修饰的单链免疫球蛋白，反义分子和催化核酸，如核酶。其他适宜的多核苷酸序列可以由本领域技术人员筛选。多核苷酸的选择不被认为是本发明的显著因素。如下实施例所示，示例的选定多核苷酸序列是编码鼠白细胞介素-12的序列。
作为第一条链一部分的是至少1个、优先考虑至少2个、并优选≥3个转录终止子序列。只要在DNA模板(“第二条”)链上表达盒的转录过程不被干扰，表达盒多核苷酸序列的生物功能表达后没有不利影响，转录终止子可以位于DNA编码(即非转录)链的任意位置，包括位于表达盒序列之内。基本上，只要转录可以在第二条“模板”链的一个或多个表达盒互补区域进行，而且表达的蛋白或肽仍然保留其生物功能，第一条链就可以进行任意修饰来整合转录终止子。优选转录终止子不产生可能干扰模板链转录的二级结构。这些终止子序列的功能是当DNA分子的这些链存在于宿主细胞中时，防止从第一条链、以及互补的第二条转录模板链发生多余转录。重要的是，这些第一条链转录终止子不能阻止或干扰从第二条模板链或表达盒开始的必要转录，所述表达盒是从具有双顺反子分子的第一条链有意转录而来的。例如，这些终止子序列的功能防止了多余转录产物的形成，所述多余转录产物如果与宿主细胞中的多核苷酸序列同源，就会关闭或下调其在宿主细胞中的正常转录。而且，这些终止子的功能防止了启动子的物理封闭，因而增加了选定多核苷酸的表达效率。当第一条链是双顺反子(即包括≥2个表达盒，或每条链包括1个表达盒)结构时，相同的限制物放置的位置基于终止子序列的同一性和位置。
基于一条第一条链应用的终止子序列数量，每个终止子序列可以相同，也可以不同。在一个实施方案中，终止子序列是细菌终止子，如5S核糖体RNA终止子，rrnB。在另一个实施方案中，终止子序列也是细菌终止子，如色氨酸操作子终止子，trpA。在另一个实施方案中，终止子序列是噬菌体终止子，如λ5S RNA终止子或噬菌体P1头蛋白终止子。其他值得优选考虑的终止子序列可位于poly A位点3’端，是RNApol II真核休止位点，如P.Enriquez-Harris et al，EMBO J.10(7)1833-1842(1991)中所述位点。α球蛋白终止子是RNA pol II终止子的一个示例，也可以用作该分子第一条链的终止子序列。而且，组蛋白mRNA加工信号，如N.Chodchoy et al，Mol.Cell.Biol.11(1)497-509(Jan.1991)所述，也可作为第一条链的有用终止子序列。同样，哺乳动物胃泌素基因终止子，胃泌素终止子也是有用的。另一种有用的终止子序列是多核苷酸序列，该序列如上所述，提供了核酶裂解位点，随后是终止子序列休止位点。其他用于第一条链的终止子序列包括核糖核酸裂解位点，在3’端随后是终止子序列休止位点。为达成此目的，在第一条链应用的序列还可以是rho依赖性终止子[如，C.E.Bogden et al.，Mol.Cell，3487-493(Apr.1999)]和rho非依赖性终止子[如，I.Gusarov and E.Nudler，Mol.Cell，3495-504(Apr.1999)]。
此外，如M.Nilsson et al.，Science，2652085-2088(1994)所述，一种所谓的“挂锁式探针”是双链或部分双链DNA分子的有用终止子。挂锁是环状单链多核苷酸序列与本发明多核苷酸分子扭转(tortionally)连接，该连接通过在挂锁上的至少10个连续核酸与第一条链上的至少10个连续核酸杂交形成。见图1C和1D。
在该DNA分子第一条链中，至少一个上述终止子序列优选位于启动子的5’端。该第一条链终止子序列优选位于启动子5’端1-50核酸之间。在另一个优先考虑的实施方案中，该第一条链终止子序列位于启动子5’端20-40核酸之间。在另一个优先考虑的实施方案中，该第一条链终止子序列位于启动子5’端10-30核酸之间。因此，在一个实施方案中，挂锁式终止子(或其他任意适宜终止子或核糖核裂解或催化位点的互补序列)可以位于第一条链的5’非翻译区。
在另一个实施方案中，从上述列表中独立选取的第一条链终止子序列，位于poly A位点的3’端，在表达盒至外。该第一条链终止子序列优先考虑位于poly A位点3’端至少100-150核酸之间，或紧随表达盒poly A序列尾部。这样，在另一个实施方案中，挂锁式终止子(或其他任意适宜终止子或核糖核裂解或催化位点的互补序列)可以位于第一条链的3’非翻译区。
