专利名称：一种乳酸片球菌ccfm7902及其用途的制作方法一种乳酸片球菌CCFM7902及其用途单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)在分类上属李斯特菌属，该属有8个菌种，普遍认为仅有单核细胞增生李斯特菌能引起食物中毒。该菌为革兰氏阳性小杆菌，需氧或兼性厌氧，生长温度3-45°C，具有嗜冷性，能在低至4°C的温度下生存和繁殖。 李斯特菌在自然界中广泛存在，土壤、水、食品都是其生境，孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷个体均属是易感人群。食源性单核细胞增生李斯特菌可引起脑膜炎、败血症和流产，发病率虽不高，但死亡率有时可达20% -50%。食品中存在的李斯特菌对人类的安全具有较大威胁，也是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。益生菌是一种通过改善平衡宿主的肠道内菌群，拮抗肠道内病原菌，从而对宿主起到有益作用的活性微生物。拮抗作用具有菌株特异性，并非所有的益生菌都对同一种病原菌起作用。益生菌中有很多属于乳酸菌，乳酸菌代谢可以产生有机酸、双乙酰、过氧化氢和细菌素等多种代谢产物，可以抑制食品中的腐败菌和病原菌。刘洁等(上海交通大学学报(农业科学版)，M(3) =221-225,2006)研究发现，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在体外对单核细胞增生李斯特菌生长具有明显的抑制作用，其发酵液对单核细胞增生李斯特菌的抑制作用受PH影响显著；周伟、李平兰等(食品科学，27 (2) :121-125,2006)研究了植物乳杆菌素L-I对单核细胞增生李斯特菌的抑制作用，并探讨了温度、pH及盐对抑制效果的影响。单核细胞增生李斯特菌对细胞的粘附是其侵染的前提，乳酸菌可以通过占位作用排除致病菌，或者它分泌代谢产物以抑制致病菌。除此之外，乳酸菌还能够增强机体免疫反应， 从而达到清除致病菌的作用。Sinea 等人(FEMS immunology and medical microbiology> 50 (380-388)，2006)应用细胞模型发现，其所用的乳酸杆菌是通过代谢产物而非粘附作用对单核细胞增生李斯特菌产生抑制拮抗作用并刺激细胞的自身免疫。由此可见，乳酸菌及其代谢产物可能对单核细胞增生李斯特菌的污染具有一定的预防或干预作用，有作为抗生素的辅助治疗剂的潜能，筛选具有优良拮抗特性的乳酸菌对于抑制单增李斯特菌的污染很有必要。本发明经过体外筛选、细胞模型和应用研究发现，从泡菜中分离出的一株乳酸片球菌CCFM7902对单核细胞增生李斯特菌具有明显的抑制作用。目前公开的关于乳酸片球菌及其抑菌物质的文献很有限，其中关于乳酸片球菌素的报道较多，如CNlO 1050437和CN102115720A分别公开了生产片球菌素的方法； CN102127578A公开了一种积累片球菌素的方法，可以增加片球菌素的生产量。也有少数专利是关于乳酸片球菌作为发酵剂的作用，如CN101289647公开的一株片球菌能够在发酵香肠中作为发酵剂的应用，改善发酵香肠的风味。本发明在体外拮抗的基础上，通过细胞模型发现乳酸片球菌对单核细胞增生李斯特菌感染肠上皮细胞株HT-四细胞具有保护作用，动物模型中乳酸片球菌对单核细胞增生李斯特菌感染小鼠的肝脾具有保护作用。此乳酸片球菌具有潜在的应用价值。可应用于食品体系中，为控制单核增生李斯特菌提供了一种基于生物拮抗的控制方法，对于减少动物疾病发生，提高相关产品的安全性具有重要意义。因此，本发明人在总结现有技术的基础上，通过大量试验研究，终于完成了本发明。
首先，将青贮饲料原料揉切至1 4cm后待用；然后，将0. 5重量份采用上述方法制备的工作发酵剂溶入到200-250重量份温度 300C -40°C的水中，搅拌溶解得到一种工作发酵剂悬液；接着，把该工作发酵剂悬液喷洒到2000重量份的青贮饲料原料中，翻拌均勻，将青贮饲料原料的水含量控制在以重量计65%-75%;当饲料原料的水含量超过其范围时，让饲料原料在日光下晾晒，使其含水量达到其范围；当饲料原料的水含量低于其范围时，往其饲料原料中喷洒水，使其含水量达到其范围；最后，把如此处理的青贮饲料原料装入青贮饲料桶中压实，然后密封，在常温下发酵3-4周后，得到含有乳酸片球菌CCFM7902的植物秸秆饲料。在本发明中，所述的青贮饲料原料是一种或多种选自稻草、玉米秸秆、高粱秸秆、 小麦秸秆、天然牧草、栽培牧草、田间杂草、菜叶类、水生植物或嫩枝树叶的青贮饲料。