专利名称:免疫势差的制作方法本发明涉及一类连接到免疫原上能增强宿主对该免疫原应答的分子，无论复合物是肠胃外施用、肠内施用或口服都有此效应。ATCC 67331是一株大肠杆菌，于1987年3月2日寄存在美国标准菌种收集中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，MD20852，USA)。为了保护动物抵抗病原体(细菌、病毒或寄生物)的侵入，通常是给动物接种完整生物体或病原体亚基疫苗以在宿主体内诱发保护性免疫应答。由于抗原侵入产生的免疫应答往往可通过共同施用免疫势差剂或佐剂而增强。其中最好的是贮存型的佐剂(如完全弗罗因德氏(Freund)佐剂、不完全弗罗因德氏佐剂或Montanide)。这些佐剂能增强抗体应答，可将单独注射抗原达到的水平提高50到100倍。虽然完全弗罗因德氏佐剂、不完全弗罗因德氏佐剂或Montanide能大大增强抗原的免疫应答，但它们还是存在一些缺点。当以注射方式使用抗原时，注射部位通常受到很大的损伤，这对于用于人体、爱畜或食用动物是不能令人满意的。而且，这些佐剂通过口服或肠内施用不能起到免疫势差剂的作用。本发明涉及一类用化学方法或遗传学方法连接到免疫原或半抗原上能增强宿主对免疫原或半抗原免疫应答的分子，无论复合物是肠胃外施用、肠内施用或口服都有此效应。而且使用它们不会在注射部位产生很大的损伤。有上述能力的分子可定义为具有膜蛋白普通性能的分子，这里所举的例子来自特殊类型的膜蛋白，更准确地说是来自革兰氏阴性细菌的外膜蛋白。具体例子包括TraT蛋白质，它是一种能抵抗菌株被血清杀死的某些大肠杆菌菌株的外膜蛋白。该类的其它蛋白质还有大肠杆菌外膜蛋白OmpA和OmpF。当一定量的TraT、OmpA或OmpF(以后称为载体)不用佐剂通过肌肉注射到小鼠体内时，所诱发的抗体反应可与用可溶蛋白如BSA、鞭毛或羊IgG与不完全弗罗因德氏佐剂混合注射所诱发的抗体反应相比。实际上，由外膜蛋白诱发的抗体反应非常高，即使加上不完全的弗罗因德氏佐剂的辅助也只有少许增加。还发现，口服TraT或OmpA能显著刺激血清抗体抗TraT(1/4096)或抗OmpA(1/892)的滴度。同样发现，适量供给(109-1010)外膜中含有TraT的沙门氏菌(Salmonella)或大肠杆菌(E.coli)也可以加强抗TraT抗体的产生。将半抗原(二硝基酚，DNP)、肽(CSP)或蛋白质(牛血清清蛋白，BSA)共价偶联到OmpA或TraT上，也能起到增强对DNP、CSP或BSA的免疫应答。在第一个具体方案中，本发明提供了一种含有一个与载体分子偶联的免疫原的复合物，当把复合物施用给宿主时，无论是肠胃外施用、肠内施用还是口服，载体分子都能增强所述宿主对免疫原的免疫应答，其中所说的免疫原可以是抗原或半抗原，所说的载体分子包括原核或真核生物的膜结合蛋白质。
在较好的方案中，载体分子是革兰氏阴性菌的外膜蛋白。
较好的革兰氏阴性菌是大肠杆菌或沙门氏菌。
更可取的载体分子是大肠杆菌菌株产生的TraT蛋白或外膜蛋白质OmpA或OmpF。
本发明优先选用的免疫原包括CSP、来自轮转病毒的病毒衣壳蛋白VP7和全部或部分的真核生物蛋白质minactivin。
免疫原-载体复合物可以通过化学方法形成，其中包括结合作用，例如使用合适的结合剂或连接剂;以及载体和/或免疫原上功能团的修饰和/或反应。
因此，本发明提供了一种生产复合物的方法，该复合物含有一个偶联到载体分子上的免疫原，所说的载体分子来自原核或真核生物的膜结合蛋白质(imp)，所说的免疫原包括抗原或半抗原，当把复合物施用给宿主时，无论是肠胃外施用、肠内施用或口服，其中的载体分子能增强宿主对免疫原的免疫应答，这个方法包括下述一个或几个步骤a)使免疫原与载体反应形成上述复合物;
