骨生长因子控释型骨修复材料及其制备方法与应用制作方法_孔杰专利（控释,生长因子,修复）-早鸽网

一种骨生长因子控释型骨修复材料及其制备方法与应用制作方法

专利名称

一种骨生长因子控释型骨修复材料及其制备方法与应用制作方法
发明者

孔杰, 屠美, 曾戎, 汪炬, 王丁丁
公开日

2011年8月24日
申请日期

2011年4月14日
优先权日

2011年4月14日
申请人

暨南大学
文档编号

A61L27/36GK102160900SQ20111009404
关键字

控释生长因子修复材料
权利要求

1.一种骨生长因子控释型骨修复材料，其特征在于所述的骨生长因子控释型骨修复材料是多孔骨修复无机材料的孔表面包裹两层膜，从内至外，第一层膜的主要成分为骨生长因子和壳聚糖按质量比(0.05 0.1) 1混合得到；第二层膜的主要成分为骨生长因子和生物降解性聚阴离子按质量比(0 0.001) 1混合得到2.根据权利要求1所述的骨生长因子控释型骨修复材料，其特征在于所述的多孔骨修复无机材料为钙磷生物陶瓷多孔骨修复材料、贝壳基多孔骨修复材料、珊瑚基多孔骨修复材料、生物活性玻璃多孔骨修复材料或生物型多孔骨修复材料3.根据权利要求1所述的骨生长因子控释型骨修复材料，其特征在于所述的壳聚糖为脱乙酰度为70% 100%、分子量为8000 150万的壳聚糖4.根据权利要求1所述的骨生长因子控释型骨修复材料，其特征在于所说的骨生长因子为骨形态发生蛋白_2、成纤维细胞生长因子_2、转化生长因子-β、胰岛素样生长因子-1、血小板衍化生长因子及它们相应活性肽中的一种或至少两种5.权利要求1 4任一项所述的骨生长因子控释型骨修复材料的制备方法，其特征在于包含以下步骤(1)将壳聚糖溶于体积百分比0.5 3%的乙酸水溶液，得到壳聚糖溶液；然后在搅拌条件下，按骨生长因子与壳聚糖的质量比为(0.05 0.1) 1的比例加入骨生长因子，混合均勻；(2)将生物降解性聚阴离子溶于去离子水，得到生物降解性聚阴离子溶液；然后在搅拌下，按骨生长因子与生物降解性聚阴离子的质量比为(0 0.001) 1的比例加入骨生长因子，混合均勻；(3)将多孔骨修复无机材料负压下浸入步骤(1)制成的最终溶液中，保持0.5 2小时，取出晾干；(4)将步骤C3)处理的多孔骨修复材料负压下浸入步骤( 制成的最终溶液中，保持 0. 5 2小时，取出晾干，灭菌，即制成一种骨生长因子控释型骨修复材料6.根据权利要求5所述的骨生长因子控释型骨修复材料的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的壳聚糖溶液的浓度为质量体积比0.01% 3% ；步骤(1)中所述的搅拌的速度为800 3000r/min ；步骤O)中所述的生物降解性聚阴离子溶液的浓度为质量体积比0.01% 3% ；步骤(3)中所述的负压的条件为0. 01 0. IMpa ；步骤⑷中所述的负压的条件为0. 01 0. IMpa ；步骤中所述的灭菌为环氧乙烷灭菌或钴60辐照灭菌7.根据权利要求6所述的骨生长因子控释型骨修复材料的制备方法，其特征在于所述的壳聚糖溶液的浓度为质量体积比；所述的生物降解性聚阴离子溶液的浓度为质量体积比0. 05% 0. 1%8.权利要求1 4任一项所述的骨生长因子控释型骨修复材料用于医学临床领域9.根据权利要求8所述的骨生长因子控释型骨修复材料用于医学临床领域，其特征在于所述的骨生长因子控释型骨修复材料用于制备人工骨修复材料
技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，特别涉及一种骨生长因子控释型骨修复材料及其制备方法与应用
背景技术
具体实施例方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此实施例1控释型BMP-2/生物型骨修复材料(1)称取1. Og壳聚糖溶于0. 5% (ν/ν)的乙酸溶液，配成浓度为质量体积比0. 1% 的壳聚糖溶液，然后在搅拌下(转速800r/min)，按骨形态发生蛋白-2 (BMP-幻与壳聚糖的质量比为0.05 1的比例加入BMP-2，混合均勻；(2)称取1. Og透明质酸钠溶于去离子水，配成浓度为质量体积比0. 的溶液；(3)称取0. 