专利名称：钙调素结合型蛋白激酶基因的制备方法及在水稻中的应用的制作方法 在植物发育过程中，Ca2+通过同其靶蛋白相互作用起着非常重要的作用，首先钙信号通过钙靶蛋白进行信号转导，钙靶蛋白又通过和其靶蛋白分子结合而启动基因表达和细胞生命活动，从而构成钙信号转导的复杂体系。植物中深入研究过的Ca2+靶蛋白主要有两种即钙结合型蛋白激酶(CDPKs)及钙调素(CaM)。目前已对多种CDPKs进行了生化和分子生物学分析，并已探讨出它在植物生理和发育过程中的多种功能。同样对CaM的研究亦显示它参与植物发育和环境应答反应，然而有关植物中CaM结合蛋白激酶功能的研究起步较晚，已经分离到的基因有三种从苹果中分离的钙调素依赖型蛋白激酶II的同源物(Watillon，B.，Kettmenn，R.，Roxus，P.and Burny，A.A calcium/calmodulin bindingserine/threonine protein kinase homologous to mammalian type IIcalcium/calmodulin-dependent protein kinase is expressed in plant cells.PlantPhysiol.(1993)101，1381-1384)；从玉米中分离到的钙调素依赖型蛋白激酶II的同源物，MCKI和MCK II(Lu YT，Hidaka H，Feldman LJ..Characterization of a calcium/calmodulin-dependent protein kinasehomolog from maize roots showing light-regulated gravitropism.Planta(1996)199，18-24.；Lu YT，Feldman LJ..Light-regulated rootgravitropisma role for，and characterization of，acalcium/calmodulin-dependent protein kinase homolog.Planta(1997)203，S91-S97；嵌合型的钙调素依赖型蛋白激酶(CCaMKs)(Patil S，Takezawa D，Poovaiah BW..Chimeric plant calcium/calmodulin-dependent proteinkinase gene with a neural visinin-like calcium-binding domain.Proceedings of National Academy of Sciences.USA(1995)92，4897-4901；Ramachandiran S，Takezawa D，Wang W，Poovaiah BW..Function domains ofplant chimeric calcium/calmodulin-dependent protein kinaseregulationby autoinhibitory and visinin-like domains.Journal of BiologicalChemistry(1997)121，984-990；Liu ZH，Xia M，Poovaiah BW..Chimericcalcium/calmodulin-dependent protein kinase in tobaccodifferentialregulation by calmodulin isoforms.Plant Molecular Biology(1998)38，889-897；Poovaiah BW，Xia M，Liu ZH，Wang WY，Yang TB，SathyanarayananPV，Franceschi VR.Developmental regulation of the gene for chimericcalcium/calmodulin-dependent protein kinase in anthers.Planta(1999).209，161-171)。许多这方面的研究表明其参与介导许多细胞活动过程，包括基因的转录，细胞周期，神经记忆，碳水化合物代谢，细胞骨架功能等。利用MCK1为探针，从水稻的cDNA文库中筛选得到了一种同MCK1同源性很高的蛋白激酶基因(Lei ZHang，Bi-Feng Liu，Shuping Liang，Russell L.Jones andYing-Tang Lu..Molecular and biochemical characterization of acalcium/calmodulin-binding protein kinas from rice.Biochem J.