b)化学修饰免疫原以提供至少一个能形成化学连接的功能基团，并使修饰后的免疫原和载体反应以形成上述复合物;
c)化学修饰载体以提供至少一个能形成化学连接的功能基团，并使免疫原和修饰后的载体反应以形成上述复合物;
d)化学修饰免疫原和载体以提供能形成化学连接的功能基团，并使修饰后的免疫原和修饰后的载体反应以形成上述复合物;
e)使免疫原与至少一种连接剂反应，并使连接后的免疫原与载体分子反应以形成上述复合物;
f)使载体与至少一种连接剂反应，并使免疫原和连接后的载体反应以形成上述复合物;
g)使免疫原和载体与至少一种连接剂反应，并使连接后的免疫原和连接后的载体反应以形成上述复合物。
本发明的最佳方法包括(Ⅰ)化学修饰免疫原以提供至少一个能形成化学连接的功能基团;以及(Ⅱ)使修饰后的免疫原和载体反应以形成上述复合物。
连接剂可以含有一个二硫键，或可用酸、碱或高碘酸盐使之断裂。连接剂的例子包括N-(4-迭氮苯硫)苯邻二甲酰亚胺、4，4′-二硫双苯基迭氮化物、二硫双-(琥珀酰亚胺基丙酸盐)、二甲基-3，3′-二硫双丙酰亚胺盐·2HCl、3，3′-二硫双-(硫代琥珀酰亚胺基丙酸盐)、乙基-4-迭氮苯基-1，4-二硫丁酰亚胺盐·HCl、N-琥珀酰亚胺基-(4-迭氮苯基)-1，3′-二硫代丙酸盐、硫代琥珀酰亚胺基-2-(间-迭氮基-邻-硝基苯甲酰胺基)-乙基-1，3′-二硫代丙酸盐、硫代琥珀酰亚胺基-2-(对-迭氮水杨酰胺基)-乙基-1，3′-二硫代丙酸盐、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸盐、硫代琥珀酰亚胺基-(4-迭氮苯二硫)-丙酸盐和2-亚氨基硫醇烷。最佳的交联剂是二琥珀酰亚胺基酒石酸盐和双-〔2-(琥珀酰亚胺基氧羰基氧)-乙基〕-砜。
载体和免疫原的连接可以通过将载体偶联到免疫原的合适基团上而达到。
免疫原-载体复合物是通过化学结合形成时，例如用适当的结合剂或连接剂，最佳的结合剂和连接剂包括1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)碳化二亚胺、戊二醛、间-马来酰亚胺苯甲酸正-羟基丁二酰亚胺酯或N，N1-二环己基碳化二亚胺。
免疫原和载体分子的连接也可通过制备杂交蛋白质分子完成，例如利用DNA重组技术产生，将编码免疫原的DNA插入或加入到编码载体的DNA序列中。
因此，本发明提供了一种制备上述载体分子与免疫原的复合物的方法，该方法包括制备杂交蛋白质分子。在最佳的方法中，杂交蛋白质分子是通过重组技术产生，将编码免疫原的DNA插入或加入到编码载体的DNA序列中。
本发明还提供了一个DNA杂交序列，该序列含有一个第一DNA序列，此序列至少编码部分原核或真核生物的膜结合蛋白质，并与编码免疫原氨基酸序列的DNA序列相融合;或一个与上述第一DNA序列杂交的第二DNA序列，它可从任何来源获得，包括天然的、合成的和半合成的来源;一个由于突变相关的DNA序列，包括单个或多个碱基置换、缺失、插入和上述第一DNA序列的倒位;或一个含有这样的密码子序列的DNA序列，该密码子序列表达的多肽与前面任意一种DNA杂交序列和插段的表达多肽具有相似的免疫学或生物学活性。
本发明最佳的DNA杂交序列至少编码部分的TraT、OmpF或OmpA，此序列与编码免疫原氨基酸序列的DNA序列相连接，所得到的TraT、(OmpF或OmpA)杂交蛋白可输送到宿主细胞并与其表面发生作用。
本发明还提供了一个融合基因，它包括一个与转移启动子融合的本发明的DNA杂交序列。本发明最佳的启动子是λ噬菌体的P1启动子。
此外，本发明还提供了一种DNA重组分子，它含有本发明的DNA杂交序列和载体DNA，其中的载体DNA是质粒、噬菌体、病毒或柯氏质粒DNA。
本发明最佳的DNA重组分子包括有效地连接到DNA杂交序列上的表达控制序列。
