专利名称：提高富马酸产量的基因工程菌株及构建方法及其应用的制作方法富马酸是一种重要的基本化工原料和精细化工产品，广泛用于涂料、树脂、医药、 增塑剂等领域。工业上可用于生产不饱和树脂和醇酸树脂，以及用作生产电泳漆的原料。 与苯乙烯的共聚物是生产玻璃钢的原料，与乙酸乙烯的共聚物是优良的粘合剂。食品级富马酸是口味纯正的酸味剂，用作饮料、酒类、糕点以及腌菜等的酸味剂，并起着食品防腐剂、 抗氧化剂和PH调节剂的作用。将富马酸与碳酸钠反应制备的富马酸钠是一种食品添加剂的风味增强剂；饲料级富马酸及其酸类能提高饲料中有机物质的吸收率和生物学利用率， 减少机体能量消耗，所以还具有促进增重等作用。同时，以富马酸为原料可以进一步合成多种高价值衍生物。富马酸和醇类在硫酸催化剂的作用下进行酯化反应可生成富马酸酯，近代已开发出一系列的富马酸酯类防霉防蛀剂，如富马酸二甲酯(DMF)、二乙酯(DEF)、二丙酯(DPF)、二丁酯(DBF)、单甲酯(MMF)等，其代表性产品富马酸二甲酯为国外八十年代开发的一类低毒、高效、价廉、广谱的新型防霉防腐剂，较苯甲酸、山梨酸、脱氢醋酸、丙酸及相应的盐具有用量少、成本低、效果好等优点，国外早已广泛应用于食品防霉剂行业。以富马酸作为原料，可以进一步合成多种药品，富马酸钠与硫酸亚铁的置换产物富马酸亚铁已广泛应用于医学上治疗人体的小红血球贫血病，其他诸如富马酸奎地平，富马酸酮替芬，富马酸氯马斯汀片，富马酸比索洛尔片剂等都已在国内外上市使用。另外，富马酸作为一种重要的四碳平台化合物，还可以通过酶催化转化、酯化、加氢等工艺生产L-天冬氨酸、苹果酸、琥珀酸、马来酸、1，4_ 丁二醇、Y-丁内酯和四氢呋喃等四碳化合物。微生物发酵法制备富马酸的常用菌种为米根霉、少根霉、无根根霉以及黑根霉，Tsao教授等报道了利用米根霉发酵产富马酸(Appl Environ Microbiol，1996，62 : 四31.)，通过对米根霉合成富马酸代谢途经分析，葡萄糖通过糖酵解过程生成丙酮酸，丙酮酸在经TCA和反TCA途径生成富马酸的同时，还可在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下生成乳酸，乳酸途径的存在大大削弱了富马酸的积累能力。研究人员尝试通过菌株诱变手段筛选乳酸缺陷型菌株，但一直受限于低筛选效率和筛选方法不恰当等限制因素的制约，未能获得遗传稳定的低产乳酸米根霉菌株。 米根霉在经历了一定时间的常规培养后，IdhL在产物积累中渐渐起到主导作用，从而使得米根霉积累乳酸的能力逐步提高，严重影响了富马酸的合成。因此通过某种技术手段阻断 IdhL基因将改变碳代谢流的分配，减弱或完全剔除乳酸代谢支路，从而达到提高富马酸代谢通量的目的。而如何有效抑制IdhL活性以及在代谢迁移的基础上，进行代谢流调控，重新分配代谢通量，将是实现利用基因敲除技术改造R. oryzae高通量积累富马酸的关键。
本发明的目的是提供一种提高富马酸产量的基因工程菌株。本发明另一个目的是提供一种提高富马酸产量的基因工程菌株的构建方法。本发明的第三个目的是提供一种提高富马酸产量的基因工程菌株的用途。