5g生物型多孔骨修复材料(广东冠昊生物科技股份有限公司样品)负压(0. OlMPa)下浸入步骤(1)制成的终溶液中，保持1小时，取出晾干；(4)将步骤(3)处理的多孔骨修复材料负压(0. IMPa)下浸入步骤(2)制成的终溶液中，保持1小时，取出晾干，再经环氧乙烷灭菌，即制成一种控释型BMP-2/生物型骨修复材料所得材料不同放大倍数下的扫描电镜(SEM)照片(如图1所示)表明生物型多孔骨修复材料保持了多孔形态，且在孔壁上覆盖有含生长因子的复合膜 (5)将步骤(4)所得控释型BMP-2/生物型骨修复材料浸入2mL的0. 01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS, pH7.4)中，同时加入0.02%叠氮钠(w/v)防腐，然后放置于37°C恒温箱中并持续搅拌释放，同时设置对照组(制备过程为生物骨修复材料在0. OlMI^负压下浸入含有质量体积比0. 005% BMP-2的0. 尿素溶液中，保持1小时，取出晾干，环氧乙烷灭菌即得BMP-2直接复合多孔骨修复材料)从0天 15天平均每1 取上清一次，每次30 μ 1，人BMP-2ELISA试剂盒检测各上清液中的BMP-2含量(对照组每池取上清一次)，汇总后绘制此控释型BMP-2/生物型骨修复材料中BMP-2的释放曲线，如图2所示体外药物释放曲线显示，此控释型BMP-2/生物型骨修复材料中复合的BMP-2至少能在10天的时间内实现持续释放，前5天的释放量达到总药量的60 %，然后持续至10天时，释药量达到93 %，在第13天时药物释放完全对照组为BMP-2直接复合多孔骨修复材料，在他时药物即完全释放说明此控释型BMP-2/生物型骨修复材料实现了所负载的生长因子BMP-2的持续缓慢释放实施例2控释型BMP-2/bFGF/TCP骨修复材料(1)称取l.Og壳聚糖溶于1.0% (ν/ν)的乙酸溶液，配成浓度为质量体积比 0.05%的溶液，然后在搅拌(转速3000r/min)下，按BMP-2和bFGF与壳聚糖的质量比为 0.1 0.001 1的比例加入BMP-2和bFGF，混合均勻；(2)称取1. Og羧甲基壳聚糖溶于去离子水，配成浓度为质量体积比0. 05%的溶液；(3)称取0. 5g钙磷生物陶瓷多孔骨修复材料TCP (武汉华威生物材料工程有限公司β-TCP人工骨，商品名百美特人工骨)负压(0. IMPa)下浸入步骤(1)制成的溶液中，保持2小时，取出晾干；(4)将步骤(3)处理的多孔骨修复材料负压(0. OlMPa)下浸入步骤(2)制成的溶液中，保持2小时，取出晾干，再经钴60辐照灭菌，即制成一种控释型BMP-2/bFGF/TCP骨修复材料(5)将步骤(4)所得控释型BMP-2/bFGF/TCP骨修复材料浸入2ml的0. Olmol/ L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)中，同时加入0.02%叠氮钠(w/v)防腐，然后放置于37°C 恒温箱中并持续搅拌释放，同时设置对照组(制备过程为钙磷生物陶瓷多孔骨修复材料 TCP在0. IMPa负压下浸入含有质量体积比0. 0001 % bFGF和质量体积比0. 01 % BMP-2混合的0. 尿素溶液，保持2小时，取出晾干，钴60辐照灭菌即得bFGF+BMP-2溶液直接复合材料)从0天 25天平均每1 !取上清一次，每次30 μ 1，人bFGF ELISA试剂盒和人 BMP-2ELISA试剂盒分别检测各上清液中的bFGF和BMP-2的含量(对照组每池取上清一次)，汇总后绘制此控释型BMP-2/bFGF/TCP骨修复材料中bFGF和BMP-2的体外共释放曲线，如图3所示体外药物共释放曲线显示，此控释型BMP-2/bFGF/TCP骨修复材料中复合的bFGF至少能在12天的时间内实现持续释放，前4天的释放量达到总药量的60%，然后持续至12天时，释药量达到96%，在第15天时药物释放完全而BMP-2至少能在18天内实现持续释放，前6天的释放量达到总药量的58 %，然后持续至18天时，释药量达到95 %，在第20天时药物释放完全对照组为bFGF+BMP-2溶液直接复合材料组，bFGF和BMP-2分别在他和他时药物即完全释放说明此控释型BMP-2/bFGF/TCP骨修复材料实现了所负载的生长因子bFGF和BMP-2的持续缓慢释放实施例3 控释型BMP-2/bFGF/生物型骨修复材料(1)称取l.Og壳聚糖溶于1.0% (ν/ν)的乙酸溶液，配成浓度为质量体积比 0.05%的溶液，然后在搅拌(转速2000r/min)下，按ΒΜΡ-2与壳聚糖的质量比为0. 1 1 的比例加入BMP-2，混合均勻；(2)称取1. Og透明质酸溶于去离子水，配成浓度为质量体积比0. 05%的溶液，然后在搅拌下，按bFGF与透明质酸的质量比为0. 001 1的比例加入bFGF，混合均勻；(3)称取0. 