专利名称：一种植物乳杆菌ccfm8724及其用途的制作方法一种植物乳杆菌CCFM8724及其用途空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)是弯曲杆菌属成员之一，属革兰氏阴性菌，是全球范围内感染性腹泻常见的病原菌，世界卫生组织(WHO)在1980年将空肠弯曲杆菌病列为常见的食源性疾病。C. jejuni是一种人兽共同感染的病原菌，广泛存在于环境中， C. jejuni能定植在各种野生禽类和家禽、家畜的肠道内，如鸡、鸭、鹅等家禽，猫、狗等宠物， 牛、猪等家畜，鸽子、麻雀等鸟类以及野生动物等为常见的动物宿主。人类通过与这些动物的接触而可能受到感染，此外，生的、欠火候的或受污染的鸡肉、牛肉，未彻底杀菌的牛奶以及污染的水都可以引起人类感染空肠弯曲杆菌。20世纪90年代以来，C. jejuni感染率呈逐年上升的趋势。在欧美等发达国家， C. jejuni是造成腹泻的主要病原体，有时甚至超过沙门氏菌和志贺氏菌而居首位。最近数十年，在发达国家中空肠弯曲杆菌病的发病数逐年增长，仅在美国每年的发病例数就高达 250万人次，我国和其它发展中国家的患者多集中在儿童。急性自限性胃肠炎是C. jejuni 感染的典型症状，免疫力极低下者还会进一步导致心内膜炎、关节炎、骨髓炎、脑炎、败血症等全身性疾病，最严重的并发症是某些血清型C. jejuni感染引起的周围神经自身免疫性疾病-格林-巴利综合症(Guillain-Barre syndrome, GBS)。C. jejuni的致病机理是复杂的，主要是通过粘附、定植、侵入、产毒素等机制感染机体而导致疾病。鞭毛、外膜蛋白、脂多糖或脂寡糖、荚膜多糖等在C. jejuni附着和定植于宿主肠道上皮细胞的过程中起重要作用。所有C. jejuni都能产生细胞致死性膨胀毒素 (Cytolethal distending toxin，CDT)，CDT有多方面致病性，能直接破坏宿主细胞DNA ；能通过阻止细胞分裂关键调节因子CDC2蛋白的去磷酸化等作用，使宿主细胞周期不可逆地阻断在G2期而不再进入M期，细胞不能增殖分化，致宿主肠道细胞失去调节形态和容量的能力，使细胞进行性扩张，最终破裂死亡；能激发宿主产生细胞因子IL-8，导致局部炎症的发生。C. jejuni的广泛分布、较高发病率以及相关疾病的危害已经引起了人们的广泛关注。近年来抗菌药物的使用已经使细菌耐药性日趋严重，反而推动了这类食源性病原菌的流行。加强对C. jejuni的预防是控制弯曲杆菌病的重要手段之一，而且在公共卫生、食品安全、畜牧兽医中都有重要的意义。益生菌被定义为活的微生物，适量摄入益生菌对人体具有有益的功效，通过益生菌来预防和治疗肠道细菌性感染已经成为相关领域研究的一个重要课题。乳酸菌具有抑制各种革兰氏阳性和阴性病原菌的功能，其抑制机制可能是由于产生有机酸，如乳酸和乙酸、 过氧化氢、细菌素及类似细菌素的物质，还包括竞争排斥作用、促进肠道微生态平衡以及增强宿主的防御能力。此外，某些益生菌能在胃肠道环境中存活并定植于肠道，这些微生物治疗可以作为治疗肠道菌群失调的一种方法。目前国内外对乳酸菌干预病原菌感染进行了很多研究。CN1796540公开了一种具有抗肠道致病菌和抗氧化特性的双歧杆菌；CN1982437公开了一种抗肠道致病菌和抗氧化能力的鼠李糖乳杆菌，用于制备抑制幽门螺杆菌、大肠杆菌或其他致病菌的食品或药品。但鲜有针对空肠弯曲杆菌的乳酸菌和益生菌的报道。目前针对空肠弯曲杆菌的专利中多集中于空肠弯曲杆菌的培养、检测等方面，例如CN1011825688公开一种空肠弯曲杆菌的检测方法；CN1013922^涉及空肠弯曲杆菌的微需氧分离培养方法。因此，筛选出一种具有抑制空肠弯曲杆菌功能的乳酸菌，并且证明在体外具有良好的抗空肠弯曲杆菌的效果，同时研制这些乳酸菌的实际用途就显得十分必要。为此，本发明人在总结现有技术的基础上，经过大量实验研究，终于完成了本发明。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵剂是采用下述方法制备得到的制备具有下述组成的培养基以该培养基总重量计10%酶水解脱脂乳、0. 5%葡萄糖、1. 5%胰蛋白胨、0. 3%酵母浸膏和余量水，所制备培养基的pH是6. 8。制备具有下述组成的保护剂100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、 150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸钠和余量水。植物乳杆菌CCFM87M菌种按照以所述培养基的重量计2_4%接种量接种到在温度110-120°C下灭菌8-12min的所述的培养基中，然后在温度37°C下培养18h，用pH 7. 2磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用所述的保护剂重悬使植物乳杆菌CCFM87M浓度达到109CFU/ml ； 接着，让该悬浮液在温度37°C下预培养60min，再采用冷冻干燥方法制成所述的发酵剂。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵剂含有109CFU/g以上活性植物乳杆菌 CCFM87M。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵乳制品是酸牛奶、酸奶油或干酪； 所述的发酵豆制品是酸豆乳、豆豉、豆酱或酱油；所述的发酵果蔬制品是发酵的黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品。下面将更详细地描述本发明。本发明涉及一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CCFM8724，该菌株已于 2011年11月四日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. M92。下面将详细地描述所述植物乳杆菌CCFM8724的筛选方法与它具有的性质。首先，从传统发酵食品中筛选乳酸菌。原始样品取自于内蒙、新疆等地牧民自制的发酵奶酒。将5ml发酵奶酒注入带玻璃珠的45ml灭菌生理盐水中，振荡30min，然后用灭菌生理盐水将其奶酒稀释至不同的浓度。采用本技术领域的技术人员熟知的涂布平板法，将这些稀释菌液涂布在添加了酸碱指示剂溴甲酚紫的MRS培养基(青岛海博生物技术有限公司产品)平板上，分别在温度37°C 下进行普通培养和厌氧培养48h，观察菌落生长情况，挑取能使培养基中溴甲酚紫变黄的典型单菌落，并对单菌落进行革兰氏染色，挑取革兰氏阳性菌作为初步目的菌株，然后转接至 MRS平板划线分离纯化，直至得到纯乳酸菌株，作为实验菌株并在温度4°C下保存。用接种环在平板上刮一环新鲜培养的菌苔，均勻涂抹在载玻片上，往其上滴加一滴3% H2O2溶液， 观察是否有气泡产生。若无气泡产生则表明该菌株不产过氧化氢酶，为接触酶阴性菌。然后，采用牛津杯法筛选具有抑制空肠弯曲杆菌生长功能的乳酸菌。将上述步骤获得的纯乳酸菌按照以MRS液体培养基体积计2%接种于MRS液体培养基中，于温度37°C下培养18-20h，按照同样的方式连续培养三代，然后将乳酸菌菌悬液在8000r/min与温度4°C的条件下离心20min，吸取上清液，使用0. 22 μ m滤膜进行过滤去除菌体，得到一种乳酸菌发酵上清液。空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)NCTCl 1168菌株(购自美国典型培养物保藏中心ATCC)在哥伦比亚血琼脂平板(Oxoid公司培养基)上在温度37°C与以体积计5% 02、10%0)2和85(%队的环境下培养4811，按照同样的方式传代培养三代后，往其平板中加入脑心浸液肉汤培养基(Oxoid公司培养基)，用无菌涂布棒刮下表面的细菌，在5000r/min条件下离心20min，使用磷酸盐缓冲液(PBS，pH = 7. 2)洗涤后，调整该菌浓度至108CFU/mL。然后，吸取250μ 1空肠弯曲杆菌菌液，均勻涂布于CCDA平板培养基(青岛海博生物技术有限公司)上，待菌液自然干后，在平板上放置牛津杯，然后向牛津杯中加入100μ 1 上述的乳酸菌发酵上清液，以PH = 3. 8MRS作为对照，在温度4°C下扩散2小时，再放入培养箱中在温度37°C与以体积计5% 02U0% CO2和85% N2的环境下培养48h，接着采用常规方法测量抑菌圈的直径，从中筛选得到一株能有效抑制空肠弯曲杆菌生长的乳酸菌，即乳酸菌CCFM8724，其测量结果列于下表1中。表1 抑菌圈直径的测量结果本发明涉及一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM8724及其用途。该植物乳杆菌CCFM8724具有体外抑制空肠弯曲杆菌生长的能力，耐酸性与耐胆盐性能良好，对肠道上皮细胞具有良好的粘附能力，能抑制空肠弯曲杆菌粘附于肠道上皮细胞，抑制空肠弯曲杆菌在鸡肉中生长。所述植物乳杆菌CCFM8724可以用于制备抑制空肠弯曲杆菌的药物组合物，可以使用含有植物乳杆菌CCFM8724菌种的发酵剂生产发酵乳制品、发酵豆制品、发酵果蔬制品以及青贮饲料，该发酵剂赋予这些产品具有一定的酸度和特定的香味，同时延长了产品保藏时间，改善了营养价值和消化性以及产品的安全性。