专利名称：一种聚丙烯酰胺凝胶中dna的银染方法银染法于1979 年建立，如 Switaer 在文献 1 (Switer R. C.，Merrill C. R.， Shifrins. Ahighly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal Biochem, 1979,98 :231)中研究了用银染方法对聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳进行了染色。后来此方法被用在了核酸的检测上，银染法大大提高了检测的灵敏度，促进了生物大分子结构和功能的研究，目前已广泛用于核酸和蛋白质的分离，特别是在 AFLP(amplified fragment length polymorphism)、SSR(simple repeat sequence)、 SNP(single-nucleotide polymorphism)等分子标记研究中具有不可替代的作用。银染方法的基本原理是先用固定液将核酸固定到凝胶上，然后使银染剂中的银离子与之牢固结合，再通过还原剂将银离子还原，从而发生了显色反应，使得目标产物可见。 银染法对试剂的要求不高，并且固定液和染色液可以重复使用，降低了试验成本，所用试剂安全稳定，对操作者的健康所造成的危害性甚微，银染后的凝胶可以长期保存，更有利于对试验结果的回顾性分析。根据银染所用的银试剂，银染又可分为以酸性形式存在的硝酸银染色法和以碱性形式存在的银氨染色法，其中以硝酸银染色法更为普遍，银染法具有很高的灵敏度，可使单链和双链核酸着色，因此得到广大科研工作者的青睐。目前较常用的银染法是Bassam法(Bassam B J, Caetano A G, Gresshoff P M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels[J]. Analytical Biochemistry, 1991,196 :80-83.)禾口 Sanguinetti 法(Sanguinetti C J, Dias N Ε, Simpson A J. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels [J]. Biotechniques, 1994，17(5) :914-921.)，但过程比较繁琐。近年来，很多研究者根据自己的实践提出了不少改进的银染法，但都各有缺陷，有的操作步骤太多、耗时较长，最长的有报道需22小时，有的节省时间，但是重现性较差，同样的样品两次操作染色的结果完全不同。传统的和诸多改良银染方法中，由于染色时硝酸银浓度较高(0. 1 0.2%)，在银染后都要洗胶，以除去凝胶中的银离子。但由于胶的厚薄和大小不同，洗胶时间难以控制。 洗胶时间过长，则会将吸附于DNA上的银离子洗去，使得到的胶片分辨率低，条带模糊；洗胶时间过短，则会使得胶面上的银离子洗涤不充分，在经过显色后，胶片背景加深。
针对现有银染方法存在的不足，本发明的目的是提供一种简便、经济和成功率高的聚丙烯酰胺凝胶中DNA的银染方法。为实现上述目的，本发明的解决方案如下一种聚丙烯酰胺凝胶中DNA的银染方法，其特征在于，电泳结束后，用染色液(8% 乙醇、0. 6%硝酸和0. 01% 0. 08%硝酸银)浸泡聚丙烯酰胺凝胶30min，然后用显色液 (1. 5% NaOH,0. 4%甲醛和90mg/L硼氢化钠或者硼氢化钾)显色lOmin，最后用硝酸终止 2min。所述的染色液组成为8%乙醇，0. 6%硝酸，0. 01% 0. 08%硝酸银。所述的显色液组成为1. 5% NaOH, 0. 4%甲醛，90mg/L硼氢化钠或者硼氢化钾)。本发明的方法对硝酸银浓度进行了优化，比传统方法和诸多改良方法的硝酸银浓度更低，染小胶时其浓度只有0. Ol %，染大胶时其浓度只有0. 05 %，节约硝酸银，省去银染后洗胶的步骤，最终建立了一种改良的银染方法，在保障检测灵敏度的同时，有效地控制凝胶的染色背景，步骤简单，容易操作，实验的成功率高。图1为马铃薯微卫星引物P03、P04、P05和P06分别对马铃薯三个亲本(紫皮紫心、白皮白心、白皮紫心)和五个Fl基因池(白皮红心、白皮白心、白皮紫心、紫皮白心、紫皮紫心)进行扩增的PCR产物6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及本发明银染法检测图。图2为马铃薯微卫星引物P01、P02、P03和P04分别对马铃薯三个亲本(紫皮紫心、白皮白心、白皮紫心)和五个Fl基因池(白皮红心、白皮白心、白皮紫心、紫皮白心、紫皮紫心)进行扩增的PCR产物6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及Bassam银染法检测图。
