专利名称：发酵过程中添加NaCl生产γ-聚谷氨酸的方法Y -聚谷氨酸(poly- γ -glutamic acid,简称γ -PGA)是由L_谷氨酸或D-谷氨酸通过Y-酰胺键结合形成的一种水溶性的生物高分子聚合物。由于Y-聚谷氨酸具有吸水性、可降解性、水解性等众多特性，因此被广泛用于医药、食品加工、农业、绿化以及水处理等多种领域，具有极大的开发价值和应用前景。γ -聚谷氨酸最初由炭疽芽抱杆菌中发现，在高(X)2浓度的诱导下，炭疽芽抱杆菌可产生Y-D-聚谷氨酸，产生的Y-D-聚谷氨酸附着在细胞壁上并在微生物细胞外面形成荚膜，炭疽芽抱菌株的毒性限制了其在工业上的应用。由于枯草芽孢杆菌和地衣芽抱杆菌的易培育性和安全性，现在聚谷氨酸的生产大多报道由此类菌株产生。Y-聚谷氨酸一般以游离形式直接分泌到培养基中，可静态发酵也可动态发酵，可称为游离型Y-聚谷氨酸。 Y -聚谷氨酸可作为细胞外营养物存储，可促进细胞膜的形成，在非常时期为微生物提供生存所需，可防止噬菌体的侵袭，并在高盐环境下对金属离子进行包裹从而对细胞具有保护作用。目前国内外主要采用微生物发酵法生产Y-聚谷氨酸。迄今所报道的Y-PGA产生菌主要有四种枯草(纳豆)芽孢杆菌(BaciLLus subtiLis)、地衣芽孢杆菌(BaciLLus Licheniformis)、而 高温芽 包杆菌(BaciLLus thermotoLerant)、炭Iil芽 包杆菌(BaciLLus. anthracis)，尽管许多研究者对微生物发酵法生产Y -聚谷氨酸进行了大量研究，但产率普遍还处于较低水平，生产成本高，这在很大程度上限制了 Y -聚谷氨酸的工业生产与应用。由于Y-PGA生物合成的机理至今尚不很清楚，而且菌株生成Y-PGA的代谢途径复杂， 调节方式多样，目前提高其生产效率的方法主要依靠选育优良菌种和优化发酵工艺。因此提高Y-聚谷氨酸的生产效率是大规模生产与应用亟待解决的重要课题。
本发明的目的在于提供一种新的发酵工艺以提高Y-聚谷氨酸(Y-PGA)的产量， 即将纳豆芽孢杆菌在液态发酵培养基中预培养一段时间后添加NaCl以提高发酵基质的渗透压，再继续培养至发酵终点以提高Y-PGA产量。一般认为γ -PGA是某些细菌的荚膜或黏液层的主要有机成分，而荚膜或黏液层的形成既是这些细菌的遗传属性，也与其所处环境条件密切相关。如对数期的细菌很少形成荚膜，进入稳定期后才开始大量形成，这是细菌对环境劣变(如营养成分减少、代谢废物增加)的一种适应机制。有文献报道(李大力等，化学与生物工程，24:50-51，2007)在配制培养基时添加NaCl培养枯草芽孢杆菌能提高Y -PGA的产量，并认为这是菌种对渗透压提高的一种适应机制。但我们的研究发现这种添加NaCl的方式在培养纳豆芽孢杆菌 (Bacillus subtilis natto) CICC20643时并不能提高γ-PGA的产量，甚至使产量和生物量CN 102533885 A都降低。究其原因是较高的渗透压对纳豆芽孢杆菌的生长会造成一定程度的抑制，使生物量比未加入NaCl的状态下要少一些。因此先让纳豆芽孢杆菌在不受抑制的状态下培养，待其进入稳定期后加入NaCl再继续培养，则既保证了足够的生物量，又形成了合成Y -PGA的有利环境，其结果使Y-PGA产量提高。本发明提供的生产γ -聚谷氨酸的方法采取如下步骤(1)、将纳豆芽孢杆菌斜面菌种接种于已灭菌冷却的液态种子培养基中，在30 37°C摇瓶培养18 36h，即成纳豆芽孢杆菌种子液；O)、将纳豆芽孢杆菌种子液按 6%接种量接种于液态发酵培养基中，于 30 37°C摇瓶培养或通气培养12 36h ；然后在培养基中添加重量体积百分比为3% 6%的NaCl，NaCl以固体颗粒或溶液状态加入，添加NaCl后继续摇瓶培养或通气培养36 48h，终止发酵；(3)、对发酵液进行提取、纯化，制得含Y-聚谷氨酸的产品。其中，液态种子培养基，以重量体积百分比计，单位为g/L，其组成为蛋白胨8 12g/L，牛肉膏 4 6g/L，NaC18 12g/L，pH6. 5 7. 5，其余为水。其中，液态发酵培养基，以重量体积百分比计，单位为g/L，其组成为蔗糖或葡萄糖 20 25g/L，酵母膏 5 10g/L，谷氨酸钠 20 50g/L，Na2HPO4 lg/L，NaH2PO4 lg/L，MgSO4 0. 5g/L，ρΗ6· 0 7. 5，其余为水。本发明的优点在于在菌种生长稳定期加入NaCl不影响菌种生长，这样既保证了足够的生物量，又形成了合成Y-PGA的有利环境，结果使Y-PGA产量提高。本方法比接种前添加NaCl或不加NaCl能提高Y -聚谷氨酸的产量10% 40 %，且操作简单、便于大规模生产，具有良好的应用前景。实施例2 液态深层发酵(1)种子液的制备同实例1。(2)液态深层培养发酵培养基的成分葡萄糖20g/L、酵母粉10g/L、谷氨酸钠20g/L、磷酸氢二钠 lg/L、磷酸氢二钠lg/L、硫酸镁0. 5g/L，其余为自来水；初始pH值为7. 0，在5L微生物发酵罐中加入3L发酵培养基，灭菌冷却后以5%接种量接入纳豆芽孢杆菌种子液，37°C培养，通气比0. 5 0. 8 (ν/ν)，搅拌转速200r/min，培养24h后添加4%的NaCl，NaCl以浓溶液经灭菌后按无菌操作方式加入。继续在37°C培养36h后结束，培养过程通气比降低至 0. 3 0. 5 (ν/ν) ο(3) γ -PGA 的提取提取纯化工艺同同实例1，Y -PGA的最高产量达到29. 76g/L。
本发明提供了一种发酵过程中添加NaCl生产γ-聚谷氨酸的方法。本方法以纳豆芽孢杆菌为γ-聚谷氨酸的生产菌，主要发酵工艺步骤包括将菌种在液态发酵培养基中预先好氧培养一段时间，然后添加NaCl以提高发酵基质的渗透压，再继续好氧培养至发酵终点等三个步骤。本方法比接种前添加NaCl或不加NaCl能明显提高γ-聚谷氨酸的产量，且操作简单、便于大规模生产，具有良好的应用前景。