专利名称：一种发酵培养基及用该培养基发酵生产丁醇的方法丁醇是一种重要的有机溶剂和化工原料，广泛应用于化工、塑料、有机合成、油漆等行业。丁醇还是一种极具潜力的新型生物燃料，其具有能量密度高、腐蚀性小、蒸汽压力低、亲水性弱等许多优于生物乙醇之处而受到世界各国的广泛关注。生物丁醇一般通过丙酮-丁醇发酵制备，作为一项传统的工业发酵，其生产规模曾经仅次于乙醇发酵。20世纪中期，由于生产成本等原因，丁醇发酵工艺逐渐衰退(Qureshi N, Blaschek H P. Recent advances in ABE fermentation: hyper—butanol producing Clostridium beijerinckii BAlOL J Ind Microbiol Biotechnol 27:287-291.)。日前， 随着石油危机等问题的日益突显，丁醇的生物发酵工业受到越来越多的关注。甘蔗渣酸解糖液中含有酸类、醛类、木质素衍生物等副产物，甘蔗渣除少量用于造纸外，绝大部分被焚烧或废弃(李春光，周伟铎等.甘蔗渣纤维素提取及木质素与半纤维素脱除工艺探讨[J].中国农学通报，2011，4:316-320)。为有效提高丁醇发酵的经济竞争性， 利用价格低廉的纤维原料和农林废弃物等作为底物制备燃料丁醇成为近年来研究的热点问题之一。本申请人之前申请的专利《一株高抗逆性贝氏梭菌及其应用》CN102174433A中涉及一株能利用未脱毒木质纤维酸解糖液的贝氏梭菌^Zo1Sirii/i beijerinckii IB4,已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC N0:M2010310，保藏日期2010年 11月23日，在该专利中所用的P2培养基成分复杂，含有8种组分，且丁醇产量相对较低， NCIMB8052 和 IB4 丁醇产量分别为 1. 6g/L 和 6. 8g/L。发明内容技术问题本发明所要解决的技术问题是提供一种廉价高产丁醇的发酵培养基及利用该培养基发酵产丁醇的方法。技术方案一种生产丁醇的发酵培养基，每升该培养基中含有玉米芯稀酸水解糖液总还原糖27. 5^37g,碳酸氢铵1. Γ2. 2g,硫酸亚铁0. 2^0. 4g，碳酸钙2. 5^3. 5g，玉米浆 0. 8^1. 2g，其余为水，pH 6. 6^6. 8。其中，所述的玉米芯稀酸水解糖液是将玉米芯与l%1%(wt)的H2SO4按质量比 1:4 1:6混合，在121 °C 125°C的高温下水解12(Tl50min，冷却后抽滤，调节pH5. 9 6. 1，然后抽滤得到水解糖液。一种用上述发酵培养基发酵生产丁醇的方法，包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵三步骤，其中所述厌氧发酵步骤中，5L发酵罐中发酵培养基体积为2 4L，接种量为8 10%(v/v)，温度为35 40°C，发酵罐在接种后通入纯队，以保持发酵体系的厌氧环境，10 20min后停止通气，搅拌速度在100 300 rpm，发酵时间在60 84 h。其中，所述菌种为贝氏梭菌Clostridium beijerinckii NCIMB8052或者其诱变菌瓶Clostridium beijerinckii IB4, ^M^M^Clostridium beijerinckii IB4 己{呆藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC N0:M2010310。其中，所述菌种活化步骤中，将50mL的血清瓶中加入培养基20 30mL，所述的培养基为pH 6. 0 7. 0的含有淀粉或者糖类等能提供碳源、氮源以及无机盐的液体培养基，通入纯队，115 121°C灭菌15 30min，冷却后接入ImL甘油管中冻存的菌种，静置于恒温培养箱中，培养温度为30 40°C，活化时间为12 14h，得到活化的种子液。其中，所述种子培养步骤中，培养时将500mL血清瓶中加入培养基100 400mL，所述的培养基为pH 6. 0 7. 0的含有淀粉或者糖类等能提供碳源、氮源以及无机盐的液体培养基，通入纯队，115 121°C灭菌15 30min，冷却后接入活化的种子液，培养温度为30 40°C，在恒温培养箱中培养，培养时间为8 12h，用于发酵罐接种。