5g生物型多孔骨修复材料负压(0. IMPa)下浸入步骤(1)制成的溶液中，保持1小时，取出晾干；(4)将步骤(3)处理的多孔骨修复材料负压(0. IMPa)下浸入步骤(2)制成的溶液中，保持1小时，取出晾干，再经钴60辐照灭菌，即制成一种控释型BMP-2/bFGF/生物型骨修复材料(5)将步骤(4)所得控释型BMP-2/bFGF/生物型骨修复材料浸入2ml的0. Olmol/ L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7. 4)中，同时加入0. 02%叠氮钠(w/v)防腐，然后放置于37°C恒温箱中并持续搅拌释放，同时设置对照组(制备过程为生物型多孔骨修复材料在0. IMPa负压下浸入含有质量体积比0. 0001% bFGF和0. 01 % BMP-2混合的0. 1 %尿素溶液，保持1小时，取出晾干，钴60辐照灭菌即得bFGF+BMP-2溶液直接复合材料)从0天 30天平均每 1 !取上清一次，每次30 μ 1，人bFGF ELISA试剂盒和人BMP-2 ELISA试剂盒分别检测各上清液中的bFGF和BMP-2的含量(对照组每池取上清一次)，汇总后绘制此控释型BMP-2/ bFGF/生物型骨修复材料中bFGF和BMP-2的体外序贯释放曲线，如图4所示体外药物序贯释放曲线显示，此控释型BMP-2/bFGF/生物型骨修复材料中复合的第一层bFGF至少能在 6天的时间内实现持续释放，前3天的释放量达到总药量的58%，然后持续至6天时，释药量达到97 %，在第8天时药物释放完全而复合的第二层BMP-2在前8天时仅有少量释放，约为20%，从第9天开始，BMP-2进入快速释放期，并且在25天内实现持续释放，在第22天时释放量达到总药量的95%，在第25天时药物释放完全对照组为bFGF+BMP-2溶液直接复合材料组，bFGF和BMP-2分别在4h和他时药物即完全释放说明此控释型BMP-2/bFGF/ 生物型骨修复材料实现了所负载的生长因子bFGF和BMP-2的体外序贯持续释放实施例4 体内、体外骨诱导形成试验(1)体外细胞试验分别检测生物型多孔骨修复材料、实施例2制备的控释型 BMP-2/bFGF/TCP骨修复材料、实施例3制备的控释型BMP-2/bFGF/生物型骨修复材料诱导小鼠成肌细胞C2C12细胞(ATCC)矿化小节含量评价其诱导骨分化能力将状态良好的 C2C12细胞用0. 25% w/v胰酶-0. 2% w/v EDTA进行消化分散，计数后，IX IO4个/cm2接种于M孔板中，每孔加入500ul含10%胎牛血清(FBS)的DMEM，37°C、5% CO2、饱和湿度的 CO2培养箱培养各孔细胞分为三组，分别为生物型多孔骨修复材料组、控释型BMP-2/bFGF/ TCP骨修复材料组、控释型BMP-2/bFGF/生物型骨修复材料组，均与IOmM β -甘油磷酸钠共同诱导培养诱导4周后，细胞用O.Olmol/L的PBS缓冲液(pH7. 4)洗2次，体积百分比 70%乙醇水溶液于-20°C固定60min，晾干10mg/ml茜素红，作用15min双蒸水洗3 4 次后0. 01mol/L的PBS缓冲液孵育20min，风干，镜下观察结果证明与对照组相比，含双层BMP-2和bFGF的控释型BMP-2/bFGF/生物型骨修复材料诱导后C2C12细胞矿化小节含量(成骨分化最终标志)显著高于对照组，如图5所示(2)小鼠后肢肌袋异位骨形成试验分别检测控释型BMP-2/生物型骨修复材料、控释型BMP-2/bFGF/TCP骨修复材料、控释型BMP-2/bFGF/生物型骨修复材料诱导异位骨形成的能力(以生物型多孔骨修复材料为阴性对照组)选取18 22g清洁级昆明小鼠(中山大学动物试验中心提供，《实验动物生产许可证号SCXK(粤)2004-0011》和《实验动物使用许可证号=SYXK(粤)2007-0081》)，麻醉后，按照前述分为四组，分别将各组骨修复材料植入到小鼠的后腿肌肉内，进行埋植实验，诱导2周后，处死小鼠，取出埋植物，0. 6M HCl 浸泡，抽取上清进行钙含量测定结果显示此三种控释型BMP-2/生物型骨修复材料、控释型BMP-2/bFGF/TCP骨修复材料、控释型BMP-2/bFGF/生物型骨修复材料均可明显促进植入部位异位骨的形成，其中控释型BMP-2/bFGF/生物型骨修复材料促进异位骨形成的能力最强，钙含量测定较对照组明显增高，如图6所示上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内