而且，在另一个实施方案中，5’端和3’端终止子序列均予采用，将第一条链的表达盒包于其中。
在另一个实施方案中，DNA分子的第一条链，除了将表达盒包围的5’端和3’端终止子序列外，其他可选的终止子序列位于第一条链表达盒序列之外。在本发明另一个实施方案中，至少一个RNA不稳定序列[见，如A.M.Curatola et al，Mol.Cell.Biol.，15(11)6331-6340(Nov.1995)；A.M.Zubiaga et al，Mol.Cell.Biol.，15(4)2219-2230(Apr.1995)]位于第一条链，优选位于表达盒序列之外。优选RNA不稳定序列的互补序列位于3’端侧翼终止子序列的3’端，或5’端侧翼终止子序列的5’端。图1A-1D显示了几个优选实施方案的示意图。
在另一个实施方案中，挂锁式终止子(或其他任意适宜终止子或核糖核裂解或催化位点的互补序列)可以位于表达盒内，更独特的，是位于选定多核苷酸序列的编码序列内。例如，在图1D中，挂锁式终止子就位于多核苷酸序列的编码序列内。在该位置时，终止子序列不能阻止从第二条链与表达盒互补部分的转录，也不能影响表达蛋白的生物功能。换句话说，第一条链中存在的终止子序列不能防止或阻止第二条链的转录，这样，无论第一条链终止子序列位置如何，选定多核苷酸序列总是可以正确转录、表达，并维持其生物功能。在这种位置，位于编码区内的终止子序列可以是上面鉴定的终止子中的任意一种，包括上述挂锁式探针，但终止子不能阻止第二条链的转录，也不能影响表达蛋白质的生物功能。
作为备选或其他实施方案，第一条链应避免任何导致引入ATG(起始密码子)或Kozak区的修饰。单独或联合的这些修饰，可以防止反义RNA的多余转录。但是可能的话，可以通过在编码链内一个或多个位点添加RNA不稳定序列的互补序列，来加强预防双链RNA的形成。该链无意中形成的任何多余反义RNA均含有促进RNA降解的不稳定序列，并且不能与正义RNA杂交。
作为一个值得注意的修饰，DNA分子第一条链缺乏任何倒转互补重复序列，该序列长度超过7个连续核酸，并位于该链的任意位置。例如，第一条链含有一个序列，例如ATGCTTA，那么在第一条链的任意位置都不会存在其倒转互补序列TAAGCAT。倒转互补重复序列的缺乏可以避免在37℃ ，在同一链内发生多余的内部碱基配对，所述温度是哺乳动物宿主细胞的正常体温。当DNA分子在宿主细胞中转录成RNA时，或当第一条链是单链DNA分子是，这一点尤其重要。作为另一个备选实施方案，DNA分子第一条链缺乏任何倒转互补重复序列，该序列长度超过4个连续核酸，并位于该链的任意位置。倒转互补重复序列的缺乏可以避免在一些非脊椎动物宿主细胞体温更低的条件下，在同一链内发生多余的内部碱基配对。
在另一个有关本发明DNA分子第一条链的实施方案中，第一条链的“变动”核酸可以操作用以改变核酸序列，防止或消除序列中任意倒转互补重复序列。这些变动核酸通常位于绝大多数密码子的第三个碱基位置，但也可位于第一或第二个碱基位置。消除重复序列的方式可以避免DNA转录成畸变RNA结构，该结构可以形成稳定的双链区，或呈现倒转互补重复序列，或与宿主多核苷酸序列基本同源。此外，在另一个有关本发明DNA分子第一条链的实施方案中，当选定多核苷酸序列与宿主细胞中业已存在的多核苷酸序列太同源时，改变第一条链含有的选定多核苷酸序列部分的几乎所有密码子的变动核酸。通过仅仅改变这些碱基，使密码子发生变化而编码的氨基酸不改变，这样选定多核苷酸序列仍然编码相同的氨基酸序列，但提供的核酸序列却与宿主细胞或宿主有机体中的所需多核苷酸序列基本不同源。“变动”密码子的非互补区可以防止宿主细胞中DNA分子的转录产物多余或无意关闭或下调同源多核苷酸序列，所述同源序列是转染宿主细胞的天然或必需序列。见图2A和2B。“几乎所有”变动碱基是指变动足够多的密码子，以破坏选定多核苷酸与宿主细胞中任意多核苷酸的同源性，来防止宿主细胞中多核苷酸序列的关闭。
当DNA是重组产生的时，变动碱基可以通过众所周知的突变技术来改变。当DNA是合成的时，变动密码子碱基的制备应预先想好，避免与所需宿主细胞或有机体中的天然序列匹配。变动碱基可以选择来整合优选密码子，使密码子在选定宿主细胞中的表达最优化，并避免上述畸变RNA结构。见，如美国专利号5,786,464，该专利教导了优选密码子的筛选。