有益效果本发明发酵培养基中所用玉米芯稀酸水解液是将玉米芯与稀直接高温水解过滤而得，水解液中含有酚类抑制剂2. 8^3. lg/L，不经脱毒处理工艺直接用于发酵培养基，添加碳酸氢铵，硫酸亚铁，碳酸钙，玉米浆，即可得到适于发酵的发酵培养基，配方简单，廉价易得，操作简便，培养基成本低廉，以贝氏梭菌C/^irii/i beijerinckiiNCIMB8052在本发明的培养基上发酵生产丁醇，得到的丁醇含量达到5. 8g/L，以诱变菌株Clostridium beijerinckii IB4发酵可达到9. 5g/L。本发明降低了丁醇的发酵成本，提高了碳源的利用率。该方法的最大特点是可以直接利用木质纤维素酸解糖液进行丁醇发酵。

将购得的玉米芯120 8与^1(Wt)的!^04600 mL混合，在125°C的高温下水解150min，冷却后抽滤洗涤至至相同体积，然后在80°C的水浴锅中加入Ca (OH)2中和至pH 6.0，然后抽滤洗涤至体积为600mL，得到的滤液即为玉米芯水解糖液(总还原糖为55. 2g/L)。将水解糖液稀释至还原糖浓度27. 5 g/L、33 g/L、37 g/L分别和不同浓度的碳酸氢铵、硫酸亚铁、碳酸钙，玉米浆培养基混合厌氧发酵，得到丁醇产量如下述实施例所示。实施例2
菌种贝氏梭菌 CZo1SiriiZi腫 beijerinckii NCIMB8052
种子培养基酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，NaCl 2g/L，MgSO4 3g/L, KH2PO4 lg/L, K2HPO4 lg/L, FeSO4 · 7H20 0. lg/L, pH 6. 0 ；
发酵培养基玉米芯稀酸水解糖液(总还原糖27. 5 g/L)，碳酸氢铵1.9 g/L，硫酸亚铁0.25 g/L，碳酸钙3. 1 g/L，玉米浆1 g/L，其余为水。pH 6. 6 6. 8。5L发酵罐发酵时培养基装液量为3L。将冻存的甘油管中的菌种接入50mL血清瓶中30mL的种子培养基中，通入队，在恒温培养箱中培养，温度为35°C，活化培养。培养1 后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有300mL种子培养基的500mL血清瓶中，扩大培养，1 后用于上述发酵培养基接种(5L发酵罐)，接种量为10% (v/v)，搅拌转速在120rpm，35°C发酵培养。接种后通入队，通气量为0. 25vvm，15min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。发酵时间为60h。采用FULI 9710气相色谱仪测定溶剂含量，FID检测器，色谱柱石英毛细管柱，固定相SE-30，规格30 m χ 0.32 mm χ 1 μ m，类型交联，最高使用温度。柱箱温度900C，检测器温度180°C，进样器180°C，载气为队，流速30 mL/min,以异丁醇为内标物，进样量0.4 UL0测得本实施例中的丁醇含量为5.75g/L。实施例3
菌种贝氏梭菌 CZo1SiriiZi腫 beijerinckii IB4
种子培养基酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，NaCl 2g/L，MgSO4 3g/L, KH2PO4 lg/L, K2HPO4 lg/L, FeSO4 · 7H20 0. lg/L, pH 6. 0 ；
发酵培养基玉米芯稀酸水解糖液(总还原糖27. 5 g/L)，碳酸氢铵1.8 g/L，硫酸亚铁0. 30 g/L，碳酸钙3.0 g/L，玉米浆1 g/L，其余为水。pH 6. 6 6. 8。5L发酵罐发酵时培养基装液量为3L。将冻存的甘油管中的菌种接入50mL血清瓶中30mL的种子培养基中，通入队，在恒温培养箱中培养，温度为35°C，活化培养。培养1 后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有300mL种子培养基的500mL血清瓶中，扩大培养，1 后用于上述发酵培养基接种(5L发酵罐)，接种量为10% (v/v)，搅拌转速在120rpm，35°C发酵培养。接种后通入队，通气量为0. 25vvm，15min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。发酵时间为60h。采用FULI 9710气相色谱仪测定溶剂含量，FID检测器，色谱柱石英毛细管柱，固定相SE-30，规格30 m χ 0.32 mm χ 1 μ m，类型交联，最高使用温度。柱箱温度900C，检测器温度180°C，进样器180°C，载气为队，流速30 mL/min,以异丁醇为内标物，进样量0.4 UL0测得本实施例中的丁醇含量为7.48g/L。实施例4