在本发明中，所述的发酵香肠是按照下述步骤制备的首先，将选自猪肉、牛肉、羊肉或鸡肉的肉切碎，在温度_6°C _8°C的冷藏室中进行预冻Mh ；然后，让预冻肉与食盐、白砂糖、亚硝酸钠、复合磷酸盐按照重量比 100 3 1.5 0.015 0.3充分混合得到一种混合物，所述的复合磷酸盐是由多聚磷酸钠、焦磷酸钠和磷酸氢二钠按照重量比2 1 1复配而成的，接着，将所述的混合物置于温度0 4°C下腌制Mh，加入按照肉重量计5-10%香辛料，搅拌混合，然后加入采用所述方法制备的工作发酵剂，其加入量是以肉重量计0. 5 1 %，接着把含有工作发酵剂的肉灌注到肠衣中，得到一种灌肠；最后，所述的灌肠在温度14°C 18°C与相对湿度85%的条件下发酵20天；发酵结束后在温度66-70°C下进行烘烤，冷却后得到所述的发酵香肠。在本发明中，所述的香辛料是一种或多种选自辣椒、花椒、胡椒、姜、蒜、八角、茴香、桂皮、橘皮或丁香的香辛料。下面将更详细地描述本发明。本发明涉及一种乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) CCFM7902，该菌菌株已于2011年11月四日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. M93。所述的乳酸片球菌CCFM7902是采用下述筛选方法获得的，并且对其性质进行了研究。一、筛选筛选方法的具体实施步骤如下1、样品采集用无菌三角瓶采集自然发酵的发酵泡菜，原始样品取自无锡板桥村等地农民自制的发酵泡菜。采集的样品保存在温度0°c的条件下，在48h内进行样品分析和乳酸菌的分1 O2、从样品中分离乳酸菌IOg自然发酵泡菜样品置于带玻璃珠的90ml 0. 无菌蛋白胨水中，振荡30min， 然后使用0.1%无菌蛋白胨水按照体积比1 10进行连续稀释。使用本技术领域的技术人员熟知的涂布平板法，将各个稀释梯度的菌液0. Iml分别涂布在以下三种培养基平板上添加溴甲酚紫指示剂的MRS培养基(青岛海博生物技术有限公司产品，用于乳杆菌培养的培养基)，TPY固体培养基(青岛海博生物技术有限公司销售产品，用于双歧杆菌增菌培养)，M17琼脂培养基(BD Difco公司以商品名BactO M17 Agar销售的培养基)，并分别在厌氧与温度37°C的培养条件下培养48h。从长有30-300个菌落的平板上分离单个菌落， 用接种环随机挑取其中的5-10个菌落在普通肉汤培养基(青岛海博生物技术有限公司销售产品)中在厌氧与温度37°C的培养条件下进行培养Mh，然后在琼脂板上划线。分离物连续划线三次得到纯的单菌落，然后进行本技术领域的技术人员熟知的革兰氏染色与接触酶试验。方法为用接种环在平板上刮一环新鲜培养的菌苔，均勻涂抹在载玻片上，向上滴加一滴3% H2O2溶液，观察是否有气泡产生。若无气泡产生则表明该菌株不产过氧化氢酶， 为接触酶实验阴性菌。将纯化后的菌株接入MRS液体培养基中，在厌氧与温度37°C的培养条件下进行培养Mh，然后按照以培养基重量计2-4%接种量接种于MRS液体培养基中，在厌氧与温度37°C的培养条件下进行发酵培养18-24h进行活化，连续传代3次，得到活性良好的乳酸菌。其纯化菌株可在MRS斜面上在温度4°C下短期保存，而长期保存需要在30% 灭菌甘油溶液中在温度_80°C的条件下冻存。利用加溴甲酚紫的MRS琼脂培养基、TPY培养基和M17琼脂培养基上共分离出244 个分离株。经过菌落形态、革兰氏染色、接触酶试验排除了 3个革兰氏阴性，2个接触酶阳性和4个酵母。这样，分离得到了 235株乳酸菌。3、筛选体外具有拮抗单核细胞增生李斯特菌的乳酸菌将上述分离乳酸菌株按照以培养基重量计2-4%接种量接种于MRS液体培养基中，在厌氧与温度37°C的培养条件下进行发酵培养1814h，得到乳酸菌发酵液。然后，将灭菌的单核细胞增生李斯特菌选择性培养基(青岛海博生物技术有限公司销售，用于单核细胞增生李斯特菌生长的选择性培养)倾注到平板中(每平板15mL，平板为90mm标准平板)，单核细胞增生李斯特菌(L. monocytogenes) ATCC19114作为指示菌株 (菌株购买自美国典型培养物保藏中心ATCC)，每板放入4个牛津杯(直径IOmm)，牛津杯内加入上述乳酸菌发酵液200 μ L，置于温度4°C下扩散6h，然后放入培养箱内在温度37°C下培养Mh，接着测量抑菌圈大小。以MRS液体培养基作为阴性对照，乳酸片球菌PAl (菌株来源江南大学食品生物技术中心)作为阳性对照，试验重复3次。筛选出具有比阳性对照更大抑菌圈的乳酸菌CCFM7902。这些试验结果列于表1。