本领域众所周知，这里应用的术语“同源”或“同源的”指两个多肽或两个多核苷酸序列的序列相关程度，通过测定这些序列两个长度之间的完全匹配进行。同一性或同源性可以通过本领域现存的方法计算[见，如COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，(1988)；BIOCOMPUTINGINFORMATICS AND GENOME PROJECTS，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，(1993)；COMPUTER ANALYSIS OFSEQUENCE DATA，PART I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，(1994)；SEQUENCE ANALYSIS INMOLECULAR BIOLOGY，von Heinje，G.，Academic Press，(1987)；andSEQUENCE ANALYSIS PRIMER，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，MStockton Press，New York，(1991)]。在两个序列间测定同一性或同源性的常用方法包括但不限于在GUIDE TO HUGE COMPUTERS，Martin J.Bishop，ed.，Academic Press，San Diego，1994，and H.Carillo and D.Lipton，SJAMJ.Applied Math.，481073(1988)中公开的方法。测定同一性或同源性的方法优选设计成给两个待测序列最大匹配。在两个序列中测定同一性或同源性的优选计算机程序方法包括但不限于GCG程序包的工作步骤BESTFIT[J.Devereux et al.，Nucl.Acids Res.，12(1)387(1984)]，相关MACVECTOR程序(Oxford)，和FASTA(Pearson)程序。应用这些计算机程序能够设计出本发明所需应用的适宜DNA和RNA分子。任意特定DNA或RNA分子所需的工作步骤和/或同源程度可以由本领域任一技术人员选择。应当理解，必需同源性的选择，默认程序的选择和应用程序计算同源性的选择属于本领域技术范畴，在现存科学文献中有关于这一规范和知识的文献。
B.第二条链本发明双链或部分双链DNA分子，或本发明其他单链DNA分子，包括一条优选的第二条“转录模板”链。细菌产生的质粒中，第二条链与第一条链通常100％互补，但这不是必须的，例如，当至少一条链是人工合成并与基本同源的链结合时。如果两条链的同源性足够充分，Tm足够高，那么两条链在适宜的条件下就会结合在一起，与第一条链不同源的某些区域就可以存在在第二条链上。
第二条链包括至少一个第二条链终止子序列，该终止子序列可以终止在第二条链上起始的任何转录。第二条链终止子序列位于第二条链上，第二条链上的序列与表达盒序列不互补。优选地，DNA分子的第二条链包括1个以上的第二条链终止子序列。更优选地，在表达盒互补序列之外，第二条链每100个核酸含有2-1个终止子序列。在另一个优选实施方案中，在与第一条链表达盒不互补的区域，第二条链每500个核酸含有1个终止子序列。如果应用的第二条链终止子序列超过1个，如上所述，多个终止子序列就应该分散分布于第二条链上与表达盒不互补的区域。
在另一个实施方案中，需要在第一条正义链的一个或多个位置上包括终止子序列，包括终止子序列位于顺反子或表达盒内，甚至位于感兴趣基因或多核苷酸内，需要转录成mRNA的第二条反义DNA链应该有一定程度的非同源性。在另一个实施方案中，在与第一条链编码区互补的区域外，第二条链包括一个或多个转录终止子或RNA不稳定序列。只有在这些改变不产生功能多肽，并不负向影响转录时，才能对第二条链进行一般的改变。当顺式终止子或不稳定序列在质粒的正义链编码时，第二条、反义或转录链的核酸必须只能包括保守或无义突变，或不改变或不负向影响所得氨基酸序列的其他突变。在这样的实施方案中，任何表达蛋白的功能必须不被负向影响。
