专利名称：改造的mvip3Aa11基因及其应用的制作方法虫害是造成农业生产损失的重要因素之一。据统计，虫害每年给农业生产造成的直接经济损失高达15%。化学杀虫剂曾对虫害防治、稳定农业生产做出过重要贡献。随着人们对化学杀虫剂环境危害的认识、环保意识的日益加强，为了实现农业可持续发展，全球都在积极探索新的害虫防治途径。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种广泛分布于土壤中的革兰氏阳性细菌，它在芽胞形成期产生的杀虫晶体蛋白ansecticidal Crystal Proteins, I CPs)是Bt杀虫的主要活性成分，ICPs通过作用于昆虫中肠而导致昆虫死亡(Hofte H. Microbiology Review,1989, 53 :242-255 ；Agaisse H. Journal of Bacteriol. ,1995, 177，6027-6032)。由于 ICPs 对鳞翅目(I^pidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、双翅目 (Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)等多种重要的农林业害虫均具有毒杀作用，目前Bt已经成为研究最为深入、应用最广的杀虫微生物(Schn印f N. Microbiol and Molecular Biology，1998，62 (3) :775 806)。而转Bt杀虫晶体蛋白基因抗虫植物成功商业化已经有 12年，获得了巨大的社会、经济和生态效益(Clive James, ISAAA 2008, Briefs 39，Global Status of Commercialized Biotech/GM Crop)。但是，在实际应用中，第一代转基因作物如抗虫棉、抗虫玉米等，由于单一的使用cryl类基因(crylAb，cryIAc)，害虫在田间对cryIA基因的抗性频率和抗性风险随着产业化的面积和时间增加而呈现不断上升的趋势(李国平，中国农业大学博士学位论文， 2006)。因此，寻找与Cryl类(CrylAb，CrylAc)具有不同受体的杀虫蛋白和杀虫蛋白的组合，对克服和延缓害虫抗性产生具有极其重要的理论意义和实用价值。Cry2A类的蛋白是一类杀虫谱较广的杀虫蛋白，对鳞翅目、双翅目具有较好的杀虫活性，李长友等研究发现Cry2Ab4毒素对重要的农业害虫-棉铃虫(Helicoverpa armigera)、大豆食心虫(Leguminivora glycinivorella)具有高毒力，同时对水禾S二化螟(Chilo suppressalis)和小菜蛾(Plutella xylostella)也有很好的防效(李长友等，生物工程学报，2007,23 ) :634-638)。Liang和Dean(1994，引用信息补充完整)通过蛋白与BBMV结合实验表明Cry2A类蛋白与CrylA类蛋白具有不同的结合位点，即这两类蛋白在与害虫的中肠结合上没有竞争，害虫对这两种蛋白不容易产生交互抗性(Liang et al. Molecular Microbiology, 1994,13(4) :569 575)。这一研究结果很快就体现在 Monsanto 公司的第 2 代抗虫棉中(Perlak FJ, Plant Tournal. 2001 ；27 (6) :489-501 Adamczyk JJ, T Econ Entomol. 2001,94(6) :1589-1593)。1996 年和 1998 年 Estruch (Estruch JJ, Proc Natl Acad Sci U S A. 1996， 93(11) :5389 5394)禾口Warren(Warren Gff,World Intellectual Property Organization Patent WO 1998/5,849 870)等人分别从 B. thuringiensis 菌株 AB88 和 B. cereus 菌株 AB78的上清液中发现了在营养期分泌的新型杀虫毒蛋白，即营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Proteins, VIPs) VIPs 主要分为 VIP1、VIP2 和 VIP3 三种。目前，Bt 蛋白命名委员会提出按照Bt Cry毒蛋白的分类命名方法(Crickmore Neil, http //www, lifesci. sussex. ac. uk/home/Neil Crickmore/Bt/vip. html),将所有的 Vip 蛋白和类 Vio 毒素蛋白分为三个种，八个亚种。