本发明特别优选的DNA重组分子包括pBTA371，pBTA439，pBTA449，pBTA450和pBTA586。
本发明的范围中还包括一种制造DNA重组分子的方法，该方法包括将本发明的DNA杂交序列导入克隆载体中。
该方法最好还包括将表达的控制序列导入克隆载体这一步骤。
本发明还提供了至少有一个本发明DNA重组分子的宿主转化株。
合适的宿主包括大肠杆菌和沙门氏菌。
最好的转化株是ATCC 67331(也命名为CCTCC87026)。
本发明还包括转化宿主的方法，该方法包括的步骤是将本发明的DNA重组分子导入宿主。
在更进一步的方案中，本发明提供了适于肠胃外注射到宿主体内或适于口服或肠内施用的载体和免疫原的复合物，以诱发体液和粘膜的抗体应答。
本发明包括的范围还有制备以适于宿主肠胃外施用、肠内施用、口服形式存在的载体和免疫原复合物的方法，该方法包括制备复合物和将它加入药学上允许的稀释剂中。
更好的是，本发明提供了一个完整的细菌细胞疫苗，它包括本发明的杂交蛋白质，它暴露在细菌细胞表面以便与免疫系统相作用。完整的细胞疫苗可以是活的，也可是被杀死的完整细胞的口服疫苗。另一方面，杂交蛋白质也可从细胞膜或细胞内容物中纯化，用作肠胃外施用、肠内施用或口服的亚基疫苗。
本发明还提供了一种制造具有杂交蛋白质生物合成遗传信息的微生物的方法，该杂交蛋白质至少含有一个免疫原和至少含有部分来自原核或真核生物的膜结合蛋白载体，而且杂交肽可与宿主细胞表面相互作用，该方法包括培养带有必要遗传信息的微生物。如果微生物是用来提供亚基疫苗的，则该方法还包括从细胞膜或细胞内容物中纯化杂交肽。
图1.用佐剂修饰免疫应答用TraT(图1a)和BSA(图1b)单独或与各种不同的佐剂结合给兔子进行肌肉注射。用FIA(△-△);Montanide 888(●-●);Alhydrogel(□-□);生理盐水(×-×)与TraT和BSA混合(图1a，1b)。用生理盐水注射所产生的对TraT(×-×)、OmpA(■-■)和OmpF(○-○)的抗体应答作为比较列在图1c中。
图2.通过在DNP和BSA上偶联TraT和OmpA来刺激抗体应答在肌肉注射后，比较TraT(+-+)、OmpA(×-×)和BSA(
)的二硝基苯代制备物刺激抗载体(图2a)和抗DNP抗体应答的能力(图2b)。还测定了单独注射TraT(●-●)和OmpA(■-■)的抗体应答。同样，用生理盐水注射BSA(○-○)、与FIA混合(
)或与TraT(
)或OmpA(□-□))或OmpA(□-□)上后注射、与TraT(▲-▲)或OmpA(■-■)混合后注射或与TraT(△-△)或OmpA(●-●)在不同的部位分开注射后，测定这些膜结合蛋白免疫势差的能力(图2d)。
图3a.显示了质粒pBTA449、pBTA439和pBTA371的构建。
图3b.测定TraT和TraT-VP7的融合蛋白表达的SDS-PAGE和Western分析结果。
图3c.表达TraT(第1条)、TraT-VP7(第3条)和对照(第2条)的细胞表面标记的大肠杆菌的放射自显影图谱，细胞用I125和乳过氧化物酶进行标记。
图4a.显示了质粒pBTA450和pBTA586的构建。
图4b.显示了由pBTA586表达的TraT-minactivin杂交蛋白质(Trat MIN)的SDS-PAGE凝胶电泳结果。
缩写(图3和图4)抗氨必西林，Arp;抗氯霉素，Crm;氯化汞，H+g;四环素，Tc;VP7结构基因，VP7;Trat结构基因，TraT;TraTVP7融合基因，TraT-VP7;λ噬菌体Pl启动子区，Pl;限制性核酸内切酶Al，AluI;A，AvaI;D，DraI;B，BamHI;E，EcoRI;N，NdeI;Pv，PvuⅡ;RV，EcoRV;Ss，Sspl。
下述实例是本发明最好的体现，但并不限制本发明的范围。
