用于生产鼠李糖脂的细胞和方法

S·沙费尔, M·韦塞尔, A·蒂森胡森, N·施泰因

2013年4月10日

2011年7月20日

2010年7月28日

赢创高施米特有限公司

C12R1/385GK103038357SQ201180037007

鼠李糖 细胞 用于 生产

1.细胞，其能够形成至少一种通式(I)的鼠李糖脂，2.权利要求1的细胞，其特征在于酶EpE2和E3选自以下一组至少一种酶E1，其选自 酶Ela，其具有多肽序列Seq ID No. 2，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq ID No. 2相比其中有高达25%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%的具有参照序列Seq ID No. 2的酶的酶活性， 酶Elb，其具有多肽序列Seq ID No. 18，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo. 18相比其中有高达25%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%的具有参照序列Seq ID No. 18的酶的酶活性，酶E1，其具有多肽序列Seq ID No. 78，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo. 78相比其中有高达25%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%的具有参照序列Seq ID No. 78的酶的酶活性， 酶Eld，其具有多肽序列Seq ID No. 80，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo. 80相比其中有高达25%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%的具有参照序列Seq ID No. 80的酶的酶活性，以及 酶Ele，其具有多肽序列Seq ID No. 82，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo. 82相比其中有高达25%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%的具有参照序列Seq ID No. 82的酶的酶活性， 至少一种酶E2，其选自 酶E2a，其具有多肽序列Seq ID No. 4，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq ID No. 4相比其中有高达25%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%的具有参照序列Seq ID No. 4的酶的酶活性， 酶E2b，其具有多肽序列Seq ID No. 20，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo. 20相比其中有高达25%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%的具有参照序列Seq ID No. 20的酶的酶活性， 酶E2，其具有多肽序列Seq ID No. 84，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo. 84相比其中有高达25%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%的具有参照序列Seq ID No. 84的酶的酶活性， 酶E2d，其具有多肽序列Seq ID No. 86，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo. 86相比其中有高达25%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%的具有参照序列Seq ID No. 86的酶的酶活性，以及 酶E2e，其具有多肽序列Seq ID No. 88，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo. 88相比其中有高达25%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%的具有参照序列Seq ID No. 88的酶的酶活性，以及至少一种酶E3，其选自 酶E3a，其具有多肽序列Seq ID No. 6，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq ID No. 6相比其中有高达25%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%的具有参照序列Seq ID No. 6的酶的酶活性， 酶E3b，其具有多肽序列Seq ID No. 22，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo. 22相比其中有高达25%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%的具有参照序列Seq ID No. 22的酶的酶活性， 酶E3，其具有多肽序列Seq ID No. 90，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo. 90相比其中有高达25%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%的具有参照序列Seq ID No. 90的酶的酶活性，以及 酶E3d，其具有多肽序列Seq ID No. 92，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo. 92相比其中有高达25%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%的具有参照序列Seq ID No. 92的酶的酶活性3.权利要求1或2的细胞，其特征在于它具有增加的酶组合的活性，所述酶组合选自E2、E2E3 和 E1E2E3O4.