(2002)368，145-157)该基因具有蛋白激酶的12个保守区和一个钙调素结合区，以此命名为OsCBK(Oryza sativa calcium/calmodulin-binding protein)。并且对该基因进行了生化分析(Zhang，et al.，2002)。另外在植物的组织培养中通常按照常规条件如陈正华主编，高等教育出版社，1986，木本植物组织培养及其应用；(联邦德国)赖纳特(REINERT，J.)，(英)约曼(YEOMAN，M.M.)著；尤瑞麟，王模善译，北京大学出版社，1988，植物细胞和组织培养实验手册；以及德)巴尔茨(W.Barz)等主编；夏镇澳等译，科学出版社，1983，植物组织培养及其在生物技术上的应用等书中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。在中国专利02138701(申请中)中，发明人公开了一种烟草基因序列，该基因在烟草中的表达导致烟草表现出晚开花性状。在杂交水稻研究领域，人们一直想通过亲本性状的优势组合来提高作物的产量，或通过缩短作物的生长周期实现二季稻等方式来提高单位面积产量实现亩产过于斤的增产目标。但是这增加了农民的劳动强度，并增加了农民负担。同时这些研究都忽视了通过延长作物特别是水稻的生长周期，增加千粒重达到增产目的的方式。更重要的是，将钙调素结合型蛋白激酶基因转入类似水稻这种单子叶植物并高效表达且显示优良性状是困难的。
本发明的目的在于提供一种钙调素结合型蛋白激酶基因的制备方法，并提供一种能高效表达钙调素结合型蛋白激酶基因的植株。该转基因植物表现晚开花性状，生长周期延长，千粒重增加。本发明的另一个目的在于提供一种钙调素结合蛋白激酶基因在水稻中的应用。在本发明中，为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案，该方法包括下列步骤A.用BamHI酶切已克隆到的钙调素结合蛋白激酶基因；B.将A步获得的基因连接到中间载体pAHC17上，形成pAHC17-R19(+)；C.用HindIII，EcoRI于37℃双酶切pAHC17-R19(+)，并连接到同样双酶切的表达载体pCAMBIA1300或pCAMBIA1301上，使得钙调素结合蛋白激酶基因置于泛素启动子和NOS尾巴之间，形成可转化或表达的载体；D.将制备的载体通过制备的农杆菌EHA105感受态转化进入农杆菌EHA105，再导入成熟胚诱导的水稻愈伤组织中；E.筛选阳性植株.将愈伤转入选择培养基26℃黑暗培养两周，转入新的选择培养基再培养两周，将抗性愈伤转入预分化培养基中26℃黑暗培养一周后，转入分化培养基中于4000Lux下，26℃培养至诱导的绿芽3-4cm，转入生根培养基中生根，长出根系后，将再生植株转入培养钵中荫处培养4-5天，最后转入大田中培养至成熟。在本发明中，钙调素结合蛋白激酶基因OsCBK序列如序列表所示。该基因用两种引物RF5(5’-cgggatccatgggtctctgccatggcaag-3’)和RF3(5’cgggatcctcaggtttttgggatggtacgc-3’)。以克隆有钙调素结合蛋白激酶基因的pET32a+载体作为模板DNA，通过PCR方式合成并获得全长的水稻钙调素结合蛋白激酶基因OsCBK(Oryza sativa calcium/calmodulin-binding protein)。用BamHI37℃消化PCR获得的全长的OsCBK基因并克隆到中间载体质粒pAHC17中，形成pAHC17-R19(+)，其插入片段经DNA测序鉴定.pAHC17-R19(+)含有编码OsCBK全长597氨基酸的序列。将连有OsCBK全长及启动子的片段一起切下，连入pCAMBIA1300或pCAMBIA1301，其插入片段经DNA测序鉴定.然后将含有钙调素结合蛋白激酶基因的载体转染农杆菌EHA105，培养农杆菌于YM液体培养基，并将成熟胚诱导的水稻愈伤组织在菌液中浸泡。在加潮霉素的选择培养基筛选阳性克隆。在本发明的一个具体实施例中，愈伤组织选自水稻，通过选择培养基最后筛选到钙调素结合蛋白激酶高表达的植株。
本发明还公开了钙调素结合蛋白激酶基因在水稻中的应用，以及含有钙调素结合蛋白激酶基因高表达的水稻。
本发明与现有技术相比具有以下优点转基因植株表现出晚开花性状，开花时间比野生型对照大约推迟了15-20天，相应的生育期也延长。同时千粒重有约15％的增加，只种一季水稻就有可能提高农作物单位面积产量，每亩增产约10-15％。