Vip3A对鳞翅目昆虫，如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、 甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)等具有广泛的杀虫活性(Estruch JJ, Proc Natl Acad Sci U S A. 1996，93 (11) :5389 5394)，对小地老虎 (Agrotis ypsilon)的毒个生比 CrylAc 高 260 倍(Estruch JJ, et al. World Intellectual Property Organization Patent WO 2000/6 :107 279)。Donovan 等人的研究发现表明Vip3A蛋白不但是对甜菜夜蛾杀虫活性的重要组成部分，而且与Cryl类蛋白有协同增效作用，能提高苏云金芽胞杆菌的杀虫效果(Donovan WP, J Invertebr Pathol. 2001, 78(1) :45-51) ο VIPs的杀虫作用机理不同与已知的Cry蛋白(Yu, Appl. and Environ. Microbiol. 1997,63(2) :532 536)。进一步的研究表明，Vip3A与Cryl类蛋白在部分重要的鳞翅目的农业害虫中的受体不同，显示Vip3A具有不同于晶体蛋白的杀虫模式(Lee， Appl. and Environ. Microbiol. 2003,69(8) :4648-4657)。随着抗虫棉等转基因植物的产业化，害虫在田间产生抗性的风险不断增加，2003 年和2005年，Zhao JZ等人分别发表文章指出基因叠加(Gene stacking and pyramided) 策略是克服和延缓害虫对转基因抗虫植物产生抗性的有效手段(Zhao JZ, et al. Nature Biotechnology,2003,21 (12) :1493-1497 ；Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 2005, 102(24) 8426-8430)。随后Monsanto公司研制出CrylAc与Cry2Ab2组合的抗虫棉Bollgard II，Syngenta 公司推出了 Vip3A 与 CrylAb 组合的抗虫棉(Kurtz Rff, J Invertebr Pathol. 2007,95(3) :227-230)。1987年，国际上开始研究构建转Bt杀虫基因植物，Vaeck等(Vaeck et al.， Nature，1987，328 :33-37)、Barton 等(Barton et al. , Plant Physiol, 1987 85: 1103-1109)、Fischoff 等(Fischoff et al.，Bio/Tehnology, 1987,5 :807-813)分别获得了转Bt杀虫基因植物。但这些早期获得的的转Bt基因植株的抗虫性都很弱，难以检测出 mRNA的转录，蛋白质表达量很低。造成Bt基因在植物中表达量低的原因有许多例如，1.野生Bt基因中富含AZ序列，在植物中表达的mRNA不稳定；2.野生Bt基因中可能存在真核基因的内含子切割位点、转录终止信号序列，造成转录本不完整或转录本的异常加工；3、微生物与植物在翻译中对密码子的使用频率上有很大差异，使翻译效率降低；4、真核基因的 5’ -UTR序列与原核基因有很大的不同，以及真核基因的3’端需要加尾识别信号序列。因此，要使得Bt基因在转基因植物中高效表达，必须对野生Bt基因进行有效的改造。1990年Adang等根据双子叶植物基因特点，改造了原始cry基因的CG/AT比例、 密码子使用频率，删除所有认为可能影响Bt基因在植物中表达的AATGAA等序列，合成了一个新Bt杀虫基因新基因与原基因的相似性为85%，C+G含量提高到正常植物基因的水平( 45%)。经过改造后，cry基因在植物中的表达量大幅度提高(Adang et al,EP0359472 1990)。1991年，Perlak等人对cryIAb基因进行的改造和人工合成，也获得了 cry基因在植物中表达量有了较大的提高(Perlak et al.，PNAS USA, 1991,88 =3324-3328)
本发明提供一种vip3Aall和Cry2Ab4的基因组合，其对鳞翅目害虫的杀灭具有增效作用。同时为适应转基因植物的需要，本发明还提供有改造的mvip3Aall和mcry2Ab4基因。改造的mcry2Ab4基因，编码具有SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列的蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。含有改造的mcry2Ab4基因的重组质粒。上述重组质粒为pET_2Ab4。上述重组质粒为pCAMIA_S2AbN。重组质粒在转基因植物或微生物中的应用，使其获得抗虫特性。改造的mvip3Aall基因，编码具有SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。含有改造的mvip3Aall基因的重组质粒。上述重组质粒为pET_vip3Aal 1。