第二条链的每个终止子序列可以相同，也可以彼此之间不同。这些终止子序列包括上面鉴定的作为第一条链终止子序列的序列。在一个实施方案中，终止子序列可以是细菌终止子，如rrnB或trpA。在另一个实施方案中，终止子序列可以是噬菌体终止子，如λ5S RNA终止子或噬菌体P1头蛋白终止子。其他可以应用的所需终止子序列是一个多核苷酸序列，该序列提供了核酶裂解位点或核糖核酸裂解位点，在3’端随后是真核休止位点，如RNA pol II休止位点或α球蛋白终止子。而且，组蛋白mRNA加工信号也是第二条链有用的终止子序列。同样，哺乳动物胃泌素基因终止子，胃泌素终止子也是有用的。为达成此目的，第二条链还可应用的序列有rho依赖性终止子和rho非依赖性终止子。此外，如上所述，如果第二条链是双链或部分双链DNA分子的一部分，挂锁式终止子序列也是第二条链有用的终止子。
在本发明一个有关第二条链的实施方案中，终止子序列位于第二条链上与表达盒不互补的区域内，并位于第一条链poly A位点的相邻3’端(见图1B)。在本发明另一个实施方案中，第二条链终止子序列位于第二条链上与表达盒序列不互补区域内，距poly A位点少于200核酸(见图1C)。在备选实施方案中，第二条链包括一个位于第一条链启动子序列5’端的终止子序列(见图1A-1C)。一个优选实施方案包括多个终止子序列，散在分布于第二条链上与第一条链表达盒不互补的所有区域(见图1B和1C)。
在另一个有关DNA分子第二条链的实施方案中，涉及的第二条链还包括至少一个RNA不稳定序列，该序列位于第二条链上与表达盒序列不互补的区域内。优选地，在第二条链该区域存在1个以上的不稳定序列。而且，如第一条链，在哺乳动物细胞或哺乳动物中应用时，第二条链优选不包括任何超过7个核酸的互补倒转重复序列，在非脊椎动物细胞或有机体中应用时，第二条链优选不包括任何超过4个核酸的互补倒转重复序列。
在本发明另一个有关DNA分子第二条链的实施方案中，第二条链中的“变动”核酸可以操作以改变核酸序列，防止或消除序列中任一倒转互补重复序列。以该方式消除这些重复序列可以避免DNA转录成RNA后，形成双链区域。此外，在本发明另一个有关DNA分子第二条链的实施方案中，涉及当存在分子中选定多核苷酸序列与宿主细胞中业已存在的多核苷酸序列太同源的可能性时，改变第二条链与选定多核苷酸序列互补部分的几乎所有密码子的变动核酸。通过仅仅改变这些碱基，使密码子发生变化而编码的氨基酸不改变，这样选定多核苷酸序列仍然编码相同的氨基酸序列，但提供的核酸序列却与宿主细胞或宿主有机体中的所需多核苷酸序列基本不同源。“变动”密码子的非互补区可以防止宿主细胞中DNA分子的转录产物多余或无意关闭或下调同源多核苷酸序列，所述同源序列是转染宿主细胞的天然或必需序列。见图2A和2B。“几乎所有”变动碱基是指变动足够多的密码子，以破坏选定多核苷酸与宿主细胞中任意多核苷酸的同源性，来防止宿主细胞中多核苷酸序列的关闭。当DNA是重组生产的时，变动碱基可以通过众所周知的突变技术进行改变。当DNA是合成的时，变动碱基的制备应预先想好，避免与所需宿主细胞或有机体中的天然序列匹配。
本发明DNA分子，无论包括上述第一条链和第二条链的双链或部分双链，还是由上述第一条链或第二条链构成的单链，可以使细胞内转录的核酸序列成为单链正义或反义RNA链，该转录RNA链不具有形成任何有意义双链的能力。DNA分子可以提供一个单链RNA序列，该序列包括正义多核苷酸序列和反义多核苷酸序列，可以选择应用非配对碱基多核苷酸序列将其分隔。
本发明的这些DNA分子可以参照下面详细描述的方法制备、应用。
II.本发明RNA分子根据本发明的另一种组合物基本上是单链RNA分子，该RNA分子包括具有5’端和3’端的核糖核酸序列，并被设计成防止在宿主细胞中形成稳定双链RNA或部分双链RNA分子。可以选择地，该分子可以包括5’端ATG密码子。当RNA不需要翻译时，就不需要5’端ATG，例如，催化RNA分子，如核酶或反义RNA。可以选择地，调控区如Kozak序列可以位于5’端ATG密码子之前。该单链RNA分子可以是线性分子。此外，该单链RNA分子也可以是环状的。
该单链RNA分子包括选定多核苷酸序列，该序列在宿主细胞中翻译时，可以产生选定生物功能。选定多核苷酸序列可以是编码序列，即当它被翻译时，可以表达一种蛋白质或其功能片段。此外，选定序列也可以不是编码序列，但可能具有调控功能或其他生物功能。具有生物功能的选定多核苷酸序列可以从上述DNA分子的第一条链序列中选择。