图1植物表达载体示意图Hygromycin为潮霉素抗性，promoter为泛素启动子，NOS尾巴为转录终止子。+号表示基因为正向插入。图2植物表达载体构建示意3转化植株的核酸分析-PCR鉴定结果1-8样为转基因植株，9为对照野生植株，结果显示转基因植株1，2，3，5，6，8成功导入基因于野生植株。图4转化植株的Southern结果1-5样为转基因植株，6为对照野生植株，结果显示转基因植株基因导入位点不同。图5转基因水稻与野生水稻对比 图中左为转基因水稻，右为野生水稻。

下面结合具体实施例。进一步阐述本发明。
实施例1含有钙调素结合型蛋白激酶基因的表达载体构建根据图1和图2所示，本实验使用两种引物，其核酸序列分别为RF5(5’-cgggatccatgggtctctgccatggcaag-3’)和RF3(5’cgggatcctcaggtttttgggatggtacgc-3’)。以RF5/RF3作为引物组合，以克隆有钙调素结合蛋白激酶基因的pET32a+载体作为模板DNA，通过PCR(94摄氏度53min，94摄氏度1min，65摄氏度50s，72摄氏度1min30s，30 cycles，72摄氏度10min)方式合成并获得全长的水稻钙调素结合蛋白激酶基因的全长OsCBK(Oryza sativa calcium/calmodulin-bindingprotein)。将中间载体质粒pAHC17用限制性内切酶BamHI37摄氏度消化，得到pAHC17/c，同时将用限制性内切酶BamHI37摄氏度消化的DNA片段克隆到pAHC17/c中，得到pAHC17-R19(+)，用HindIII，EcoRI37摄氏度双酶切pAHC17-R19(+)，得到连有启动子的全长OsCBK，并连接到同样双酶切的表达载体pCAMBIA1300或pCAMBIA1301上(用双酶切的pCAMBIA1300或pCAMBIA1301载体称为pCAMBIA1300/c或pCAMBIA1301/c)，使得钙调素结合蛋白激酶基因置于泛素启动子和NOS尾巴之间，形成可转化或表达的载体，即1300(A4)-R19正向。其插入片段经DNA测序鉴定后.最终用来转化农杆菌。
实施例2含有钙调素结合型蛋白激酶基因的植株的转化与筛选1.农杆菌感受态的制备将农杆菌EHA105划YM平板，26-28℃培养48小时，挑取单菌落接种到40ml YM液体培养基中，250rpm悬浮培养约12-16小时，然后在超净台上将菌液转入灭过菌的50ml离心管中，4℃，8000rpm，离心8分钟，弃上清，用100mMNaCl(4℃预冷)重悬农杆菌，4℃，8000rpm，离心8分钟，弃上清，加入原始菌液1/50体积(800μl)的20mM CaCl2重悬菌体，并分装成100μl/管。(此时的感受态农杆菌可以直接用于转化)，或置液氮中10秒钟，放入-20℃或-80℃冰厢中保存备用。
2.农杆菌的转化将感受态农杆菌置于冰上，加入1μg质粒DNA(体积不宜超过10μl)，充分混匀，置冰上30分钟，置液氮中1分钟(时间不能过长)，然后迅速转入37℃水浴中，待其融化后加入1ml YM液体培养基于28℃，230rpm培养2-4小时，3000rpm离心2分钟，将上清吸去500μl，留500μl于管中，振荡重悬菌体，并涂布到含有适当抗生素的YM平板上，吹干，28℃培养48小时，挑取单菌落接种到液体YM培养基中，28℃，250rpm培养48小时，菌液用于保存或转化。
3.水稻的农杆菌转化将成熟的水稻种子去壳，所用品系为粳稻品种中花11，台北309。在超净台上将去壳的种子在70％乙醇中消毒1分钟后灭菌水清洗种子三次；再用0.15％氯化汞消毒种子20分钟，灭菌水清洗种子三次，将种子接种在2N6培养基中，于26℃黑暗培养大约五周。将由盾片诱导的愈伤转入新的2N6培养基，26℃黑暗培养大约三周。将愈伤转入预培养培养基中26℃黑暗预培养4天。在预培养的第三天，将含有表达载体的农杆菌EHA105接种于YM/kan液体培养基中26℃250rpm悬浮培养两天。也可接种到相应的平板上培养两天，收集农杆菌重悬于悬浮介质中并悬浮培养1小时后，将细菌悬液的浓度调到OD600值为1.0，将预培养的水稻愈伤组织转入其中浸泡30分钟，并不时轻轻晃动容器，将愈伤组织转入灭过菌的滤纸上，吸干菌液。将愈伤组织转入共培养培养基上于19-20℃黑暗培养3天后将愈伤组织转入灭菌水中洗3次再用400ppm的羧苄青霉素溶液浸泡愈伤组织20分钟，转入灭菌的滤纸上吸去剩余的水分，将愈伤转入选择培养基26℃黑暗培养两周，转入新的选择培养基再培养两周，将抗性愈伤转入预分化培养基中26℃黑暗培养一周后，转入分化培养基中于4000Lux下，26℃培养至诱导的绿芽3-4cm，转入生根培养基中生根，长出根系后，将再生植株转入培养钵中荫处培养4-5天，最后转入大用中培养至成熟。