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专利名称：一种骨生长因子控释型骨修复材料及其制备方法与应用的制作方法由于各种创伤与疾病造成的骨损伤与骨缺损等硬组织疾病是世界性多发病和常见病，骨移植修复对于提供支持、填充骨腔、加速骨缺损愈合是一种必要的治疗方式，是临床上仅次于输血的、应用最多的移植技术。当前世界上临床用于骨修复的治疗方法有自体骨移植、同种异体骨移植、人工骨替代物等。自体骨移植存在供区损伤、植骨量不足、不能制备特殊形状等限制，同种异体骨易致排斥反应，因此人工骨修复材料已成为国际上用于临床骨缺损修复的主要材料。目前研究和已临床应用的人工骨修复材料的种类繁多，按其基质材料的性质可分为有机高分子材料、无机材料和复合材料。其中多孔无机材料，包括合成的磷酸三钙 (a-TCP及β-TCP)、磷酸四钙(TeCp)和它们的混合物等磷酸钙陶瓷、羟基磷灰石(Hap)以及生物活性玻璃；天然的珊瑚基和贝壳基材料，及天然骨改性材料等，其成分与骨矿物组成类似，生物相容性和力学性能较好，对人体安全、无毒，因此已广泛用于骨缺损修复，已有报道如下①孙文晓、张海港、韦卓等，骨修复材料的研究应用现状与展望，生物骨科材料与临床研究，2009，6(3) 35-40 ；②骨修复用多孔材料，中国发明专利ZL03113339. 8 ；③生物型骨修复材料，中国发明专利申请号200710031438. 6。但上述材料由于缺乏骨诱导生物活性物质，其骨缺损修复效果与自体骨移植相比仍然有显著差距。骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、成纤维细胞生长因子_2(bFGF)、转化生长因子-β (TGF-β)、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、血小板衍化生长因子(PDGF)等骨生长因子对骨组织的修复和再生具有重要的调节、促进作用。但由于骨生长因子在水相及室温环境下易于失去生物活性，在体内还存在酶解作用，因此其在体内直接使用会很快失活，达不到所期望的生物效应。构建在体环境下能保持并尽可能延长生长因子生物活性的生长因子释放系统已成为骨生长因子在临床上成功应用的关键。目前以纳米微粒、脂质体、生物陶瓷和聚合物为载体的骨生长因子缓释体系的应用报道已有很多，如①一种制备骨修复材料的方法，中国发明专利ZL01117^2. 4 ；②可分布降解含有促生长因子的生物活性植入材料，中国发明专利ZL200510021909.6;③一种骨生长因子注射剂及其制备方法，中国发明专利申请号03109785. 5。但仍然存在骨生长因子长期缓释效果不佳，以及仅能以单一模式释放骨生长因子，难以提供生理环境下骨组织再生所需求的多种生长因子协同作用的条件。
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种骨生长因子控释型骨修复材料。本发明的另一目的在于提供所述骨生长因子控释型骨修复材料的制备方法。本发明的再一目的在于提供所述生长因子控释型骨修复材料的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种骨生长因子控释型骨修复材料，是多孔骨修复无机材料的孔表面包裹两层膜，从内至外，第一层膜的主要成分为骨生长因子和壳聚糖按质量比(0.05 0.1) 1混合得到；第二层膜的主要成分为骨生长因子和生物降解性聚阴离子按质量比(0 0.001) 1混合得到；所述的多孔骨修复无机材料优选为钙磷生物陶瓷多孔骨修复材料、贝壳基多孔骨修复材料、珊瑚基多孔骨修复材料、生物活性玻璃多孔骨修复材料或生物型多孔骨修复材料；所述的壳聚糖优选为脱乙酰度为70% 100%、分子量为8000 150万的壳聚糖；所说的骨生长因子优选为骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、成纤维细胞生长因子-2(bFGF)、转化生长因子- β (TGF-β)、胰岛素样生长因子-1 (IGF-I)、血小板衍化生长因子(PDGF)及它们相应活性肽中的一种或至少两种；所述的骨生长因子控释型骨修复材料的制备方法，包含以下步骤(1)将壳聚糖溶于0. 