本发明的技术方案概述如下—种提高富马酸产量的基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤(1)乳酸脱氢酶基因IdhL的克隆以提取的米根霉细胞基因组DNA为模板，分别以序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2为上、下游引物，进行PCR反应，扩增出SEQ ID No. 5所示的乳酸脱氢酶IdhL基因序列，提纯，将提纯后的乳酸脱氢酶IdhL基因序列与pMDIS-simple-T载体连接，得到重组 pMD18-simpIe-T载体，进行序列测定，酶切所述重组pMD18_simpIe-T载体，得到包含酶切位点的IdhL基因片段；(2)包含真菌启动子序列、反向IdhL基因序列以及终止子序列的重组片段构建利用Not I, Xho I将步骤(1)获得的片段反向插入到SEQ ID No. 7所示的质粒 PGAPZB启动子的下游，获得重组质粒pGAP^-ldhL，用Bgl II，BamH I酶切重组质粒所述 pGAP^-ldhL，得到包含真菌启动子序列、反向IdhL基因序列以及终止子序列AOXl的重组片段 pGAP-ldhL-AOXl ；(3)潮霉素抗性基因的克隆以SEQ ID No. 8所示的质粒pDx-Los为模板，以序列表SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4为上、下游引物，PCR扩增潮霉素抗性基因，将PCR扩增产物提纯，与pMD18-Simple-T 载体连接，得到重组pMD18-simpIe-T载体，酶切所述重组pMD18_simpIe-T载体，得到SEQ ID No. 6所示的包含酶切位点的潮霉素抗性基因片段；(4)含有抗性基因重组基因片段的构建将步骤⑵获得的重组片段与步骤(3)获得的基因片段利用BamH I位点进行连接，用限制性内切酶EcoR I验证片段连接顺序，筛选潮霉素抗性基因片段位于 pGAP-ldhL-AOXl片段下游的连接子，得到重组片段pGAP-ldhL-AOXl-chac/ ；(5)重组质粒的构建利用限制性内切酶位点BamH I,Hind III将所述重组片段pGAP-ldhL-AOXl-chac/ 插入质粒 PCAMB3300，得到重组质粒 ρ CAMB3300-pGAP-ldhL-A0Xl-chaoE ；(6)重组根癌脓杆菌的获得将步骤( 获得的重组质粒ρ CAMB3300pGAP-ldhL-A0Xl-chaoK通过电击直接转化根癌脓杆菌LBA4404，涂布含50 μ g/mL的卡那霉素LB平板培养基，挑取阳性转化子，并进行分子鉴定阳性克隆，得到含有重组质粒P CAMB3300pGAP-ldhL-A0Xl-chaoE的根癌脓杆菌基因工程菌株，命名为 Agrobacterium tumefaciens LBA4404-pCAMB3300-pGAP-ldhL-A0Xl -chaoE(7)重组米根霉菌株的获得①将步骤(6)获得的菌株接种于含卡那霉素、利福霉素和链霉素的LB培养基中， ^-32°C，180-220r/min摇床培养30_4池，离心收集菌体，用等体积的IM培养基重悬菌体， 培养5-8h，使菌细胞终浓度达到IOll-IO12个/mL ；所述卡那霉素在LB培养基中的浓度为 40-60 μ g/mL,所述利福霉素在LB培养基中的浓度为40-60 μ g/mL,所述链霉素在LB培养基中的浓度为20-40 μ g/mL ；②将米根霉孢子液接种于YPD固体培养基中，33-35°C培养6_8天；用无菌水洗脱收集新鲜孢子，重悬于用20g/l的无菌CaCl2水溶液中，使米根霉孢子浓度达到IO8-IO9个/ mL ；取步骤①和②获得的重悬菌液各50 μ L加入含有乙酰丁香酮、卡那霉素和潮霉素的IM培养基中，在28-320C，180-220r/min培养12_16h ；稀释IO"6倍，取200 μ L稀释液涂布铺有玻璃纸的IM+AS培养基平板，并置于33-35°C培养40_50h ；将玻璃纸转接到含有潮霉素的YPD培养基上培养90-100h，筛选阳性米根霉基因工程菌株，并进行基因水平上的分子鉴定，命名为Miizopus oryzae CM 08/LDH_，所述乙酰丁香酮在IM培养基中的浓度为 200 μ mol/L,卡那霉素在IM培养基中的浓度为50 μ g/mL,潮霉素在IM培养基中的浓度为 50 μ g/mL,所述潮霉素在YPD培养基中的浓度为50 μ g/mL。