该单链RNA多核苷酸序列长度大约为100-10,000个多核苷酸。目前，最值得优先考虑的序列长度为至少200个多核苷酸，但在一个实施方案中，其长度范围为200-8000个多核苷酸。在另一个实施方案中，RNA分子的长度可以少于7500个多核苷酸。在另一个实施方案中，RNA分子序列长度可以少于大约5000个多核苷酸。在另一个实施方案中，RNA分子序列长度可以少于大约2000个多核苷酸。在另一个实施方案中，RNA分子序列长度可以少于大约1000个多核苷酸。在另一个实施方案中，RNA分子序列长度可以少于大约750个多核苷酸。
在一个实施方案中，单链RNA分子在3’端可以含有一个小发夹序列，即一个不超过5个核酸的双链序列。在另一个实施方案中，最初作为RNA分子一部分的任意发夹序列，被从该分子中去除。
在本发明关于RNA分子的一个实施方案中，RNA序列缺乏任何倒转互补重复序列，该序列长度超过7个连续核酸，并位于该链任意位置。例如，当第一条链含有序列，如AUGCUUA时，RNA链的任意位置都没有其倒转互补序列UAAGCAU。倒转互补重复序列的缺乏可以避免在37℃，在同一链内发生多余的内部碱基配对，所述温度是哺乳动物宿主细胞的正常体温。作为另一个备选实施方案，单链RNA分子缺乏任何倒转互补重复序列，该序列长度超过4个连续核酸，并位于该链的任意位置。倒转互补重复序列的缺乏可以避免在一些非脊椎动物宿主细胞体温更低的条件下，在同一链内发生多余的内部碱基配对。
在本发明另一个关于单链RNA分子的实施方案中，链内“变动”核酸可以操作以改变核酸序列，防止或消除序列中存在的任一倒转互补重复序列。以该方式消除这些重复序列可以防止畸变双链RNA区域的形成。此外，在本发明另一个有关RNA分子的实施方案中，涉及当存在分子中选定多核苷酸序列与宿主细胞中业已存在的多核苷酸序列太同源的可能性时，改变该链翻译成选定多核苷酸序列部分的几乎所有密码子的变动核酸。通过仅仅改变这些碱基，使密码子发生变化而编码的氨基酸不改变，这样选定多核苷酸序列仍然编码相同的氨基酸序列，但提供的核酸序列却与宿主细胞或宿主有机体中的所需多核苷酸序列基本不同源。“变动”密码子的非互补区可以防止同源多核苷酸序列的多余或无意关闭或下调，所述同源多核苷酸序列是转染宿主细胞的天然或必需序列。“几乎所有”变动碱基是指变动足够多的密码子，以破坏选定多核苷酸与宿主细胞中任意多核苷酸的同源性，来防止宿主细胞中多核苷酸序列的关闭。当RNA是重组生产的时，变动碱基可以通过众所周知的突变技术进行改变。当RNA是合成的时，变动碱基的制备应预先想好，避免与所需宿主细胞或有机体中的天然序列匹配。
在另一个实施方案中，当单链RNA分子包括所需宿主细胞中基因染色体拷贝时，制备的该单链RNA与染色体RNA应该不能区分。该分子在选定多核苷酸序列的侧翼不包括非同源序列，所述选定多核苷酸序列在核糖核酸序列方面与天然序列完全相同。设计的该分子可以避免与非同源侧翼序列产生畸变的部分双链RNA，该畸变RNA可以导致细胞关闭染色体基因。
在本发明另一个实施方案中，所述单链RNA分子在分子的5’端包括一个帽。在另一个实施方案中，该单链RNA分子在序列的5’端没有帽。
在本发明另一个实施方案中，所述单链RNA分子在分子的3’端包括一个poly A序列。在另一个实施方案中，该单链RNA分子在序列的3’端没有poly A序列。
在另一个实施方案中，单链RNA分子与3’端羟基连接，该3’端羟基是作为支链终止子阻止发夹(一个双链区)延长的修饰成分。这些化学等分包括但不限于双脱氧核酸(ddNTPs)，3’氨基核酸三磷酸，3’甲基核酸三磷酸，以及3’phosphorylthioate核酸三磷酸。其他的支链终止子可以由本领域技术人员选择。
本发明关于单链RNA分子的其他实施方案包括RNA序列，该序列提供了3’端拓扑结或套索，也发挥防止支链延长的作用。这些结构可以根据Smith and Nikonowicz，Biochem.，3713486-13498(1998)制备。
本发明关于单链RNA分子的其他实施方案包括RNA序列，该序列包括两个或多个上述修饰。例如，本发明的一个RNA分子具有5’端帽和poly A尾；或者没有5’端帽，没有倒转重复序列，但有poly A尾。另一个实施方案没有倒转重复序列，在3’端有支链终止子，没有poly A尾。本领域技术人员可以结合上述其他修饰来制备本发明RNA分子。