重组质粒pET-vip3Aall在转基因微生物中的应用，使其表达抗虫蛋白的特性。一种重组质粒，含有表达Cry2Ab4蛋白的基因和表达Vip3Aall蛋白的基因。所述重组质粒中含有mvip3Aall基因和mcry2Ab4基因。所述重组质粒为pCS2AbVIP3N。Cry2Ab4蛋白与Vip3Aall蛋白组合在抗鳞翅目害虫中的应用。所述应用是将Cry2Ab4蛋白与Vip3Aall蛋白制成杀虫剂杀灭鳞翅目害虫。所述应用是将表达Cry2Ab4蛋白的基因和表达Vip3Aall蛋白的基因转入同一植物或微生物中，使其表现抗鳞翅目害虫的特性。所述表达Vip3Aall蛋白的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO. 5 ；所述表达Cry2Ab4 蛋白的基因的核苷酸序列为SEQ ID N0. 6。所述表达Cry2Ab4蛋白的基因为改造基因mcry2Ab4，所述表达Vip3Aal 1蛋白的基因为改造基因mvip3Aall。所述应用是将改造基因mcry2Ab4转入一植物中，将改造基因mvip3Aall转入另一植物中，两种植物杂交，得到转有改造基因mcry2Ab4和改造基因mvip3Aall的杂交植物。所述应用是将含有改造基因mcry2Ab4和改造基因mvip3Aall的质粒转入同一植物中。所述质粒为pCS2AbVIP3N。我们实验室分别克隆了 vip3Aall基因(高技术通讯，2004，第9期，39_42)和 cry2Ab4基因(生物工程学报，2007，23卷4期，634-638)，发现了两者组合对鳞翅目害虫的增效作用，特别是对棉铃虫抗CrylAc种群等害虫具有良好的防效。分析比对棉花等植物偏爱的密码子，在保持原Vip3Aall和Cry2Ab4杀虫蛋白的氨基酸组成不变的情况下，用棉花等植物基因偏爱的密码子替换vip3Aall和cry2Ab4基因对应的不稳定密码子，通过替换获得优化密码子，完成vip3Aall和cry2Ab4基因DNA序列优化改造得到新的mvip3Aall和mcry2Ab4优化基因。在大肠杆菌中表达新的mvip3Aal 1和mcry2Ab4优化基因，进行Vip3Aal 1和 Cry2Ab4蛋白纯化，对这两种蛋白分别进行单独、以及组合杀虫活性测定，通过计算LC5tl和两种蛋白的协同增效系数，明确优化基因的功能。构建用于转化棉花的植物表达载体，一个植物表达盒包括组成型表达启动子 CaMV35S(来源于花椰菜花叶病毒基因启动子，是一段DNA序列，可以驱动所连接的基因片段进行转录，进而翻译成蛋白质，组成型表达的启动子可以调控基因在生长发育的任何阶段和任何组织都有表达)、改造的cry2Ab4基因、NOS终止子(来源于花椰菜花叶病毒 Nopaline (NOS)基因的终止子，一段DNA序列，含有基因表达的终止信号)，另一个植物表达盒包括组成型表达启动子CaMV35S、改造的vip3Aall基因、NOS终止子。可以将两个表达盒分别构建两个植物表达载体，由获得的单价转化植株通过杂交方法获得转双基因棉花；也可以将两个表达盒置于同一个植物表达载体中，转化棉花，获得双价转基因棉花(本发明实施例采用后一种方法)。取两管200 μ 1农杆菌LBA4404的感受态细胞，分别加入1 μ g质粒DNA，液氮中速冻1分钟，37°C恢复培养5分钟，加入Iml YEB液体培养基，慢速振荡(< IOOrpm) 4小时，1，OOOrpm离心30秒种，弃上清，加入100 μ 1 YEB液体培养基重悬细胞，涂布于含有卡那霉素100μ g/ml和链霉素125μ g/ml的YEB培养基的平板上，28°C培养48小时。将YEB抗性培养基平板上的克隆，摇菌，提取质粒，应用PCR方法检测阳性克隆。将含有mCry2Ab4基因和mvip3Aall基因质粒的农杆菌克隆接种于含有卡那霉素和利福平的YEP液体培养基中，振荡培养至0D_为0. 8-1. 0，1/50接种于MS盐(pH7. 0)中；切取棉花幼苗下胚轴作为转化外植体，将下胚轴浸于农杆菌菌液5-10分钟；取出棉花下胚轴，用灭菌滤纸吸干菌液， 放置到铺有一层滤纸的共培养基中，28°C共培养48h，将转化外植体转移至愈伤诱导培养基上培养大约2周后，将在诱导培养基上产生愈伤组织，待愈伤组织长到直径约2cm时，分别切取下胚轴切断两端产生的愈伤组织，转到分化培养基上进行继代和诱导分化，15-20d继代一次直到成苗为止。选取七叶期转基因棉花的第二、第三、第四片叶子作为生测对象。将脱脂棉球把叶柄包裹，置于放有灭过菌滤纸的平皿中，并滴加dd H20 500 μ 1于棉球上，初孵棉铃虫11头接于每片叶片上；将平皿放于铺有湿纱布的筐中，并将四周盖上湿纱布，置于培养室中；三天后观察结果。实验结果表明，在植物中转入mvip3Aall和mcry2Ab4 基因，使其表达苏云金芽孢杆菌Vip3Aall、Cry2Ab4蛋白，获得对害虫具有高毒力的新型转基因植株。Vip3Aall、Cry2Ab4两种蛋白对害虫的抗虫性比单独表达Vip3Aall或Cry2Ab4 蛋白的杀虫作用强，具有显著的协同增效作用。