一种牛骨骼肌特异性表达基因mstn启动子的制作方法[0002]真核生物基因表达的时间和水平严格按照发育顺序进行。某些特定基因表达的调节由转录因子特异性结合于调控区相关元件，成为转录起始的关键步骤，并最终导致基因的时间和空间表达。编码组织特异蛋白的基因严格按照组织特异性和发育阶段性表达，为基因表达调控机制提供了很好的研究|吴式。在特异闻效表达的转基因动物中，获得能广泛应用的特异性启动子非常重要。但启动子的特异性由多个元件控制，在不同种类和不同发育时期起关键作用的调控元件并不相同，调控元件和反式作用因子之间的相互作用也十分复杂。因此要使外源基因能够在动物组织中特异高效地表达，必须构建一个可以特异高效表达的动物表达载体，其中启动子的选择是重要的条件之一。[0003]肌生长抑制素(Myostatin，MSTN),又称为⑶F8，是转化生长因子& (transforming growth factor & , TGF- & )超家族的一员，是控制骨骼肌生成的关键调节因子，与肌肉生长和肉质有着密切的关系，利用其基因调控区的相关元件构建骨骼肌特异性表达载体是一种有效的方法。但是上述的研究均还处在起步阶段，对于转基因牛的培育和肉品品质的提高均没有起到较好的促进作用。
[0004]本发明的目的是:提供一种牛骨骼肌特异性表达基因MSTN启动子，该启动子在牛骨骼肌中具有明显启动特性，在牛骨骼肌中特异性地启动下游基因的表达，满足目的基因在骨骼肌中特异性表达的要求，为通过转基因技术来提高牛肉的品质提供了一种重要的调控元件。`[0005]本发明是这样实现的:牛骨骼肌特异性表达基因MSTN启动子，其核心启动子(-129至472)包含如SEQ ID N0.1所示的DNA序列(PCR扩增时，设计的上游引物:GACTTGTGACAGACAGGGT,下游引物:GGCGTGGTAGTCATCGTC)，其长度为 601bp。[0006]所采用的重组核酸序列，其中含有上述的启动子或其片段，这样就可以使位于启动子下游的目的基因在骨骼肌中特异性表达，作为分析、开发、改造骨骼肌特性的研究模型。还可以利用已有的分子生物学操作技术获得包含目的基因的重组核酸，通过显微注射等基因导入技术获得转基因胚胎，用于建立转基因动物。重组核酸序列中的目的基因，含有下列的至少一种功能基因，主要包括提高肌肉品质基因，加快生长速度基因，抗病基因，提高饲料报酬的基因以及生产特定药物的基因，这样就可以在获得骨骼肌特异性启动特性之外，提高该重组核酸序列的性能，为转基因牛的培养提供更多的功能性方向，增加其附加产值。[0007]本发明主要通过报告基因分析确定该启动子的启动特征。进行了如下实验:
1、牛MSTN启动子全长的克隆及序列分析用软件分析牛MSTN启动子区域，设定为Pl片段，用在线软件设计特异性引物，由生物工程有限公司合成；从牛背部最长肌组织提取组织DNA ;采用基因组PCR步移技术扩增出MSTN的启动子。琼脂糖凝胶电泳检测扩增引物；对应物进行纯化；送生物公司进行序列分析。
[0008]2、牛MSTN启动子全长报告质粒的构建及鉴定
将提纯后的目的基因和PGL3 — Basic进行双酶切，构建含有MSTN启动子的重组质粒PGL3 一 MSTN-PI,并对其进行筛选和鉴定。
[0009]3、双荧光素酶报告基因检测报告质粒MSTN启动子的活性
将MSTN启动子报告质粒和PRL-TK共转染到牛前脂肪细胞中，24h后裂解细胞，并收集裂解液进行双荧光素酶检测。
[0010]4、牛MSTN核心启动子区的定位
(I)MSTN-Pl的5’端截短载体的构建以及MSTN核心启动子区的初步鉴定设计特异性引物对MSTN-Pl 5’端进行截短，并构建重组报告质粒以检测其启动活性。截短片段分别命名为P2、P3。构建重组报告质粒PGL3-MSTN-P2、PGL3-MSTN-P3,并进行筛选，鉴定。然后对其进行双荧光素酶活性检测。