值得注意的是，应该避免RNA分子形成双链或部分双链，防止同源多核苷酸序列的无意关闭或下调，所述同源多核苷酸序列是宿主细胞的天然序列，或是宿主细胞或有机体的必需序列。本发明的这些RNA分子可以根据下面详细描述的方法和组合物来制备、应用。
III.DNA和RNA分子的制备上述DNA和RNA分子可以通过本领域熟知的方法设计、制备。这些分子可以通过上述修饰来增强选定序列的表达，防止多余或畸变多核苷酸种类的转录，进而避免宿主细胞或宿主有机体多核苷酸序列的无意关闭。
这些多核苷酸分子可以通过传统技术设计，如在上面引用的Sambrook或在Promega Protocols and Application Guide(3rded.1996)，eds.Doyle，ISBN No.1-883374-57-1中描述的技术。
在一个实施方案中，根据上面引用的文献所述的传统方法，应用例如噬菌体T7，T3或SP6 RNA聚合酶，通过传统酶合成法体外制备RNA分子。例如，在一个实施方案中，本发明的RNA或DNA分子是在宿主细胞中制备的，该宿主细胞转染了包括T7启动子的质粒或其他包括T7 RNA聚合酶的质粒。
在另一个实施方案中，这些分子可以通过化学合成法体外制备[见，如Q.Xu et al，Nucl.Acids Res.，24(18)3643-4(Sept.1996)；N.Naryshkin et al，Bioorg.Khim.，22(9)691-8(Sept.1996)；J.A.Grasby etal，Nucl.Acids Res.，21(19)4444-50(Sept.1993)；C.Chaix et al，Nucl.Acids Res.，17(18)7381-93(1989)；S.H.Chou et al，Biochem.，28(6)2422-35(Mar.1989)；O.Odai et al，Nucl.Acids Symp.Ser.，21105-6(1989)；N.A.Naryshkin et al，Bioorg.Khim.，22(9)691-8(Sept.1996)；S.Sun et al，RNA，3(11)1352-1363(Nov.1997)；X.Zhang et al，Nucl.AcidsRes.，25(20)3980-3(Oct.1997)；S.M.Grvaznov et al，Nucl.Acids Res.，26(18)4160-7(Sept.1998)；M.Kadokura et al，Nucl.Acids Symp.Ser.，3777-8(1997)；A.Davison et al，Biomed.Pept.Proteins.Nucl.Acids，2(1)1-6(1996)；and A.V.Mudrakovskaia et al，Bioorg.Khim.，17(6)819-22(Jun.1991)]。
此外，这些分子可以通过重组方法在培养的宿主细胞中制备，并从中分离。用于本发明的DNA或RNA分子可以在重组微生物或重组宿主细胞中制备，然后通过传统技术从培养物中分离。重组微生物如细菌和酵母，重组宿主细胞如哺乳动物细胞。见，如上面引用的Sambrook中描述的技术，该文献是细化这些技术的实验室手册的一个示例，以及在美国专利号5,824,538、5,877,159和5,643,771中描述的技术，上述文献在此引入，作为参考。
根据S.Wang et al，Nucl.Acids Res.，22(12)2326-33(June 1994)；Y.Matsumoto et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87(19)7628-32(Oct.1990)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91(8)3117-21(Apr.1994)；M.Tsagris et al，Nucl.Acids Res.，19(7)1605-12(Apr.1991)；S.Braun et al，Nucl.AcidsRes.，24(21)4152-7(Nov.1996)；Z.Pasman et al，RNA，2(6)603-10(Jun.1996)；P.G.Zaphiropoulos，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93(13)6536-41(Jun.1996)；D.Beaudry et al，Nucl.Acids Res.，23(15)3064-6(Aug.1995)描述的技术，可以制备环状RNA分子。这些文献在此引入，作为参考。