实例1 TraT、OmpA和OmpF的分离大肠杆菌(含有质粒pBTA439的BTA1352菌株)于发酵罐内在30℃下和MEB培养基中进行培养。在42℃下热诱导TraT2小时后收集细胞。在Amicon DCIOLA浓缩器中用0.1μ空心纤维将细菌浓缩到2升。然后用10升蒸馏水洗涤细胞并再浓缩到800ml。由浓缩物中转移出细胞浆，然后加入200ml PH2.5的1M醋酸钠缓冲液，再加1升用40%乙醇配制并加有1MCaCl2的10%的Cetrimide(Sigma)溶液，从而将外膜蛋白(TraT、OmpA和OmpF)从细胞中提取出来。提取物于室温下放置过夜，然后离心(17000×g，20分钟)除去细菌。
采用加入乙醇至50%以及离心(40000×g，10分钟)的方法将TraT和OmpF由上清液中沉淀出来，然后再将乙醇加至80%，将OmpA从最后的上清液中沉淀出来。
离子交换层析含有OmpF和TraT的50%乙醇的沉淀用含有0.5%两性洗涤剂的20mM，PH5.0醋酸钠缓冲液再悬浮，并将它们装入5×50cm的DEAE-Sepharose(药物纯化学制剂)柱中，在装柱前，柱子先用含有0.1%两性洗涤剂的20mM，PH5.0醋酸钠缓冲液进行平衡。在过柱液中就可得到TraT，用0-1.0M氯化钠线性梯度的平衡缓冲液可将结合的OmpF由柱中洗脱下来。利用改变的Laemmli(Laemmli，U.K.Nature(Lond)227680，1970;Salit et.al.，J.Exp.Med.151716，1980)的方法，通过SDS-PAGE分析各个组分，汇集含有TraT或OmpF的分离组分并经乙醇沉淀进行浓缩。
Sephacryl S-300层析将含有OmpA的80%乙醇沉淀再悬浮在有1%SDS，20mMPH8.8的Tris-HCl中。收集各个组分，用SDS-PAGE进行分析，汇集含有OmpA的组分并通过乙醇沉淀进行浓缩。
用SDS-PAGE进行测定和用Tsai C.M.和Frasch，C.E.(Anal.Biochem.119115，1982)方法进行银染色后，发现用上述方法纯化的蛋白质中不含LPS。
载体的二硝基苯基化按照Little和Eisen，《Methods in Immunology and Immunochemistry》(E.D.Williams，CA和Chase，M.W.)1，P.128，Academic Press，NY，1967的方法，将TraT、OmpA和OmpF进行二硝基苯基化，简单地说，就是将载体(在0.1M，PH9.5的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中)与0.1M DNFB溶液(在丙酮中)在室温下反应过夜。然后使蛋白质对偶联缓冲液进行彻底的透析。
戊二醛偶联用Avrameus等(1978)的二步戊二醛方法，将BSA(来自Sigma Chemical Co.St.Louis，Miss)偶联到TraT、OmpA和OmpF上。简单地说，使BSA与0.2%戊二醛在室温下反应2小时。然后使蛋白质对PH9.5的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液透析过夜，以BSA∶omp为1∶1的克分子比率加入omp，于室温下反应24小时。最后，加入最终浓度为0.1M的乙醇胺(Sigma)(1小时，室温)后，于4℃下，用0.1M PH9.5的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液透析过夜。
施用抗原1.兔子给新西兰白兔(2-2.5Kg)用0.5ml无菌生理盐水肌肉注射抗原。
在0和36天进行注射。从兔子耳朵的纵向静脉每周抽血一次，用TraT、OmpA、BSA或DNP-羊IgG作为膜抗原，采用标准的ELISA方法测定抗体滴度。
