专利名称：一种加速肿瘤细胞凋亡的药物的制作方法 激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)是最早被鉴定的转录因子，属于碱性亮氨酸拉链类超家族(basic domain leucine zipper superfamily，bZIP)成员，是诸多细胞信号传导途径在细胞核内的交汇点。AP-1可以调控许多重要的细胞生命过程，如细胞增殖、凋亡、存活、分化、癌变等。AP-1活性受到严谨、动态的调控，多种生理刺激、环境因素和胞内的调节蛋白都可以调控AP-1的活性。AP-1的调控是AP-1研究者关注的一个热点领域。c-Jun是AP-1家族的核心组成成分，也是AP-1家族成员中功能最强大的转录激活蛋白(transcriptional activator)。c-Jun蛋白由原癌基因c-jun编码，全长331个氨基酸，分子量39kDa。已有的研究发现c-Jun有60多个相互作用蛋白，是AP-1家族成员中最多的。所有已知的c-Jun相互作用蛋白的一个共同特点是，以完整的分子形式发挥功能。本发明人所在实验室在1998年启动了人22周孕龄胎肝的大规模cDNA测序，这一计划的初衷是全面了解22周孕龄胎肝的基因表达特点、发掘新的细胞因子，为临床应用和新药开发寻找新的靶点。测序工作于2000年完成，共测定了15,000多个表达序列标签(EST)，含有1660个已知基因，建立了迄今最为系统、最大规模的基因表达谱。完成了5000多个代表新基因的ESTs的生物信息学分析，确定了110条含有全长ORF的cDNA作为新功能基因研究的重点。在这1660个已知基因中转录因子、转录相关基因和信号转导分子共计234个，约占14.1％，因此胎肝中尚未发现的转录和转录调控因子中很可能存在一些在重要疾病(如肿瘤)的发生、发展中扮演重要角色的因子。Jlip(c-Jun leucine zipper interacting protein)是上述110条基因中的一个有一定研究线索的分子。其cDNA全长1633bp，Genbank注册号AF291105，编码蛋白长409个氨基酸，N端含有一个PH结构域(pleckstrin homology domain)，C端72个氨基酸(其中包含一个亮氨酸拉链结构)与小鼠JZA-20多肽同源性非常高(高达96％)，后者是1992年Chevray等以c-Jun亮氨酸拉链区为诱饵利用酵母双杂交寻找c-Jun结合蛋白时发现的一个片段，提示Jlip可能与c-Jun结合并调控AP-1活性，并据此命名为Jlip(c-Jun leucine zipper interacting protein)。但目前并没有对人源的c-Jun亮氨酸拉链区结合蛋白进行报道，而Chevray得到的是多肽片段，不是完整的蛋白，也没有对得到的多肽作进一步的验证和功能研究。同一分子既含有PH结构域，又含有亮氨酸拉链结构的组成特点比较罕见。目前，只有少数几个分子有功能报道，如AFAP-110、beta Pix、APPL和Vav(Baisden et al.，2001；Kim et al.，2001；Mitsuuchi et al.，1999；Romero & Fischer，1996)。其中只有原癌蛋白Vav与AP-1有功能关联，它可以激活JNK/AP-1通路。但Vav对AP-1的调控是间接的，依赖于Rac和Vav分子内DH结构域的存在，亮氨酸拉链结构并不参与调控。对Jlip分子的结构分析显示，其亮氨酸拉链结构的N端不存在DNA结合区，因而不是典型的bZIP分子；分子内也不含其它DNA结合区，因而也不是DNA结合蛋白，因此排除了作为转录因子的可能。而具有磷脂结合特性的PH结构域很可能将其锚定于质膜，因此，既要Jlip锚定于质膜上，又要参与结合核内的c-Jun，从常理上讲，是矛盾的，也暗示Jlip可能以尚未发现的新的调控方式参与AP-1的功能。加拿大的一个实验室也获得了相同的基因，Bosc等以研究CK2为主要方向，以CK2α为诱饵蛋白筛选人B细胞文库，得到此基因，命名为CKIP-1(casein kinase 2interacting protein-1)。Bosc等在体内与体外实验中验证了CKIP-1与CK2α的相互作用，初步分析了CKIP-1的组织分布和细胞内定位。