实施例3含有钙调素结合型蛋白激酶基因转化植株的核酸分析1.用于PCR的转化植株总DNA的提取根据图3所示，70％7醇擦洗叶片，称取100mg，加入600μl抽提缓冲液(0.2MNaCl，25mM EDTA，0.5％SDS，pH7.5)，室温快速研磨，在1.5ml Eppendorf管中涡旋混匀5-20秒于室温，12000rpm，离心25分钟。取上清加等体积异丙醇，上下颠倒混匀。-20℃沉淀过夜，室温条件下，12000rpm，15分钟。弃上清，倒置于吸水纸上待壁上液体流尽后加入200μl 70％的乙醇泡洗DNA沉淀，室温，12000rpm，10分钟。弃乙醇，倒置于纸巾上待其干燥后加100μl TE(pH7.5)溶解沉淀。分光光度计测定或电泳估测DNA浓度，最后以总DNA为模板，进行PCR反应和电泳检测。
2.PCR程序
PCR反应混合液的配比同质粒PCR鉴定，反应的时间和温度作如下94摄氏度53min94摄氏度1min，55摄氏度1min，72摄氏度1min30s，30 cycles72摄氏度10min实施例4含有钙调素结合型蛋白激酶基因转化植株的核酸分析Southern杂交1.DNA抽提(CTAB法)根据图4所示，称取水稻样本新鲜叶片约5克，剪碎放入预冷的研钵中，用液氮磨成粉末。转移粉末到预冷的玻璃瓶中，暂存于-20℃冰箱(不超过24小时)加入适量预热至100℃的1.5×CTAB抽提液，迅速搅匀后置于56℃水浴中温浴20分钟，取出玻璃瓶，冷却至室温(切忌低于15℃，以免CTAB发生沉淀)，将瓶中混合液倒入一支50ml离心管中，加入一倍体积氯仿/异戊醇(24∶1)。反复颠倒充分混匀，室温下4000rpm离心20分钟。将上层液移入一新的50ml离心管，加入1/10体积的10％CTAB(预热至56℃)及等体积的氯仿/异戊醇，充分混匀，4000rpm室温离心20分钟。吸取上清液至另一新的50ml离心管中，加入等量的1％CTAB沉淀液，轻轻摇晃直至形成DNA絮状沉淀。3000rpm离心10分钟，使DNA沉淀于管底。加入5ml 1M NaCl及5ul RNaseA，置于56℃水浴中过夜。待DNA完全溶解后，加10ml 95％冰乙醇使DNA沉淀。挑出DNA用76％7醇洗30分钟，再用95％乙醇浸泡5分钟。将风干的DNA溶于适量TE溶液中，存于4备用。
2.DNA的限制性消化，电泳与Southern转移电泳检测总DNA质量。调节所有样品DNA浓度至200-400ng/ul(最好是250-300ng/ul)每样品取2.5-3ug总DNA，用限制性内切酶进行消化，反应体积为15ul。置于37℃恒温箱中6小时后，加入1.5ul溴酚蓝终止酶切反应，取2ul用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测酶切质量。酶切反应液配方如下DNA 2.5ug10*buffer 1.5ulEnzyme5u
加水至15ul通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，电泳缓冲液为1×TAE，电压40V，过夜。将凝胶切成19.5×9.5cm大小，右下方切角作标记，放在0.2N HCl中变性8分钟，用双蒸水漂洗，迅速用0.4N NaOH溶液作为转移液通过毛细作用原理使胶上DNA片段转移到Hybond-N+尼龙膜上。转移24小时后取出膜，用2×SSC漂洗两次(各5分钟)，晾干放入100-120℃真空烘箱中烘烤3小时，使DNA固定于膜上。
3.探针标记计算探针混合液中各成分的体积DNA 100ngDNTPs(dATP，dGTP)2.0μl引物 2.0μlklenow Fragment(IU/μl) 1.0μlα-dCTP* 1.0μl加水至 17.0μl取适量待标记的探针DNA，加水至规定体积，于100℃变性10分钟，冰浴5分钟。预先配制dNTP、引物和klenow酶混合液，分装到各装有探针DNA的Eppendorf管。最后往各管中加入适量体积的α-32P-dCTP，用枪头搅匀，25℃温浴2小时以上。
4.Southern杂交将新杂交膜用2×SSC打湿，装入杂交炉中。加入适量体积(10-20ml)预热至65℃的预杂交液，于65℃预杂交2小时以上。取出标记好的探针，加入500μl杂交液，于100℃变性5分钟，冰浴5分钟。将已变性的探针加入杂交炉中，置于65℃恒温杂交8-10小时。
5.洗膜、压片杂交完成后，用含2×SSC，0.2％SDS的洗液在室温下冷漂洗一次，再用预热至65℃的洗液(1×SSC或0.5×SSC，0.1％SDS)于65℃热洗两次，各15分钟。晾半干，迅速用保鲜膜包裹，放入暗夹。在暗室里装入X-光片，把暗夹放在-80℃冰箱中放射自显影4-7天，冲洗X-光片。