表1CCFM7902对单核细胞增生李斯特菌的抑制作用菌林抑菌圏(mm)CCFM790225.18±0.25PAl23.32±0.13空白MRS液体培养基0由表1列出的结果可以看出，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CCFM7902 是对单核细胞增生李斯特菌生长具有明显抑制作用的乳酸菌。4、CCFM7902 菌株的 16s rDNA 序列鉴定将乳酸片球菌CCFM7902按照以培养基重量计2-4%接种量接种于MRS液体培养基中，在温度37°C下培养18-24h，取ImL新鲜菌液用细菌基因组DNA提取试剂盒(上海生物工程技术服务有限公司销售，商品名为EZ-IO Spin Column Genomic DNA Isolation Kit) 对基因组进行提取。然后以基因组DNA作为模板，采用文献(Critical Evaluation of Two Primers Commonly Used for Amplification of Bacterial 16S rRNA Genes. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74 (8) :2461-2470)公布的细菌鉴定通用引物 27F 和 1492R为引物，50 μ L反应体系进行PCR扩增。目的基因PCR扩增产物测序工作由上海生物工程技术服务有限公司完成。将乳酸片球菌CCFM7902的16S rDNA测序结果与NCBI核酸数据库进行比对，最终结果表明本发明的 CCFM7902 与Pediococcus acidilactici7_4 contl. 26 及Pediococcus acidilactici DSM 20284contig00019同源性均高达99%，因此，将本发明的CCFM7902菌株鉴定为乳酸片球菌，命名为Pediococcus acidilactici CCFM7902，于2011年11月四日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. M93。二、乳酸片球菌CCFM7902的微生物学性质1、乳酸片球菌CCFM7902耐酸性能的测定配制人工胃液取0. IN盐酸16. 4ml加水摇勻，然后稀释至1000ml，再用浓盐酸或 10% NaOH将其PH调至3.0，再在温度121°C下灭菌30min，然后按照lg/100ml比例加入商品胃蛋白酶制剂(上海雅培生物技术有限公司)，混勻得到所述的人工胃液。乳酸片球菌CCFM7902耐酸性能测定将保存的乳酸片球菌CCFM7902按照以MRS 培养基重量计2-4%接种量接种于MRS培养基中，在温度37°C下培养Mh，以相同方式使用 MRS培养液传代培养2 3次，然后取活化菌悬液40ml加入到50ml离心管中，在6000r/min 条件下离心5min，收集其菌体，然后用PBS缓冲液(pH = 7. 2)洗涤2次，接着向离心管中加入40ml上述制备的人工胃液，在温度37°C的水浴中处理3h，每隔30min摇勻1次，分别在处理0h、l. 5h,3h后采用标准平板菌落计数法进行活菌计数。乳酸片球菌CCFM7902耐酸特性测定结果列于表2。2、乳酸片球菌CCFM7902耐胆盐性能的的测定配制人工肠液取KH2PO4 6. 8g加蒸馏水500ml溶解，用以重量计0. 4% NaOH溶液将其PH调节至6. 8，然后加水至IOOOml，按照每IOOml溶液中加0. 3g猪胆盐(常规商业产品)的比例添加猪胆盐，充分溶解后于温度115°C下灭菌15min，得到所述的人工肠液。采用与前面所述的同样方法收集菌体。收集的菌体用PBS缓冲液(pH = 7. 2)洗涤2次，接着向离心管中加入40ml上述制备的人工肠液，在温度37°C的水浴中处理3h，每隔30min摇勻一次，分别在处理0h、l. 5h,3h后采用标准平板菌落计数法进行活菌计数。乳酸片球菌CCFM7902耐胆盐性能的测定结果列于表3。按照与乳酸片球菌CCFM7902耐酸、耐胆盐性能测定方法相同的方式使用戊糖片球菌CCFM0956进行了对照试验，其试验结果也列于表2和表3。表2 乳酸片球菌CCFM7902的耐酸特性测定结果


本发明涉及一种具有抑制单核细胞增生李斯特菌生长的乳酸片球菌CCFM7902及其用途。它具有耐酸性、耐胆盐能力、在体外对单核细胞增生李斯特菌生长具有强烈抑制作用、在食品体系中对单核细胞增生李斯特菌的生长具有抑制作用、对单核细胞增生李斯特菌感染肠上皮细胞株HT-29细胞具有保护作用、对单核细胞增生李斯特菌感染小鼠肝脾具有保护作用。所述乳酸片球菌CCFM7902可以用于制备生产青贮饲料、发酵香肠等食品。