上述方法构建的一种提高富马酸产量的基因工程菌株lihizopus oryzae CM 08/ LDH-。上述一种提高富马酸产量的基因工程菌株在以葡萄糖为底物发酵生产富马酸的用途。本发明的有益效果本发明的菌株在充分好氧条件下利用葡萄糖发酵高浓度积累富马酸，解决了传统米根霉发酵产富马酸副产物乳酸含量较高的问题。分批补料发酵完毕可利用150g/L的葡萄糖，得到富马酸120g/L，摩尔转化率80%，生产强度达到1. 2g/L/h ；在相同条件下，原始菌株利用150g/L的葡萄糖，得到80g/L的富马酸，生产强度仅为0. 8g/L/h，与野生米根霉菌株相比，本发明的重组菌株的生产富马酸的最终发酵浓度和生产强度得到显著提高。与目前文献所报道利用野生米根霉菌株发酵产富马酸过程相比较，提高了生产强度，缩短了生产时间，副产物乳酸的浓度显著降低，目标产物浓度提升明显，从而降低了发酵液中富马酸的分离难度和分离成本，为微生物发酵法工业化生产生物基来源的富马酸奠定了良好的基石出。同实施例1步骤O)(3)潮霉素抗性基因的克隆同实施例1步骤(3)(4)含有抗性基因重组基因片段的构建同实施例1步骤(5)重组质粒的构建同实施例1步骤(5)(6)重组根癌脓杆菌的获得同实施例1步骤(6)(7)重组米根霉菌株的获得①将步骤(6)获得的菌株接种于含卡那霉素、利福霉素和链霉素的LB培养基中， 280C，220r/min摇床培养42h，离心收集菌体，用等体积的IM培养基重悬，培养他，使菌细胞终浓度达到IO12个/mL ；所述卡那霉素在LB培养基中的浓度为60 μ g/mL，所述利福霉素在 LB培养基中的浓度为60 μ g/mL,所述链霉素在LB培养基中的浓度为40 μ g/mL ；②将米根霉孢子液接种于YPD固体培养基中，33°C培养8天；用无菌水洗脱收集新鲜孢子，重悬于用20g/l的无菌CaCl2水溶液中，使米根霉孢子浓度达到IO8个/mL ；取步骤①和②获得的菌液各50 μ L加入含有乙酰丁香酮、卡那霉素和潮霉素的 IM培养基中，在^°C，220r/min培养16h ；稀释10_6倍，取200 μ L稀释液涂布铺有玻璃纸的IM+AS培养基平板，并置于35°C培养40h ；将玻璃纸转接到含有潮霉素的YPD培养基上培养90h，筛选阳性米根霉基因工程菌株，并进行基因水平上的分子鉴定，命名为Miizopus oryzae CM08/LDH—，所述乙酰丁香酮在IM培养基中的浓度为200 μ mol/L,卡那霉素在IM培养基中的浓度为50μ g/mL，潮霉素在IM培养基中的浓度为50 μ g/mL，所述潮霉素在YPD培养基中的浓度为50 μ g/mL。实施例3一种提高富马酸产量的基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤(1)乳酸脱氢酶基因IdhL的克隆同实施例1步骤(1)(2)包含真菌启动子序列、反向IdhL基因序列以及终止子序列的重组片段构建同实施例1步骤O)(3)潮霉素抗性基因的克隆同实施例1步骤(3)(4)含有抗性基因重组基因片段的构建同实施例1步骤(5)重组质粒的构建同实施例1步骤(5)(6)重组根癌脓杆菌的获得同实施例1步骤(6)(7)重组米根霉菌株的获得①将步骤(6)获得的菌株接种于含卡那霉素、利福霉素和链霉素的LB培养基中，320C，180r/min摇床培养30h，离心收集菌体，用等体积的IM培养基重悬，培养证，使菌细胞终浓度达到IO11个/mL ；所述卡那霉素在LB培养基中的浓度为40 μ g/mL，所述利福霉素在 LB培养基中的浓度为40 μ g/mL,所述链霉素在LB培养基中的浓度为20 μ g/mL ；②将米根霉孢子液接种于YPD固体培养基中，35°C培养6天；用无菌水洗脱收集新鲜孢子，重悬于用20g/l的无菌CaCl2水溶液中，使米根霉孢子浓度达到IO9个/mL ；取步骤①和②获得的菌液各50 μ L加入含有乙酰丁香酮、卡那霉素和潮霉素的IM 培养基中，在32°C，180r/min培养12h ；稀释10_6倍，取200 μ L稀释液涂布铺有玻璃纸的 IM+AS培养基平板，并置于33°C培养50h ；将玻璃纸转接到含有潮霉素的YPD培养基上培养100h，筛选阳性米根霉基因工程菌株，并进行基因水平上的分子鉴定，命名为lihizopus oryzae CM 08/LDH—，所述乙酰丁香酮在IM培养基中的浓度为200 μ mol/L,卡那霉素在IM 培养基中的浓度为50 μ g/mL,潮霉素在IM培养基中的浓度为50 μ g/mL,所述潮霉素在YPD 培养基中的浓度为50 μ g/mL。实施例4对重组菌与野生米根霉菌株发酵培养，步骤如下将原始的米根霉和新构建的Miizopus oryzae CM 08/LDH_菌在下面的培养基和培养条件下进行发酵(1)原始的米根霉菌株，其命名为Rhizopus oryzae CICC 40506 ；(2)种子培养基葡萄糖20g/l，磷酸二氢钾0.8g/l，硫酸铵2g/l，硫酸镁0.6g/l， 硫酸锌0. 13g/l，硫酸亚铁0. 01g/l，灭菌完毕用无菌稀硫酸调节初始pH至3. 0用于种子生长培养。种子培养500ml三角瓶，装液量100ml，培养温度33 °C，孢子接种量 5.0X 107/100ml种子液，摇床转速200r/min，培养14h，此为一级种子液。一级种子液以 10%接种量接种至新的无菌培养基成分中培养14h即为二级种子液；二级种子液以10%接种量接种至新的无菌培养基成分中培养14h即为三级种子液；二、三级种子培养基组分以及其余各参数均同一级种子液。(3)发酵培养基葡萄糖80g/l，磷酸二氢钾0. 8g/l，尿素0. 2g/l，硫酸镁0. 6g/l， 硫酸锌0. 13g/l，硫酸亚铁0. 01g/l，碳酸钙50g/l。培养条件7L发酵罐，装液量4L，接种三级种子液，接种量10 %，发酵温度35。C， 转速 300rpm/min，通空气策略发酵 O-Mh lvvm, 24-36h 0. 6vvm, 36-48h Ovvm, 48-60h 0. 6vvm,60-72h lvvm,72h开始之后维持通气量lwm，大约至72h，发酵结束见表1。表1:


本发明公开了提高富马酸产量的基因工程菌株及构建方法及其应用，构建方法为(1)乳酸脱氢酶基因ldhL的克隆；(2)包含真菌启动子序列、反向ldhL基因序列以及终止子序列的重组片段构建；(3)潮霉素抗性基因的克隆；(4)含有抗性基因重组基因片段的构建；(5)重组质粒的构建；(6)重组根癌脓杆菌的获得；(7)重组米根霉菌株的获得本发明的菌株在充分好氧条件下利用葡萄糖发酵高浓度积累富马酸，与野生米根霉菌株相比，副产物乳酸含量低，生产富马酸的最终发酵浓度和生产强度得到显著提高，缩短了生产时间，从而降低了发酵液中富马酸的分离难度和分离成本，为微生物发酵法工业化生产生物基来源的富马酸奠定了良好的基础。