设定这里提供的文献，上面的参考文献为本领域技术人员提供了制备下面特定实施方案中任意一种分子的必要技术。
这体外制备或合成的DNA和/或RNA分子可以作为多核苷酸分子直接导入宿主细胞或宿主有机体。此外，选定DNA或RNA分子可以在活的、减毒或死的、灭活重组细菌中导入宿主细胞，所述细菌被设计成包括本发明所需DNA或RNA分子的必需序列。这些重组细菌、真菌等可以通过应用传统技术来制备，所述传统技术如美国专利号5,824,538、5,877,159和65,643,771所述，在此引入，作为参考。用于制备这些导入剂的微生物包括上述引用文献中列出的，包括但不限于大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、以及假单胞菌属、链霉菌属、葡萄球菌属和志贺菌属的多种细菌。
通过活的、减毒或死的、灭活病毒，特别是携带上述所需DNA或RNA多核苷酸序列的重组病毒，可以在宿主细胞或宿主内形成DNA或RNA分子。这些病毒可以设计成与现在用于基因治疗等技术将基因导入细胞的重组病毒类似。这些有用的病毒或病毒序列包括但不限于α病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒、λ病毒、痘病毒、肝炎病毒、疱疹病毒、papova病毒(如SV40)、脊髓灰质炎病毒、假性狂犬病病毒、逆病毒、牛痘病毒、正链和负链RNA病毒、类病毒和virusoids，或其部分，所述病毒或病毒序列可以操作用以给宿主细胞体内提供RNA或DNA分子。这些病毒可以通过应用传统技术来设计，所述传统技术如M.Di Nocola et al，Cancer Gene Ther.，5(6)350-6(1998)，以及本发明的其他文献所述。
在宿主细胞中形成所需上述DNA或RNA分子也可发生在活的、减毒或死的、灭活献体细胞中，如上所述，所述献体细胞体外转染或感染合成RNA分子或DNA分子或重组病毒。然后如下详述，将这些献体细胞导入宿主。这些献体细胞优先考虑宿主种类的细胞，并作为宿主将它们导入其中，例如，哺乳动物细胞，如C127，3T3，CHO，LeLa，人肾细胞293，BHK细胞系和COS-7细胞，可以作为哺乳动物有用的宿主细胞。这些献体细胞可以应用如与Emerich et al，J.Neurosci.，165168-81(1996)所述相似的技术来制备。更优选地，从特定宿主中收获献体细胞，并通过活体外操作将收获的细胞制备成献体细胞，所述活体外操作技术与过继转移技术类似，如在D.B.Kohn et al，Nature Med.，4(7)775-80(1998)中所述。
最后，如上所述，本发明的这些分子还可以制备成合成RNA分子或合成DNA导入分子的混合物，或制备成重组细菌、细胞和病毒，或存在于重组细菌、细胞和病毒内。混和组合物可以由本领域技术人员选择。
IV.本发明医药(治疗或预防)、诊断或研究组合物与方法本发明组合物可用于体外或组织培养方法，提高宿主细胞中选定多核苷酸序列的表达效率，或者，如果应用相同的方法(除复苏步骤)，也可用于选定多核苷酸的体内或活体外有效表达。本方法的一个实施方案包括应用上述双链或部分双链DNA分子或RNA分子转染宿主细胞的步骤，进而抑制宿主细胞中由多核苷酸分子转录或翻译而来的畸变多核苷酸种类的形成。在该方法的一个实施方案中，宿主细胞存在于试验试管或组织培养中，该方法能够使宿主细胞多核苷酸产物编码的产物表达和回收量最大化。例如，宿主细胞可以通过传统方法裂解，并收获产物；或者，如果产物是分泌型的，可以通过传统技术从培养基中收获。
当宿主是存活的哺乳动物时，方法涉及给哺乳动物受体应用有效剂量的药物组合物，所述药物组合物包括上述多核苷酸分子、可选的促进细胞摄入多核苷酸的试剂和适宜的药用载体。本发明药物组合物优先考虑包括DNA或RNA分子，或其混合物，药用载体，以及可选的药物导入组分。药物组合物的特定制剂有赖于活性剂的形式。
