专利名称：一种油菜种皮中不同来源ans基因表达的快速检测方法及运用的制作方法油菜是世界上重要的油料作物。油菜育种的主要目标之一是在双低的基础上选育黄籽油菜品种。在相同的遗传背景下，黄籽油菜与黑籽油菜相比具有种皮薄、含油量高、木质素含量低等优点。无论是黄籽油菜还是黑籽油菜种子的胚都是黄色的，黄籽的种皮是透明的，黑籽的种皮为黑色，黄籽的颜色是其胚颜色的体现，油菜种子表现出来的颜色差别是由种皮决定的。研究表明油菜中种皮颜色的深浅和透明度取决于花色素合成酶(ANS)活性高低， 而花色素合成酶活性的强弱直接由ANS基因的表达量控制。现有检测ANS基因的表达的方法为特异引物RT-PCR和Northern分析方法，但这些方法不能区分表达的ANS基因是来自A 染色体组、B染色体组还是C染色体组，其中白菜(Brassica campestris, AA, 2n=20)为A 染色体组；黑芥(Brassica nigra, BB, 2n=16)为 B 染色体组；甘蓝(Brassica oleracea, CC, 2n=18)为C染色体组。由于以往的油菜3个基本种(白菜、黑芥、甘蓝)和3个异源四倍体(芥菜型油菜，甘蓝型油菜，埃塞俄比亚芥)的ANS基因的序列信息不完善，使RT-PCR 和Northern分析方法不能区分表达的ANS基因是来自A染色体组、B染色体组还是来自C 染色体组，无法在育种过程中用于大规模使用。为了进一步研究油菜种皮颜色形成的分子调控机理，加快黄籽油菜品种选育的进程，非常需要有一种能有效区分表达的ANS基因是来自A染色体组、B染色体组还是C染色体组的检测方法。
本发明的目的是提供一种能快速、简便、有效区分油菜种皮中表达的ANS基因来源的检测方法。本发明的技术方案，包括如下步骤(1)根据油菜三个基本种(白菜、甘蓝、黑芥)和三个异源四倍体(芥菜型油菜、甘蓝型油菜、埃塞俄比亚芥)ANS基因的序列比对分析，寻找核苷酸多态性位点；白菜(Brassica campestris, AA, 2n=20)为 A 染色体组；黑芥(Brassica nigra，BB, 2n=16)为 B 染色体组；甘蓝(Brassica oleraceEi，CC, 2n=18)为 C 染色体组；(2)通过比较A、B、C染色体组中ANS基因的多态性，利用引物设计软件分别设计A、B、 C染色体组的特异引物；通过PCR条件的优化，确定特异扩增A、B、C染色体组ANS基因的引物；所述特异扩增A染色体组ANS基因的引物为 上游引物 5，-TTAGCGAAAAGCGGGATCAGC-3，，下游引物5’ -CCACGGGCAAACCGAAGAA-3’，该引物对只能使来自A染色体组的ANS基因有扩增产物，PCR产物大小为；所述特异扩增B染色体组ANS基因的引物为 上游引物 5，-TTAGCAAAGAGCGGAATCGAA-3，，
下游引物5’ -CCACGGGCAAACCGAAGAA-3’，该引物对只能使来自B染色体组的ANS基因有扩增产物，PCR产物大小为
所述特异扩增C染色体组ANS基因的引物为 上游引物 5，-TAGCAATGGGAAGTTTAAGAGTA-3，，
下游引物5’ -GTGGTTCATAGAGCATATCTCG-3’，该引物对只能使来自C染色体组的ANS基因有扩增产物，PCR产物大小为452bp ；
(3)从不同类型油菜授粉后10-30天的种皮中分离总RNA，分别反转录后，进行特异引物PCR扩增；
(4)PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭为染料，电泳后用凝胶分析系统进行分析，根据引物特异性与电泳带的有无，确定表达的ANS基因是来自哪个染色体组；
如果来自A染色体组ANS基因的特异引物扩增，电泳分离的扩增片段大小约为^K)bp， 说明表达的ANS基因是来自A染色体组；
如果来自B染色体组ANS基因的特异引物扩增，电泳分离的扩增片段大小约为^K)bp， 说明表达的ANS基因是来自B染色体组；
如果来自C染色体组ANS基因的特异引物扩增，电泳分离的扩增片段大小约为450bp， 说明表达的ANS基因是来自C染色体组。所述的油菜种皮中不同来源ANS基因表达的快速检测方法在基因定位和分子标记辅助育种的运用，利用所述多态性位点作为一种分子标记，可用于基因定位和分子标记辅助育种。本发明的优势利多态性位点的特异引物进行PCR，能够简便、快速地检测表达的 ANS基因是来自A染色体组、B染色体组还是来自C染色体组，解决了当前对油菜种皮颜色形成调控研究和油菜黄籽品种选育过程中的一个ANS基因来源问题。下面结合附图和实例对本发明作进一步描述，但不意味限制本发明的范围。说明书附图


图1为A染色体组的ANS基因特异引物在6个不同类型的材料中的PCR扩增图； 图2为B染色体组的ANS基因特异引物在6个不同类型的材料中的PCR扩增图； 图3为C染色体组的ANS基因特异引物在6个不同类型的材料中的PCR扩增图； 图中A:白菜；B:黑芥；C:甘蓝；AB:芥菜型油菜；AC:甘蓝型油菜；BC:埃塞俄比亚芥。