菌种贝氏梭菌 CZo1SiriiZi腫 beijerinckii IB4
种子培养基酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，NaCl 2g/L，MgSO4 3g/L, KH2PO4 lg/L, K2HPO4 lg/L, FeSO4 · 7H20 0. lg/L, pH 6. 0 ；
发酵培养基玉米芯稀酸水解糖液(总还原糖33 g/L)，碳酸氢铵1.4 g/L，硫酸亚铁0.35 g/L，碳酸钙2. 5 g/L，玉米浆1 g/L，其余为水。pH 6. 6 6. 8。5L发酵罐发酵时培养基装液量为3L。将冻存的甘油管中的菌种接入50mL血清瓶中30mL的种子培养基中，通入队，在恒温培养箱中培养，温度为35°C，活化培养。培养1 后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有300mL种子培养基的500mL血清瓶中，扩大培养，1 后用于上述发酵培养基接种(5L发酵罐)，接种量为10% (v/v)，搅拌转速在120rpm，35°C发酵培养。接种后通入队，通气量为0. 25vvm，15min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。发酵时间为72h。采用FULI 9710气相色谱仪测定溶剂含量，FID检测器，色谱柱石英毛细管柱，固定相SE-30，规格30 m χ 0.32 mm χ 1 μ m，类型交联，最高使用温度。柱箱温度900C，检测器温度180°C，进样器180°C，载气为队，流速30 mL/min,以异丁醇为内标物，进样量0.4 UL0测得本实施例中的丁醇含量为7.88g/L。实施例5菌种贝氏梭菌 CZo1SiriiZi腫 beijerinckii IB4
种子培养基酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，NaCl 2g/L，MgSO4 3g/L, KH2PO4 lg/L, K2HPO4 lg/L, FeSO4 · 7H20 0. lg/L, pH 6. O ；
发酵培养基玉米芯稀酸水解糖液(总还原糖33 8/1)，碳酸氢铵2.2 g/L，硫酸亚铁0.25 g/L，碳酸钙3. 5 g/L，玉米浆1 g/L，其余为水。pH 6. 6 6. 8。5L发酵罐发酵时培养基装液量为3L。将冻存的甘油管中的菌种接入50mL血清瓶中30mL的种子培养基中，通入队，在恒温培养箱中培养，温度为35°C，活化培养。培养1 后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有300mL种子培养基的500mL血清瓶中，扩大培养，1 后用于上述发酵培养基接种(5L发酵罐)，接种量为10% (v/v)，搅拌转速在120rpm，35°C发酵培养。接种后通入队，通气量为0. 25vvm，15min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。发酵时间为72h。采用FULI 9710气相色谱仪测定溶剂含量，FID检测器，色谱柱石英毛细管柱，固定相SE-30，规格30 m χ 0.32 mm χ 1 μ m，类型交联，最高使用温度。柱箱温度900C，检测器温度180°C，进样器180°C，载气为队，流速30 mL/min,以异丁醇为内标物，进样量0.4 UL0测得本实施例中的丁醇含量为7.92g/L。实施例6
菌种贝氏梭菌 CZo1SiriiZi腫 beijerinckii IB4