2.小鼠由动物资源中心(Perth，Western Australia)得到雌性C57BL/6J小鼠(18-22gm)。所有小鼠在口服或肌肉注射抗原前都饥饿3-4小时。用一个专门制备的注射针，给小鼠施用在0.5ml PH9.5的0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中的适当浓度的抗原。用0.1ml无菌生理盐水将同样的抗原剂量注射在左后腿上。口服或肌肉注射抗原的小鼠每组五只，它们都在0和14天给予两个相同的抗原剂量。在14和21天由眶后丛取血样(约0.5ml)。然后通过颈部移位术处死小鼠而且按下述方法冲洗小肠。小心地摘除小肠，并用钝头注射针将少量洗涤缓冲液(1.0ml，30mM Tris-HCl PH8.8，0.9%NaCl，50mM EDTA，1.0%Tween20)注入肠道中。用食指和姆指轻揉肠道将内容物挤压出来。将得到的肠洗涤液马上离心去除碎片并在-20℃下贮存以备检测。在除去血清和在-20℃下贮存以前，使血样在4℃下凝结。
酶联免疫吸附测定(ELISA)测定抗体滴度的ELISA法可以用Russell-Jones等
(J.Exp.Med.1601467，1984)的方法进行。滴度用抗血清稀释度的倒数表示，在37℃下45分钟后，所给出的ELISA读数为0.5。
实例2佐剂对膜结合蛋白质抗体应答的作用通过肌肉注射测定膜结合蛋白质本身作为佐剂分子的能力。将单独注射TraT(图1a，×-×)或BSA(图1b，×-×)所产生的抗体滴度与将TraT(图1a)或BSA(图1b)与一些佐剂混合注射所产生的抗体滴度进行比较。
用生理盐水肌肉注射TraT能很快诱发高滴度的抗免疫试剂的血清抗体(图1a)。实际上，用佐剂如Montanide或FIA注射TraT，只能将用生理盐水注射TraT所产生的滴度提高4-8倍(图1a)。这与通过可溶性抗原BSA产生的应答形成鲜明的对比。在这种情况下，以生理盐水形式施用抗原产生的抗体应答较弱，但以FIA或Montanide为佐剂注射抗原就可明显地增加60-100倍(图1b)。
同样，单用生理盐水注射OmpA和OmpF也能诱发很高的血清抗体滴度。实际上，注射100μg TraT、OmpA或OmpF(图1C)诱发的抗体滴度非常相似。
实例3 抗原-膜结合蛋白质复合物辅佐能力的测定测定TraT和OmpA增强抗半抗原(DNP)和抗蛋白质(BSA)应答的能力。先将这两种膜结合蛋白用DNP取代(用二硝基氟苯，见实例1)或通过戊二醛交联到BSA上，然后进行肌肉注射。
将DNP或BSA偶联到Trat或OmpA上，对抗膜结合蛋白应答的产生只有很小的作用(图2a，参见1c)。然而膜结合蛋白的二硝基苯基化增强了抗DNP的应答，它比用生理盐水注射DNP-BSA产生的应答要高4-16倍(图2b)。同样，施用在FIA中的BSA，抗BSA的应答也会有很大的增强(图2c)。当BSA共价连接到膜结合蛋白TraT或OmpA上对抗BSA应答的免疫势差作用最大。实际上，在与膜结合蛋白不同的部位注射BSA减弱对BSA的次级应答(参见2d和2c)。
实例4 剂量对TraT免疫应答的作用用小鼠测定通过肌肉注射和口服增加TraT剂量的作用。
通过肌肉注射或口服增加剂量的TraT对每组5只小鼠进行免疫。小鼠在0和14天接受剂量，在第21天抽血，处死和洗肠。通过ELISA检测发现抗体滴度增加。
由表1可知，增加TraT剂量，无论是口服还是肠胃外施用，都会导致血清中抗TraT抗体应答的依赖剂量的增加。
然而，肠胃外施用的作用比口服大得多。