小胶(120mmX IOOmmX Imm)大胶(500mm X 340mm X 2mm)40%聚丙烯酰胺6mL90mL尿素16. 8g252g50x TBE0. 8mL12mL过硫酸铵14mg150mgTEMED28 μ L400 μ L去离子水19mL284mL终体积40mL600mL 将马铃薯SSR的PCR产物与变性缓冲液(98%甲酰胺，IOmmol/L EDTA，0. 25%溴酚蓝)等体积混合，95°C水浴变性5min后，立即转入冰水浴中冷却，后在小胶中每个上样孔中加入1 μ L混合液，在大胶中每个上样孔中加入2 μ L混合液。小胶250V电泳2h，大胶1500V电泳2. 5h。实施例2 小胶染色条件优化。配制硝酸银浓度分别为0. 007%,0. 009%,0. 011%,0. 013%,0. 015%,0. 017%, 和0. 019%的染色液各IOOmL,浸泡小胶20min，然后用显色液显色20min，最后用1 %硝酸终止aiiin。结果表明，用含0.015%硝酸银的染色液对小胶进行银染，可以得到质量高，背景色低、分辨率高，条带清晰的胶片。染色时间控制在20-30min之间，就可以得到质量高的胶片。显色时间分别是15min，20min, 25min, 30min。通过对结果的分析比较，可以看出显色时间控制在20-25min之间，可以得到质量高，背景色低、分辨率高，条带清晰的胶片。比较三种显色液 A(l. 5% NaOH 和 0.4% 甲醛)、B (1.5% Na0H、0. 4% 甲醛和 90mg/ L NaBH4)和 C(0. 65% Nei2CO3U. 3% NaOH和 0. 4% 甲醛)的效果，表明 1. 5% NaOH.O. 4% ψ 醛和90mg/LNaBH4为显色液时，所得胶片质量高，背景色低、分辨率高，条带清晰。实施例3 大胶染色条件优化。将小胶得到的银染结果试用于大胶时，因为小胶的面积、厚度与大胶相差很大，且大胶进行银染时只有一个胶面与染色试剂接触，因此，在对大胶进行银染时，要对硝酸银浓度进行调整。配制硝酸银浓度分别为0. 02%,0. 03%,0. 04%,0. 05%,0. 06%,0. 07%、和 0. 08%的染色液各2000mL，浸泡大胶40min，然后用显色液显色20min，最后用硝酸终止 2min。结果表明，用含0. 05%硝酸银的染色液对大胶进行银染，可以得到质量高，背景色低、 分辨率高，条带清晰的胶片。实施例4 =Bassam银染法与本发明银染法比较表2 Bassam银染法与本发明银染法比较
步骤Bassam 法本发明银染法时间65 min42 min固定10% acetic acid; 20 min—漂洗H2O; 2 min; three times一染色0.1% AgN03, 0.15%HCOH; 30 min8%ethanol, 0.6%nitric acid, 0.05% AgNO3; 30 min漂洗H2O; 20 s (optional)—显色3% Na2CO3, 0.15% HCOH, 0.0002% Na2S2O3.5H20; 2—5 min1.5% NaOH9 0.4% HCOH, 90mg/L NaBH4; IOmin终止10% acetic acid; 5 min1% nitric acid; 2 min 按表2操作步骤比较Bassam银染法与本发明银染法，结果如图1 (本发明银染法) 和图2(BaSSam法)所示，说明本发明的方法与Bassam法相当，但本发明的方法更加简便和经济。


本发明涉及一种聚丙烯酰胺凝胶中DNA的银染方法。电泳结束后，用染色液(8％乙醇、0.6％硝酸和0.01％～0.08％硝酸银)浸泡聚丙烯酰胺凝胶10-30min，然后用显色液(1.5％NaOH、0.4％甲醛和90mg/L硼氢化钠或者硼氢化钾)显色10min，最后用1％硝酸终止2min。传统的方法和诸多改良方法中，由于染色时硝酸银浓度较高(0.1～0.2％)，在银染后都要洗胶，以除去凝胶中的银离子。但由于胶的厚薄和大小不同，洗胶时间难以控制。本发明比传统方法和诸多改良方法的硝酸银浓度更低，染小胶时其浓度只有0.01％，染大胶时其浓度只有0.05％，节约硝酸银，省去银染后洗涤的步骤，具有简便和经济的特点，在保证了染色效果的同时使得银染的重复性得到了很大提高。