适宜的药用载体使本发明多核苷酸组合物的给药更加容易，但应该是无生理学活性的和/或无害的。载体可以由本领域技术人员选择。这些载体包括但不限于无菌生理盐水、磷酸缓冲盐溶液、葡萄糖、无菌水、甘油、乙醇、乳糖、蔗糖、磷酸钙、白明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、芝麻油、水及其组合。此外，载体或稀释液可以包括一种时间延迟物质，如单独的一硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，或其与蜡的组合。此外，还可应用缓释聚合物制剂。制剂还应该适应给药方式。根据给药方式选择适宜的载体可以由本领域技术人员常规进行。
可以应用众所周知的将DNA导入细胞的技术，将本发明的这些分子以多核苷酸的方式导入细胞。在分子是噬菌体或病毒载体的情况下，可以并优选以包裹或有衣壳的DNA或RNA病毒的形式，通过众所周知的感染和转导技术导入细胞。病毒载体可以竞争性复制，也可以缺陷复制。在后一种情况下，病毒的增殖通常仅发生在补充宿主细胞中。
当组合物包括一个多核苷酸分子，如DNA分子、质粒、病毒载体、或重组病毒、或多核苷酸的多个拷贝或不同的多核苷酸时，如上所述，该组合物优选考虑制备成仅与载体组合的“裸”多核苷酸。此外，这些组合物还可以优先考虑包括可以选择的多核苷酸促进剂或“助剂”，如局麻制剂，肽，脂质包括阳离子脂质、脂质体或脂质颗粒，多阳离子体如聚赖氨酸，分支三维多阳离子体如分支聚合物(dendrimer)，碳水化合物，阳离子亲水脂分子，去污剂，苄铵表面活性剂，或其他使多核苷酸转入细胞更加容易的化合物。用于本发明的这些促进剂或助剂的非全部示例如美国专利号5,593,972、5,703,055、5,739,118、5,837,533和1996年4月4日公开的国际专利申请号WO96/10038，以及1994年8月8日公开的国际专利申请号WO94/16737所述，这些文献在此引入，作为参考。
当应用的促进剂是局麻制剂时，优选丁哌卡因，剂量基于多核苷酸组合物的总重量，优选剂量大约为0.1-1.0重量％。还见，国际专利申请号PCT/US98/08799，应用泡状复合体导入；以及国际专利申请号PCT/US98/22841，该文献给出联合苄铵表面活性剂作为助剂，应用剂量大约为0.001-0.03重量％。上述文献在此引入，作为参考。
当组合物不仅仅是多核苷酸时，如，如上所述是转染献体细胞或细菌，组合物还可包括其他试剂，如在美国专利号5,824,538、5,643,771和5,877,159中探讨的那些试剂，所述文献在此引入，作为参考。
其他可以存在于任意组合物中的组分是佐剂、防腐剂、化学稳定剂或其他抗原蛋白。典型地，为了达成在靶动物或人中的功效，需要将稳定剂、佐剂和防腐剂最优化，以形成最好的制剂。适宜的防腐剂的示例包括氯丁醇，山梨醇钾，山梨酸，二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯，乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。可以应用的适宜稳定成分包括，例如，酪蛋白氨基酸，蔗糖，白明胶，酚红，N-Z胺，二磷酸一钾，乳糖，乳白蛋白水解产物和奶粉。传统的佐剂用来吸引白细胞或增强免疫应答。这些佐剂包括Ribi，矿物油和水，氢氧化铝，Amphigen，L121/角鲨烯，D-丙交酯-聚交酯/糖苷，pluronic plyois，胞壁酰二肽，灭活博德特氏菌和皂苷，如Quil A。
此外，其他可以作为转染剂和/或复制剂和/或炎症剂、并可与本发明组合物伴随给药的制剂，包括生长因子，细胞因子和淋巴因子如α-干扰素、γ-干扰素，血小板衍生生长因子(PDGF)，集落刺激因子如G-CSF、GM-CSF，肿瘤坏死因子(TNF)，表皮生长因子(EGF)，和白细胞介素，如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和IL-12。此外，成纤维细胞生长因子，表面活性剂如免疫刺激复合体(ISCOMS)，Freund’s不完全佐剂，LPS类似物包括单磷酰基脂质A(MPL)，胞壁酰肽，醌类似物和泡状复合体如角鲨烯和透明质酸，也可与本发明组合物联合应用。
药物组合物还可包括其他适于组合物选定给药形式的添加剂。这样，这些组合物可以包括添加剂，适于通过任何传统给药方式给药，包括但不限于，胃肠道外给药，腹膜内给药，静脉内给药，肌内