他们试图探讨CKIP-1对CK2的激酶活性的影响或CKIP-1是否为CK2的底物，但得到的都是阴性结果。因此，他们只推测CKIP-1可能是CK2的一个调节蛋白。所以，关于Jlip分子，既有一定的研究基础，更有诸多问题没有解决(1)虽然Jlip的C端可能与c-Jun结合，但尚未确证；(2)Jlip是否调控AP-1/c-Jun的活性，不清楚；(3)Jlip的生理功能没有报道。发明创造内容本发明的目的是提供一种加速肿瘤细胞凋亡的药物。本发明所提供的加速肿瘤细胞凋亡的药物，它的活性成分是Jlip蛋白。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。
本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明的药物可加速乳腺癌细胞、肺腺癌细胞的凋亡。
本发明的发明人发现，Jlip蛋白可增强肿瘤细胞对肿瘤坏死因子、放线菌酮等凋亡诱导因子的敏感性，是一个新的肿瘤细胞凋亡增效分子。本发明的药物可以辅助用于临床上治疗肿瘤，具有重要的意义。


图1为Jlip/SK-BR-3及pcDNA3.1/SK-BR-3细胞增殖曲线图2为Jlip/SK-BR-3及pcDNA3.1/SK-BR-3受到TNF/CHX信号刺激后细胞的凋亡曲线图3为Jlip/SK-BR-3及pcDNA3.1/SK-BR-3受到TNF/CHX信号刺激后细胞caspase-3的活性变化曲线图4为
材料肿瘤坏死因子(TNF)购自Chemicon；放线菌酮(cycloheximide，CHX)购自Sigma；重组人源caspase-3购自Pharmingen；caspase抑制剂DEVD-CHO购自Clontech；pcDNA3.1-Myc质粒购自Invitrogen；pcDNA3.1-Myc-Jlip质粒构建所用引物为P8181和P8183，插入片段长1.2kb，插入到载体的HindIII和KpnI位点之间，(引物序列为P8181caa gct tcg aat tct cgc ccg cgc ccg ctg gga atg；P8183cag agg tac ctt cat cag gct ctt)；胎牛血清(FBS)购自Hyclone；G418购自Gibco；FuGene 6转染试剂购自Roche。
实施例1、Jlip加速肿瘤细胞的凋亡及其机理1、Jlip/SK-BR-3及pcDNA3.1/SK-BR-3细胞的增殖速度(1)Jlip/SK-BR-3稳定株的筛选pcDNA3.1-Myc和pcDNA3.1-Myc-Jlip质粒(编码C末端含Myc标签的Jlip蛋白)转染乳腺癌细胞SK-BR-3，SK-BR-3细胞以RPMI 1640(15％FBS)培养。以FuGene 6转染方法在6孔板内进行。3天后，换含有G418(800μg/ml)的新鲜培养液，继续培养2周左右，每2天换液1次清除死亡细胞。待克隆长出之后，挑取克隆并转移至24孔板内继续扩大培养，而后依次扩大至12孔板、6孔板、培养瓶内。通过Westernblot鉴定阳性克隆。经过3周的筛选，获得了稳定表达Jlip的单克隆20个左右，均经Western blot鉴定为阳性，同时获得了转染空载体的对照克隆。
(2)Jlip/SK-BR-3及pcDNA3.1/SK-BR-3细胞的增殖速度Jlip/SK-BR-3及pcDNA3.1/SK-BR-3细胞稳定株铺24孔板(1×105个细胞/孔)，每天细胞计数(血球计数板直接计数)，每天计3孔，取平均值，共计7天，在第四天换1次培养液。实验重复3遍，取其中具代表性的1次数据作图，得到细胞生长曲线。
结果如图1所示，表明尽管两组细胞的形态没有差别，增殖速度也都比较快，但仍然可以看出差别，空载体组的细胞增殖能力更强一些。图1中，误差条表示标准差。
2、Jlip/SK-BR-3及pcDNA3.1/SK-BR-3细胞稳定株受到TNF/CHX信号刺激后细胞的凋亡情况Jlip/SK-BR-3及pcDNA3.1/SK-BR-3细胞稳定株生长至融合率90％左右时，撤血清饥饿过夜，加入20ng/ml的TNF和10μg/ml的CHX，诱导处理2-8hr。TNF以水配制，CHX以乙醇配制，-20℃保存。