具有这样的基因组合的植物不仅对普通鳞翅目害虫有良好的毒杀防治效果，更为重要的是它对抗性害虫(抗CrylA毒素的害虫品系) 具有同样强的毒杀作用，与CrylA类蛋白没有交互抗性，能有效防止和毒杀对抗性害虫品系(抗CrylA毒素的害虫品系)，从而能有效克服和延缓害虫抗性的产生。这是第一代转基因抗虫植物所无法比拟的优势。本发明涉及对鳞翅目害虫高毒力的Bt cry2Ab4基因和vip3All基因组合。通过对Bt cry2Ab4基因和vip3Aall基因的人工改造，并将两个基因组合使其更适于在植物中表达，将两个基因构建植物表达载体，转化农作物。双价基因的使用，具有显著的增效作用， 而且同时对CrylA等抗性害虫具有很强毒杀作用，可以极大地提高农作物抗鳞翅目害虫的能力，并且将有效地克服或延缓害虫对转基因植物抗药性的产生。图1重组表达质粒pET_2Ab限制酶切分析其中，M:lkbDNA Ladder (12216，11198，10180，9162，8144，7126，6108，5090， 4072，3054，2036，1636，1018，517，506 bps)，1 :L2Ab5/L2Ab3 amplified product，2: pET-m2Ab/BamHI+/EcoRI，3 :pET_21b/BamHI+EcoRI ；图2 mcry2Ab4在大肠杆菌中表达产物的SDS-PAGE检测其中，M.高分子量标准蛋白(212，116，97，66，40kDa)，l.B-Pr-88(阳性对照)， 2. Cry2Ab4(-pET_m2Ab4)，3. BL21(pET_21b)；图3重组表达质粒pET_Vip3Aall的酶切与PCR扩增鉴定其中，1 X/Ecol30 I marker ；2 :pET_m Vip3A/BamH I and Sal I ；3 :PCR product of vip3A gene ；图4 mvip3Aall在大肠杆菌中表达产物的SDS-PAGE检测其中，1:蛋白Marker (212,116,97,66,40kDa), 2 :Vip3Aall (pET-mvip3Aall) 3 CK(BL21)图5 Vip3Aal 1蛋白的亲和层析纯化结果其中，1蛋白 Marker (212,116，97，66，40kDa)，2 纯化后 Vip3Aall (pET-mvip3Aall)蛋白，3 纯化前 Vip3Aall (pET_mvip3Aall) 蛋白图6双价基因表达载体pCS2AbVIP3N质粒构建7转双价基因棉花对棉铃虫的抗虫性检测结果其中，左图为转基因棉花叶片；右图为非转基因棉花叶片

(6)确定mcry2Ab4基因如序列表SEQ ID NO 3所示的编码序列。(7)化学合成如序列表SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3所示的序列。A.分析vip3Aal 1和cry2Ab4基因的原始核苷酸编码序列，从中可以发现， vip3AalU cry2Ab4基因与植物基因在密码子的使用上有较大差异，主要表现在vip3Aall 或cry2Ab4基因对第三位摇摆碱基为A或T的密码子有偏爱性，而植物基因密码子的第三位摇摆碱基偏爱使用G或C。依据分析结果，采用植物基因的偏爱性密码子置换原始vip3Aall和cry2Ab4的对应密码子，消除vip3Aall和cry2Ab4基因中ATTTA、AATGAA等富含AT序列和不明确的内含子序列，以及排除基因中存在的大的反向重复序列和常用限制性内切酶识别位点序列；在得到的序列两端加上构建植物表达载体需要的限制性内切酶识别的序列，设计出目标合成的 mvip3Aall(SEQ ID NO. 1)和 mcry2Ab4(SEQ ID NO. 3)。B.对合成新的vip3Aall和cry2Ab4基因与原始基因的比较密码子的使用情况的比较利用计算机分析软件分别分析计算出vip3Aall与mvip3Aall的密码子使用情况， 并进行比较，结果显示新设计合成的mvip3Aall的密码子使用情况与植物基因的频率相似 (结果见表1)，有利于新基因在植物中的表达。表1 vip3Aall与mvip3Aall的密码子使用情况与植物基因密码子使用频率比较
Aacodon普通植物(％)vip3Aall (%)mvip3Aall (%)TTA8560TTG221127LeuCTT241319CTC22541CTA8120CTG15414ATT407844IleATC441256MetATA16100ATG100100100
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本发明涉及“改造的mvip3Aa11基因及其应用”，属于生物防治技术领域。改造的mvip3Aa11基因，编码具有SEQ NO2所示氨基酸序列的蛋白，其核苷酸序列如SEQ NO1所示。本发明通过调整vip2Aa11基因的核苷酸组成，使其接近植物基因的密码子频率而不改变编码的氨基酸序列，并将改造基因组合得以在植物中表达，从而获得对鳞翅目害虫的抗性。