(1)根据己发表的拟南芥ANS基因和油菜ANS基因序列(Abrahams S, Lee Ε, Walker A R, Tanner G J, Larkin P J, Ashton AR. The Arabidopsis TDS4 gene encodes leucoanthocyanidin dioxygenase (LDOX) and is essential for proanthocyanidin synthesis and vacuole development. Plant J, 2003, 35:624-636 ；Mingli Yan,Xianjun Liu, Chunyun Guan, Xinbo Chen, Zhongsong Liu. Cloning and expression analysis of anthocyanidin synthase gene homolog from Brassica juncea, Mol Breeding, 2011，28:313 - 322)，通过生物信息学分析，设计一对扩增ANS基因全长cDNA的简并引物，以黑芥(BB)、甘蓝(CC)、白菜(AA)、埃塞俄比亚芥(BBCC)和芥菜型油菜(AABB) 的种皮cDNA为模板进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收，将回收片段连接到PMD18-T载体上，然后将载体转到感受态的大肠杆菌中，再将转化后的菌液涂到含氨苄青霉素的筛选培养基上筛选出抗性克隆，对抗性克隆进行菌落PCR检测，随机挑选10 个阳性克隆进行测序。把所测得的DNA序列进行比对分析。(2)利用DNAMAN软件，将所测得的黑芥(BB)、甘蓝(CC)、白菜(AA)、埃塞俄比亚芥 (BBCC)和芥菜型油菜(AABB)的ANS基因的序列连同已发表(Feng Cheng, Shengyi Liu, Jian ffu, Lu Fang , Silong Sun , Bo Liu, Pingxia Li, Wei Hua, Xiaowu Wang . BRAD, the genetics and genomics database for Brassica plants.BMC Plant Biology , 2011, 11:136)的白菜(AA)、甘蓝(CC)、芥菜型油菜(AABB)和甘蓝型油菜(AACC)的ANS基因的 cDNA序列进行比对分析，寻找核苷酸多态性位点。通过比较A、B、C染色体组中ANS基因的多态性，白菜(Brassica campestris, AA, &ι=20)为A染色体组；黑芥(Brassica nigra，BB, 2n=16)为B染色体组；甘蓝(Brassica oleracea，CC, 2n=18)为C染色体组。利用引物设计软件I^imer Priemer 5. O分别设计A、B、C染色体组的特异引物。通过PCR条件的优化，确定特异扩增A、B、C染色体组ANS基因的引物，特异扩增来自A染色体组ANS基因的引物为上游引物 5，-TTAGCGAAAAGCGGGATCAGC-3，，下游引物 5，-CCACGGGCAAACCGAAGAA-3，， 该引物对只能使来自A染色体组的ANS基因有扩增产物，PCR产物大小为特异扩增来自B染色体组ANS基因的引物为上游引物5’ -TTAGCAAAGAGCGGAATCGAA-3’，下游引物5’ -CCACGGGCAAACCGAAGAA-3’，该引物对只能使来自B染色体组的ANS基因有扩增产物PCR产物大小为特异扩增来自C染色体组ANS基因的引物为上游引物 5，-TAGCAATGGGAAGTTTAAGAGTA-3，，下游引物 5，-GTGGTTCATAGAGCATATCTCG-3，，该引物对只能使来自C染色体组的ANS基因有扩增产物，PCR产物大小为452bp。(3)利用总RNA提取试剂盒分别提取6个黑籽材料(白菜，染色体组AA ；黑芥，染色体组BB ；甘蓝，染色体组CC ；芥菜型油菜，染色体组AABB ；甘蓝型油菜，染色体组AACC ；埃塞俄比亚芥，染色体组BBCC)授粉后25天种皮的总RNA。(4)以总RNA为模板，根据逆转录试剂盒(Τ0Υ0Β0，Lot: 118200)的说明进行操作， 通过逆转录酶合成cDNA。(5 )以cDNA为模板，以来自A染色体组的ANS基因的特异引物(上游弓丨物 5，-TTAGCGAAAAGCGGGATCAGC-3，，下游引物 5，-CCACGGGCAAACCGAAGAA-3，)进行 PCR 扩增。 