实施例5含有钙调素结合型蛋白激酶基因转基因水稻与野生水稻的性状对比根据图5所示，经筛选的抗性植株的水稻和同时种植的对照植株均种植于武汉大学室外温室，于正常季节栽培，同样的管理条件，进行开花时间的严格记录。开花时间与千粒重等数值均为株系平均值(见下表)。结果显示植株开花时间生育期都有相应延迟，表现出晚开花性状，开花时间比野生型对照大约推迟了15-20天，相应的生育期也延长。同时千粒重有约15％的增加，只种一季水稻就有可能提高农作物单位面积产量，每亩增产10-15％。
生育期(天)穗长(cm)千粒重(g)理论产量(kg/亩)比对照晚开花(天)比对照增产(％)转基因中花11 143.8 17.525.59 624.91 17.5113.7转基因台北309 141.6 17.125.95 678.36 15.3115.3对照(野生) 126.3 16.822.51 553.16
SEQUENCE LISTING<110>武汉大学<120>钙调素结合型蛋白激酶基因的制备方法及在水稻中的应用<130>钙调素结合型蛋白激酶基因的制备方法及在水稻中的应用<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2800<212>DNA<213>水稻<400>1cctcctcctc ctcctctctc tctccttcct ccgattcaca cacacacaca ctcctcgccg60tcttgtttct tcttcgtctg ggtggttgat ccatccatcc agagattgcc tgtgcgagga120agggagcggg cgagtggcgg atttgttttt ggtttgtttt tgagtttgtt tttattggtg180gtatcctctc ctcctcctgt gcgaggagca gctggtggat tgttcgttcc agctccgttt240cttgtcttga tttggaatcc gggacatttt tccgcgcccc gtttctggat ttccggtacc300cccccttcct tggtggaagt gggaagggga gggggaagga ttttttggtg gggaattcga360gggggcgagg tgatgaactc ttgcctcttt gaccagcctt gattttcctg gtgattttgc420ttggaatttc tcggattttg tggggggttc tttgatccgg gctccatggg tctctgccat480ggcaagtcgg cggcggtgct ggagccaacg gtggaggagg aggaggaggg ggcgacgcgc540gtagccgagg ccgcggcggc gccggcgaag ccagcgtcgc ctgcgccttc ggcggcggcg600gcggcggcga agcccgggac gccgaagcag cacaagttcc cgttctacct gccgagcccg660ctcccggcgt cgagctacaa gggctcgccg gcgaactcga gcgtggcgtc gacgcccgcg720cgcggcgggt tcaagcggcc gttcccgccg ccgtcgccgg cgaagcacat ccgcgcgctc780ctggcgcggc gccacggctc ggtgaagccg aacgaggcgt ccatcccgga gtccggcgag840cccggcgtgg cgctggacaa gggcttcggc ttctccaggc acttcgccgc caagtacgag900ctcggccgcg aggttggccg cggccacttc ggctacacct gcgccgccac ctgcaagaag960ggcgagctca agggcgacga cgtcgcggtc aaggtcatcc ccaaggccaa gatgactact 1020gctattgcca ttgaagatgt caggagagaa gtcagaatat tgagttcttt ggcagggcac 1080agcaacttag tgcagtttta tgatgcttat gaggatgaag aaaatgtata tatagttatg 1140gagttatgca aaggaggtga actgctggac aggattttgg ctagaggtgg aaaatattct 1200gaggaagatg caaaggttgt tatgcgccaa atcctaagtg ttgcttcatt ttgtcatctt 1260cagggtgttg ttcatcggga tctgaaacca gagaatttcc ttttctcgtc aaaggatgag 1320aactctgcca tgaaggtcat agacttcggt ttgtctgact ttgtaaagcc