种子培养基酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，NaCl 2g/L，MgSO4 3g/L, KH2PO4 lg/L, K2HPO4 lg/L, FeSO4 · 7H20 0. lg/L, pH 6. 0 ；
发酵培养基玉米芯稀酸水解糖液(总还原糖33 g/L)，碳酸氢铵1.8 g/L，硫酸亚铁0. 30 g/L，碳酸钙3.0 g/L，玉米浆1 g/L，其余为水。pH 6. 6 6. 8。5L发酵罐发酵时培养基装液量为3L。将冻存的甘油管中的菌种接入50mL血清瓶中30mL的种子培养基中，通入队，在恒温培养箱中培养，温度为35°C，活化培养。培养1 后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有300mL种子培养基的500mL血清瓶中，扩大培养，1 后用于上述发酵培养基接种(5L发酵罐)，接种量为10% (v/v)，搅拌转速在120rpm，35°C发酵培养。接种后通入队，通气量为0. 25vvm，15min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。发酵时间为72h。采用FULI 9710气相色谱仪测定溶剂含量，FID检测器，色谱柱石英毛细管柱，固定相SE-30，规格30 m χ 0.32 mm χ 1 μ m，类型交联，最高使用温度。柱箱温度900C，检测器温度180°C，进样器180°C，载气为队，流速30 mL/min,以异丁醇为内标物，进样量0.4 UL0测得本实施例中的丁醇含量为8.75g/L。实施例7
菌种贝氏梭菌 CZo1SiriiZi腫 beijerinckii IB4
种子培养基酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，NaCl 2g/L，MgSO4 3g/L, KH2PO4 lg/L, K2HPO4 lg/L, FeSO4 · 7H20 0. lg/L, pH 6. 0 ；
发酵培养基玉米芯稀酸水解糖液(总还原糖37 g/L)，碳酸氢铵1.8 g/L，硫酸亚铁0. 30 g/L，碳酸钙3.0 g/L，玉米浆1 g/L，其余为水。pH 6. 6 6. 8。5L发酵罐发酵时培养基装液量为3L。将冻存的甘油管中的菌种接入50mL血清瓶中30mL的种子培养基中，通入队，在恒温培养箱中培养，温度为35°C，活化培养。培养1 后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有300mL种子培养基的500mL血清瓶中，扩大培养，1 后用于上述发酵培养基接种(5L发酵罐)，接种量为10% (v/v)，搅拌转速在120rpm，35°C发酵培养。接种后通入队，通气量为0. 25vvm，15min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。发酵时间为84h。 采用FULI 9710气相色谱仪测定溶剂含量，FID检测器，色谱柱石英毛细管柱，固定相SE-30，规格30 m χ 0.32 mm χ 1 μ m，类型交联，最高使用温度。柱箱温度900C，检测器温度180°C，进样器180°C，载气为队，流速30 mL/min,以异丁醇为内标物，进样量0.4 UL0测得本实施例中的丁醇含量为9.45g/L。


本发明公开了一种发酵培养基及用该培养基发酵生产丁醇的方法，其特征是每升该培养基中含有玉米芯稀酸水解糖液总还原糖27.5~37g，碳酸氢铵1.4~2.2g，硫酸亚铁0.2~0.4g，碳酸钙2.5~3.5g，玉米浆0.8~1.2g，其余为水。将贝氏梭菌ClostridiumbeijerinckiiNCIMB8052或者其诱变菌株ClostridiumbeijerinckiiIB4经菌种活化、种子培养、厌氧发酵三步骤发酵产生丁醇，其中厌氧发酵步骤中，接种量为8～10%(v/v)，温度为35～40℃，发酵罐在接种后通入纯N2，以保持发酵体系的厌氧环境，搅拌速度在100～300rpm，发酵时间在60～84h。本发明操作简单、培养基成本低廉，丁醇产量提高，得到的丁醇6.0~9.5g/L，为木质纤维原料的高效利用开辟了新的途径。