PCR反应体系总体积为 20 μ L,含 IOX PCR buffer 2.0 μ LUO mmol L 1 dNTP mix各 0.3 μ LUO mmol L 1 正向引物 1 yL、10 mmol L 1 反向引物 1 yL、l U Taq DNA 聚合酶、2. 5 mmol L 1 MgCl2 2 μ LU μ L反转录产物、无菌去离子水(补足到20 μ L)。 PCR扩增条件为94°C预变性3 min;94°C变性25 s，60°C退火30 s，72°C延伸20 s，循环 30次；最后72°C延长6 min。(6)扩增产物通过1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色。然后通过凝胶分析系统进行拍照和分析，结果如图1所示。在白菜、芥菜型油菜和甘蓝型油菜的种皮cDNA中扩增得到大小约为290bp的片段，说明这3个材料中来自A染色体组的ANS基因有表达， 而在黑芥、甘蓝和埃塞俄比亚芥的种皮中未有扩增片段，由于这3个材料不含A染色体组， 所以没有A染色体组来源的ANS基因表达。实施例2
(1)以cDNA为模板，以来自B染色体组的ANS基因的特异引物(上游引物 5，-TTAGCAAAGAGCGGAATCGAA-3，，下游引物 5，-CCACGGGCAAACCGAAGAA-3，)进行 PCR 扩增。 PCR反应体系总体积为 20 μ L,含 IOX PCR buffer 2.0 μ LUO mmol L 1 dNTP mix各 0.3 μ LUO mmol L 1 正向引物 1 yL、10 mmol L 1 反向引物 1 yL、l U Taq DNA 聚合酶、2. 5 mmol L 1 MgCl2 2 μ LU μ L反转录产物、无菌去离子水(补足到20 μ L)。 PCR扩增条件为94°C预变性3 min;94°C变性25 s，60°C退火30 s，72°C延伸20 s，循环 30次；最后72°C延长6 min。(2)扩增产物通过1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色。然后通过凝胶分析系统进行拍照和分析，结果如图2所示。在黑芥、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥的种皮cDNA 中扩增得到大小约为290bp的片段，说明这3个材料中来自B染色体组的ANS基因有表达， 而在白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的种皮中未有扩增片段，由于这3个材料不含B染色体组，所以没有B染色体组来源的ANS基因表达。(3)其它同实施例1。实施例3
(1)以cDNA为模板，以来自C染色体组的ANS基因的特异引物(上游引物 5，-TAGCAATGGGAAGTTTAAGAGTA-3，，下游引物 5，-GTGGTTCATAGAGCATATCTCG-3，)进行 PCR 扩增。PCR 反应体系总体积为 20 μ L,含 IOX PCR buffer 2.0 μ LUO mmol L 1 dNTP mix 各 0. 3 μ L、10 mmol L 1 正向引物 1 μ L、10 mmol L 1 反向引物 1 μ L、1 U Taq DNA聚合酶、2. 5 mmol L 1 MgCl2 2 μ LU μ L反转录产物、无菌去离子水(补足到20 yL)。PCR扩增条件为94°C预变性3 min;94°C变性25 s，57°C退火30 s，72°C延伸30 s，循环30次；最后72°C延长6 min。(2)扩增产物通过1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色。然后通过凝胶分析系统进行拍照和分析，结果如图3所示。在甘蓝、甘蓝型油菜和埃塞俄比亚芥的种皮cDNA 中扩增得到大小约为450bp的片段，说明这3个材料中来自C染色体组的ANS基因有表达， 而在白菜、黑芥和芥菜型油菜的种皮中未有扩增片段，由于这3个材料不含C染色体组，所以没有C染色体组来源的ANS基因表达。(3)其它同实施例1。


一种油菜种皮中不同来源ANS基因表达的快速检测方法。本发明通过克隆和分析油菜3个基本种(白菜染色体组为AA,2n=20；甘蓝染色体组为CC,2n=18；黑芥染色体组为BB,2n=16)和3个异源四倍体(芥菜型油菜染色体组为AABB,2n=36；甘蓝型油菜染色体组为AACC,2n=38；埃塞俄比亚芥染色体组为BBCC,2n=34)ANS基因的序列，根据A、B和C染色体组来源的ANS基因的核苷酸多态性位点，设计能够区分A、B和C染色体组来源的ANS基因的特异的引物，结合RT-PCR，对不同染色体组型油菜的种皮中表达的ANS基因类型进行鉴定。这一方法对进一步研究油菜籽种皮颜色形成的分子调控机理，加快黄籽油菜品种选育的进程有积极意义，同时也为油菜ANS基因的来源检测提供了新的方法。