表1施用途径抗原剂量 肌肉注射 口服血清IgG 血清IgG 肠IgA 肠IgA0.1 2，048±900 - - 6±2 7±41 3，565±1，300 7±2.6 9±3 6±22 10，809±1，900 2±2 13±5 56±85 5，405±400 13.9±9 24±3 42±710 28，526±7，280 12.0±2 16±4 18±525 24，833±6，040 9.1±3 6±2 7±450 49，667±13，020 97±25 9±5 11±6100 65，536±16，000 64±36 - -200 150，562±64，000 675±400 32±20 14±7400 86，475±19，000 97±45 6±2 24±13实例5 半抗原含量对膜结合蛋白作为抗DNP应答载体能力的影响的测定按实例1所述方法，将TraT、OmpA和OmpF用DNP膜结合蛋白的不同比例进行取代。每组5只小鼠在0和14天肌肉注射剂量为50μg的DNP载体复合物。在21天对小鼠抽血，用ELISA作抗体滴度测定。
DNP与载体的取代比例从0.5∶1增加到4∶1能大大增强抗半抗原的应答。取代比例增加到10∶1以上似乎减弱抗半抗原的应答。
表2抗原 取代 途径 抗体应答(血清IgG)DNP TraT 0.51 肌肉 21±1311 ″ 337±7121 ″ 1552±53641 ″ 3104±954DNP-OmpA 0.51 ″ -11 ″ 84±2021 ″ 256±10941 ″ 776±164DNP-OmpF 0.51 ″ 7±411 ″ 49±1221 ″ 97±2841 ″ 337±115实例6 通过偶联到TraT上产生抗CSP的应答合成具有下述序列的肽NH2-Cys-(Asn-Pro-Asn-Ala)4，这是从P.falciparum的外源孢子小体蛋白(CSP)衍生来的一种合成肽，并且将它与TraT连接以测定TraT对肽抗原的辅佐效能。
用戊二醛或马来酰亚胺苯甲酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)使CSP抗原偶联到TraT上。将这种方法制备的结合物a)在0和28天注射到兔中，然后第38天抽血，或b)在0和14天注射到5只一组的小鼠中，小鼠在第21天抽血，如前述方法测定抗体滴度。
无论是用戊二醛或MBS将CSP抗原偶联到TraT上后对兔或小鼠进行免疫，都能促进抗CSP的应答，此促进效果与当抗原偶联到BSA上后用Montanide佐剂注射产生的效果差不多。
表3抗原(血清) 偶联过程 动物 剂量 抗体应答(微克) 抗TraT 抗CSPCSP-TraT 戊二醛 兔 200 28526 147CSP-TraT MBS ″ 200 12417 1024CSP+Montanide - ″ 200 28 -CSP-BSA+Montanide 戊二醛 ″ 200 - 2353CSP-TraT 戊二醛 小鼠 50 228209 32CSP-TraT MBS ″ 50 3566 128CSP+Montanide - ″ 50 - -CSP-BSA+Montanide 戊二醛 ″ 50 - 9实例7 TraT-免疫原蛋白复合物的基因构建编码TraT蛋白的基因位于R质粒R100(或R6-5)中，此基因的核苷酸序列已经测定(Ogata等，J.Bacteriol.151819-827)。TraT是一种位于外膜同时接触细胞表面并与肽聚糖联系的低聚脂蛋白，一种内部结构。根据这些事实，首先将含有TraT的R100质粒的6.0Kb的EcoRI片段克隆到多拷贝质粒pBR329中构建质粒载体(图3a)。然后去掉不需要的3Kb BamHI片段，并通过在EcoRV位点插入M13mp8的平头末端的HaeⅢ小片段进行钝化，以产生pBTA449。此载体质粒含有引导TraT合成的天然的TraT启动子。用强的λ噬菌体Pl启动子(如图3a中的pBTA439或图4a中的pBTA586质粒)置换弱的TraT天然启动子能加强TraT的表达。TraT基因含有一个EcoRV位点(只有pBTA449才有)，在此位点可插入外来DNA序列，使TraT和外源蛋白的融合物准确地输出到细胞表面，并因此使外源蛋白片段与细胞表面相作用。