[0011](2)用脂质体转染试剂盒将启动子-荧光素酶报道质粒(pGL3_启动子)和内参质粒PRL-TK共转染到细胞中，并检测荧光素酶报告基因的表达活性。
[0012](3)将缺失突变载体按照脂质体转染试剂盒说明进行转染，细胞接种于96孔板培养后，测定荧光素酶表达活性，并观察不同缺失突变体对荧光素酶表达活性的影响。以上实验独立重复3次。
[0013](4)通过对缺失载体启动子活性进行统计分析后，初步定位核心启动子的位置。
[0014]5、对核心启动子测序并进行功能分析
将pGL3-启动子与PRL-TK共转染到C2C12细胞系、小鼠脂肪细胞及原代小鼠乳腺细胞等10种细胞中，进行表达特异性验证。
[0015]通过PCR或者片段捕获等技术获得骨骼肌中特异性表达的MSTN的启动子，长度为601bp，将该片段插入PGL3-basic载体，得到启动子报告基因分析载体。质粒去内毒素后，转染C2C12小鼠成肌细胞系，同时转染牛原代肾上皮细胞等多种细胞为对照，转染24h后更换含牛血清的诱导培养基至成肌细胞，诱导细胞分化融合，48h后用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况，分析启动子特性。
[0016]由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明根据研究发现牛MSTN基因启动子具有骨骼肌特异性启动特性，并利用这一特性设计了一种骨骼肌特异性表达启动子载体，该启动子可以在转基因牛的培育中应用。该启动子载体具有骨骼肌特异性启动特性，而在除骨骼肌外的多种细胞中均无启动活性，可见该启动子在骨髂肌中特异性地启动下游基因的表达，能够满足目的基因在骨骼肌中特异性表达的要求，为转基因载体提供了一种重要的元件。



[0017]附图1为MSTN基因核心启动子的PCR扩增产物电泳图谱；
其中M为表示DNA marker (MarkerVII) ；1表示PCR扩增产物；附图2为确认核心启动子的实验框图。
[0018]本发明的实施例:针对牛骨骼肌特异性表达基因MSTN启动子，设计上游引物:CTGCTCCCAGACCTTACC,下游引物:CTGGCGTGGTAGTCATCG，通过PCR扩增，克隆获得核心启动子(-129至472)包含如SEQ ID N0.1所示的DNA序列，其长度为60Ibp。
[0019]核心启动子的序列为:GACTTGTGACAGACAGGGTT TTAACCTCTG ACAGCGAGATTCATTGTGGA GCAAGAGCCA ATCACAGATC CCGACGACAC TTGTCTCATC AAAGTTGGAA TATAAAAAGCCACTTGGAAT ACAGTATAAA AGATTCACTG GTGTGGCAAG TTGTCTCTCA GACTGGGCAG GCATTAACGTTTGGCTTGGC GTTACTCAAA AGCAAAAGAA AAGTAAAAGG AAGAAGTAAG AACAAGGGAA AAGATTGTATTGATTTTAAA ACCATGCAAA AACTGCAAAT CTCTGTTTAT ATTTACCTAT TTATGCTGAT TGTTGCTGGCCCAGTGGATC TGAATGAGAA CAGCGAGCAG AAGGAAAATG TGGAAAAAGA GGGGCTGTGT AATGCATGTTTGCGGAGGGA AAACACTACA TCCTCAAGAC TAGAAGCCAT AAAAATCCAA ATCCTCAGTA AACTTCGCCTGGAAACAGCT CCTAACATCA GCAAAGATGC TATCAGACAA CTTTTGCCCA AGGCTCCTCC ACTCCTGGAACTGATTGATC AGTTCGATGT CCAGAGAGAT GCCGGCAGTG ACGGCTCCTT GGAAGACGAT GACTACCACGC