5 3% (ν/ν)的乙酸水溶液，得到壳聚糖溶液；然后在搅拌条件下，按骨生长因子与壳聚糖的质量比为(0.05 0.1) 1的比例加入骨生长因子，混合均勻；(2)将生物降解性聚阴离子溶于去离子水，得到生物降解性聚阴离子溶液；然后在搅拌下，按骨生长因子与生物降解性聚阴离子的质量比为(0 0.001) 1的比例加入骨生长因子，混合均勻；(3)将多孔骨修复无机材料负压下浸入步骤(1)制成的最终溶液中，保持0. 5 2 小时，取出晾干；(4)将步骤(3)处理的多孔骨修复材料负压下浸入步骤(2)制成的最终溶液中，保持0. 5 2小时，取出晾干，灭菌，即制成一种骨生长因子控释型骨修复材料；步骤(1)中所述的壳聚糖溶液的浓度优选为质量体积比0.01% 3%，更优选为质量体积比；步骤(1)中所述的搅拌的速度优选为800 3000r/min ；步骤O)中所述的生物降解性聚阴离子溶液的浓度优选为质量体积比0. 01% 3 %，更优选为质量体积比0. 05 % 0. 1 % ；步骤(3)中所述的负压的条件优选为0. 01 0. IMpa ；步骤中所述的负压的条件优选为0. 01 0. IMpa ；步骤中所述的灭菌优选通过环氧乙烷或钴60辐照进行灭菌；一种骨生长因子控释型骨修复材料，通过上述制备方法得到；所述的骨生长因子控释型骨修复材料应用于医学临床领域，用于制备人工骨修复材料。本发明基于静电作用原理，采用绿色环保的简单工艺制备了用于骨组织缺损修复的骨生长因子控释型骨修复材料。该骨生长因子控释型骨修复材料不仅具有良好的生物相容性和力学性能，而且可以保持骨生长因子的生物活性，并实现多种骨生长因子的持续缓慢联合释放或序贯释放，更好地满足骨缺损修复的要求。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(1)本发明所述骨生长因子控释型骨修复材料的制备方法绿色环保、简单易行，不涉及有机溶剂，不会破坏骨生长因子的生物活性。(2)本发明中，多孔无机材料提供骨修复材料必要的力学性能，而生物降解性复合膜均勻负载生长因子，并通过选择聚阴离子材料种类、骨生长因子类型和复合方式、及工艺条件控制等，可实现多种骨生长因子的持续缓慢联合释放或序贯释放，更好地发挥骨诱导作用，促进骨组织再生和功能重建，满足临床上骨缺损修复的要求。图1是控释型BMP-2/生物型骨修复材料的SEM照片图。图2是含BMP-2的控释型BMP-2/生物型骨修复材料的BMP-2释放曲线图。图3是含BMP-2和bFGF控释型BMP-2/bFGF/TCP骨修复材料的BMP-2和bFGF共释放曲线图。图4是含BMP-2和bFGF控释型BMP-2/bFGF/生物型骨修复材料的bFGF和BMP-2 序贯释放曲线图。图5是茜素红染色检测控释型BMP-2/bFGF/生物型骨修复材料诱导后C2C12细胞矿化小节含量(成骨分化最终标志)图；其中，A图是阴性对照组，B图控释型BMP-2/bFGF/ TCP骨修复材料诱导组，C图是控释型BMP-2/bFGF/生物型骨修复材料诱导组。图6是小鼠肌袋植入试验-钙含量测定结果图。

本发明公开一种骨生长因子控释型骨修复材料及其制备方法与应用。该骨修复材料是多孔骨修复无机材料的孔表面包裹两层膜，从内至外，第一层膜主要成分为骨生长因子和壳聚糖；第二层膜主要由骨生长因子和生物降解性聚阴离子按质量比(0～0.001)∶1混合得到。本发明的制备方法如下将多孔骨修复无机材料浸入骨生长因子/壳聚糖溶液中，晾干，再将其浸入骨生长因子/生物降解性聚阴离子水溶液中，晾干，得到骨生长因子控释型骨修复材料。本发明制备方法简单，得到的骨修复材料具有良好的力学性能和生物相容性，并实现多种骨生长因子的持续缓慢联合释放或序贯释放，提高了骨缺损组织的修复效果，在骨修复中有良好的临床应用前景。

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