经TNF/CHX诱导的细胞以胰酶消化，离心，加入PBS(含15％FBS)+70％乙醇(二者体积比3∶7)，-20℃放置4hr以上，离心，加入RNaseA消化，以碘化丙啶(PI)染色，在流式细胞分析仪上分析检测两组SK-BR-3稳定株对TNF/CHX信号刺激后凋亡细胞的比率，结果如图2所示。
过表达Jlip本身并不能诱导凋亡的发生。当细胞受到TNF/CHX的刺激后，在所检测的8hr内细胞的凋亡率Jlip组要高于对照组，统计学分析表明，2hr时差异显著(P＜0.05)，4hr到8hr差异极其显著(P＜0.01)，如TNF/CHX处理后6hr，大约27.0±2.5％的Jlip组细胞发生凋亡，此时空载体组只有11.8±1.9％发生凋亡。因此，Jlip表达可以增强乳腺癌细胞对肿瘤坏死因子的敏感性，加速乳腺癌细胞的凋亡。
3、Jlip加速肿瘤细胞凋亡的机理为了阐明Jlip加速肿瘤细胞凋亡的机理，以DEVD-CHO-AFC为底物，按照ApoAlertcaspase-3测定试剂盒(购自Clontech)的说明进行Caspase-3活性测定，荧光底物的不同光吸收值反映caspase-3活性。
结果如图3所示，表明TNF/CHX刺激之后，Jlip组细胞的caspase-3活性在2hr就可以看到激活，而在对照组这一激活的发生出现在第4hr，在6hr以内的时相范围可以看到两组的差别比较明显。在较晚的时相，这种差别不再明显，表明此时caspase-3的激活可能已经接近平台期。以前的研究曾发现caspase-3是CHX诱导凋亡所必需的，比如caspase-3打靶的小鼠骨髓嗜中性粒细胞可以拮抗CHX诱导的凋亡(Woo et al.，1998)。
为了确证caspase-3对于凋亡发生的重要性，在TNF/CHX加入前，预先加入caspase-3的特异性抑制剂DEVD-CHO，结果如图2和图3所示，表明DEVD-CHO可以阻断TNF/CHX诱导的凋亡与caspase-3激活，表明了caspase-3的重要性。此外，还观察到，Jlip的表达并未对细胞周期产生明显的影响。
Caspase-3的抑制剂可以阻断TNF/CHX诱导的凋亡以及Jlip促进凋亡的效应，表明caspase-3不仅是TNF/CHX诱导凋亡所必需的，也是Jlip介导的凋亡放大效应所必需的。Jlip的这种作用有些类似于与Jlip具有完全不同结构的其他caspase-3底物，如MEKK1、RET和Bcl-2(Widmann et al.，1998；Bordeaux et al.，2000；Chenget al.，1997)。
从本实施例可以看出，Jlip可抑制细胞生长，增加SK-BR-3乳腺癌细胞对TNF/CHX的凋亡诱导敏感性；Jlip是一个凋亡的增效分子。
实施例2、Jlip降低肺腺癌细胞Glc-82在培养条件下的集落形成能力1、Jlip/Glc-82及pcDNA3.1/Glc-82细胞稳定株的筛选pcDNA3.1-Myc和pcDNA3.1-Myc-Jlip质粒转染肺腺癌细胞Glc-82，Glc-82细胞以RPMI 1640(10％FBS)培养。转染、筛选及鉴定方法同实施例1中SK-BR-3细胞稳定株的方法。
2、Jlip/Glc-82及pcDNA3.1/Glc-82细胞稳定株的集落形成能力测定先制备软琼脂平板。配制2×RPMI 1640培养液、1.2％和0.7％低熔点琼脂糖凝胶。将1.2％琼脂糖胶和等体积2×RPMI 1640混匀，铺于60mm直径培养皿内，作为底层胶。而后胰酶消化稳定株细胞，制成单细胞悬液，计数，铺板，每个培养皿接种600个细胞。消化细胞的同时将0.7％琼脂糖胶和等体积2×RPMI 1640混匀，维持在40℃左右，作为顶层胶。将细胞迅速加入到顶层胶中，铺于底层胶上面。于培养箱内培养2周左右，计生长的细胞克隆数。
结果如图4所示，表明空载体组得到267±84.01个集落，而Jlip表达组只得到135.25±21.19个集落，差异显著(P＜0.05)。集落形成能力代表了肿瘤细胞的恶性转化能力，因此，Jlip的表达可以显著地抑制肿瘤细胞的恶性转化。
从本实施例可以看出，Jlip可有效地抑制肿瘤细胞的恶性增殖。


本发明公开了一种加速肿瘤细胞凋亡的药物。本发明所提供的加速肿瘤细胞凋亡的药物，它的活性成分是Jlip蛋白。该药物中还含有人体可接受的药用载体。本发明的药物可加速乳腺癌细胞、肺腺癌细胞的凋亡，可以辅助用于临床上治疗肿瘤，具有重要的理论和实际意义。