在一个实例中，用一个病毒衣壳蛋白(VP7)基因形成TraT-VP7杂交蛋白。VP7是轮转病毒的一个结构蛋白，抗纯化的VP7蛋白的抗体能在细胞培养中有效地中和病毒的感染性(Dyall-Smith等，1985《Infectious Diarrhoea in the Young》ed.S.Tzipori)。因此，以合适形式表达的VP7蛋白，是轮转病毒疫苗的一个主要选择物。
将轮转病毒NCDV VP7基因的AluⅠ-PruⅡ限制片段克隆到pBTA449质粒的EcoRV位点中，随后用Pl启动子(pBTA371，图3a)表达。为了进行表达，用质粒pBTA371转化含有λ的热敏感CI抑制因子的大肠杆菌K-12N4830菌株(Joyce等，PNAS801830-1834，1983)。用pBTA371转化的细胞在30℃下和含有100微克/毫升氨苄青霉素的MEB培养基中培养过夜(Mott等，PNAS 8288-92，1985)。用MEB培养基稀释细胞，在30℃下培养至OD600等于1.0，然后加入等体积的预热(65℃)的MEB培养基，以将温度平衡至42℃。在42℃下培养4小时后收集细胞，并测定诱导的TraT-VP7杂交蛋白。在大肠杆菌N4830中观察到高水平表达的TraT-VP7蛋白复合物(10-15%总细胞蛋白或每个细胞大于500，000个拷贝)。这种复合物中有很大一部分存在于外膜组分中(图3b、3c)。
下面给出了另一种方法的实例，以产生TraT蛋白的部分编码序列与真核生物蛋白minactivin的部分或全部编码序列的杂交蛋白。
如图4a所示，用SsPⅠ和DraⅠ降解质粒pBTA440，并通过琼脂糖凝胶分离1110bp片段。将此片段连接到用EcoRV降解的载体pBTA449上产生pBTA450。然后用AvaⅠ降解pBTA450，并将纯化的2800bp片段连接到用AVaⅠ降解的质粒pLK57上产生质粒pBTA586。这样就将minactivin的部分编码序列置于λPl启动子的控制下，并与TraT基因的前80个氨基酸编码序列相融合，其中前面20个氨基酸是信号序列，它将杂交蛋白输送至大肠杆菌外膜中。在转运到外膜时此信号序列被切断，外膜是TraT蛋白的正常定位位点。
如上述将pBTA586转化到一个适当的宿主如N4830中，并改变温度进行诱导，TraT-Minactivin杂交蛋白出现在外膜组分中，正如图4b所示。
实例8 外膜中含有TraT表达物的菌株的口服给雌性C57B1/65小鼠(20-25克)饲喂109-1010细菌(大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌的galE-突变种)，这些细菌的外膜中有TraT表达物。用接收没有TraT蛋白的同样的菌株作为对照。一周后将小鼠抽血，如前述测定抗TraT的滴度。
表4以抗体滴度倒数给出结果，它们代表10只小鼠的平均值。
表4 对口服完整细菌的抗体应答抗TraT 抗OmpA菌株 TraT 血清 肠 血清 肠大肠杆菌 - 3 5.2 14 2+ 350 15 110 2沙门氏菌 - 12 2 - -+ 650 6 - -本发明可用于制备用于人、爱畜和食用动物的疫苗，一般用于加强口服、肠道和肠胃外施用抗原的应答效果。


本发明提供一类载体分子，当它们连接到免疫原上时能提高宿主的免疫应答，不管这种免疫原和载体的复合物是通过肠胃外，还是肠内或口服途径施用于宿主都有此效果。本发明还提供了复合物的生产方法、编码本发明复合物的DNA杂交序列、含有所述DNA杂交序列的DNA重组分子、转化细胞和包括本发明复合物的疫苗及生产所述疫苗的方法。