agatgagagg 1380cttaatgaca ttgtcggaag tgcatattat gttgctcctg aagtgctcca tcgatcttat 1440ggcactgagg cagatatgtg gagcattgga gtaatagtgt atattttgct ttgtggcagc 1500cgtcctttct gggcacgtac tgagtcagga atattccgag ctgtgctgaa agcagaccct 1560agttttgagg aagccccatg gccaaccctc tctgctgaag caaaagactt tgtaaggagg 1620ctgctcaata aagattaccg caagaggatg actgctgcac aagccctctg tcatccatgg 1680attcgtggta ctgaagaagt gaagcttcct ttggacatga taatttatag gcttatgagg 1740gcttacataa gttcatcttc tttacggaga gctgcattga gggcccttgc caagacattg 1800acaacagatc aaatctatta cctaagagaa cagtttgaat tgataggccc aaacaagagc 1860gatcttatta ctttgcaaaa tttgaagacg gccttgatga agaactccac aaatgcaatg 1920aaggattcta gggtggttga ctttgttaac acaatatcca atattcagta cagaaagttg 1980gattttgagg agttttctgc tgctgccatc agtgtttacc agatggaagg tttggaaacc 2040tgggaacaac atgcccggca agcgtacgag ttctttgata aggagggtaa ccgaccaatt 2100gtgatcgacg agctcgcatc gggacttgga ttgggtcctt cggttcccct acatgttgtt 2160ctccaagatt ggatcagaca tcctgatgga aaactcagct tccttgggtt catgaaacta 2220ttgcatggag tttcttcgcg taccatccca aaaacctgag ataataactt attttcttac 2280atcaaccaac aaaagtgtga tgactaaact aatctctggc tgtctggaga agcggcatgg 2340aaccagtaca aagattaaca aagctgtcct agtgtaacaa gtgaaaaagc tctcctgtca 2400ggcccgcgaa tttcgccttc tctttaccag atgattgatg ttgcgtttga tatcaggttt 2460gtttagaggt ggaatgtaca gatgagttta ggaaacagca aaaatgaggt gctaagaagt 2520gaaacatggt ttaatttcga ttggtgtaac tgtgtgcgtt tgatcttcgc cgatctgtga 2580atgtcgtgat tggactgaaa ttgagaagtg aggtggtatc agtaccatat tcgtagatat 2640ttcttgagtt tttttttctt attgaaattt actcgtgttt atttgcaata gtttggctca 2700ttggctgtac atcgatgtga tgaaaacgat atcaattttt ttttgcataa acaatatcag 2760tatggttagg aattttttat aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2800


本发明公开了一种钙调素结合型蛋白激酶基因的制备方法和它在水稻中的应用。其步骤为A.用BamHI酶切已克隆到的钙调素结合蛋白激酶基因；B.将A步获得的基因连接到中间载体pAHC17上，形成pAHC17－R19(+)；C.用HindIII，EcoRI双酶切pAHC17－R19(+)，并连接到同样双酶切的表达载体pCAMBIA1300或pCAMBIA1301上，使得钙调素结合蛋白激酶基因置于泛素启动子和NOS尾巴之间，形成可转化或表达的载体；D.将制备的载体转入农杆菌EHA105，再导入成熟胚诱导的水稻愈伤组织中；E.筛选阳性植株。本发明的钙调素结合蛋白激酶基因在水稻中的应用。该转基因植物表现晚开花状，生长期延长，千粒重增加，可以提高单位面积产量。