前述权利要求中至少一项的细胞，其特征在于它具有增加的酶组合E1E2E3的活性，并且η为I5.前述权利要求中至少一项的细胞，其特征在于它选自以下菌属曲霉属(Aspergillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、芽抱杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、产喊杆菌属(Alcaligenes)、乳杆菌属(Lactobacillus)、副球菌属(Paracoccus)、乳球菌属(Lactococcus)、念珠菌属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、单胞发酵菌属(Zymomonas)、耶罗威亚酵母属(Yarrowia)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、青枯菌属(Ralstonia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红杆菌属(Rhodobacter)、伯克氏菌属(Burkholderia)、梭菌属(Clostridium)和贪铜菌属(Cupriavidus)6.前述权利要求中至少一项的细胞，其特征在于它能够如同野生型那样形成具有(6至C16链长度的聚羟基链烷酸酯，特别在于它已经过遗传学修饰，从而使得与其野生型相比，它能够形成较少的聚羟基链烷酸酯7.权利要求6的细胞，其特征在于所述细胞与其野生型相比，具有降低的至少一种酶E9或Eltl的活性， 其中E9是聚羟基链烷酸酯合成酶，EC 2. 3.1.-，其具有将3-羟基链烷酰-辅酶A转化为聚-3-羟基链烷酸的能力，特别是具有多肽序列Seq ID No. 30或Seq ID No. 32，或者其具有的多肽序列与相应的参照序列Seq ID No. 30或Seq ID No. 32相比其中有高达25%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且其仍具有至少10%的具有相应的参照序列Seq IDNo. 30或Seq ID No. 32的酶的酶活性，以及 E10是3-羟基链烷酰-ACP辅酶A转移酶，其具有将3-羟基链烷酰-ACP转化为3-羟基链烷酰-辅酶A的能力，特别具有多肽序列Seq ID No. 34或Seq ID No. 36，或者其具有的多肽序列与相应的参照序列Seq ID No. 34或Seq ID No. 36相比其中有高达25%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且其仍具有至少10%的具有相应的参照序列Seq IDNo. 34或Seq ID No. 36的酶的酶活性8.权利要求5的细胞，其特征在于所述细胞选自恶臭假单胞菌(P.putida)GPpl21、恶臭假单胞菌GPpl22、恶臭假单胞菌GPpl23、恶臭假单胞菌GPpl24和恶臭假单胞菌GPpl04、恶臭假单胞菌KT42C1、恶臭假单胞菌KTOYOl或恶臭假单胞菌KT0Y029.前述权利要求中至少一项的细胞，其特征在于与其野生型相比，所述细胞中选自以下一组中的至少一种酶具有增加的活性 至少一种酶E4,即dTTP a -D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶，EC2. 7. 7. 24，特别是所述酶具有多肽序列Seq ID No. 10，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq ID No. 10相比其中有高达25%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%的具有参照序列Seq ID No. 10的酶的酶活性， 至少一种酶E5，即dTTP-葡萄糖-4，6-水解酶，EC4. 2.1. 46，特别是所述酶具有多肽序列Seq ID No. 12，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq IDNo. 12相比其中有高达25%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%的具有参照序列Seq ID No. 12的酶的酶活性， 至少一种酶E6，即dTDP-4-脱氢鼠李糖-3，5-差向异构酶，EC5. 1.3. 13，特别是所述酶具有多肽序列Seq ID No. 14，或者其具有的多肽序列与参照序列Seq ID No. 14相比其中有高达25%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%的具有参照序列Seq ID No. 14的酶的酶活性， 至少一种酶E7，即dTDP-4-脱氢鼠李糖-还原酶，ECl.1.1. 133，特别是所述酶具有多肽序列Seq ID No. 16，或者其具有的多肽序列与参照序列SeqID No. 16相比其中有高达25%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%的具有参照序列Seq ID No. 16的酶的酶活性10.前述权利要求中至少一项的细胞，其特征在于与其野生型相比，它具有增加的至少酶E8的活性，所述酶E8催化通式(I)的鼠李糖脂从细胞输送至周围介质中，其优选具有多肽序列 Seq ID No. 8、Seq ID No. 24、Seq IDNo. 26 或 Seq ID No. 28，或者其具有的多肽序列与相应的参照序列Seq IDNo. 8,Seq ID No. 24,Seq ID No. 26或Seq ID No. 28相比其中有高达25%的氨基酸基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，并且仍具有至少10%的具有相应的参照序列Seq ID No. 8,Seq ID No. 24,Seq ID No. 26或Seq IDNo. 28的酶的酶活性11.前述权利要求中至少一项的细胞，其特征在于它含有权利要求14所述的至少一种核酸或权利要求15所述的至少一种载体12.本发明的另外主题是用于生产通式(I)的鼠李糖脂的方法，所述方法包括以下处理步骤 I)使权利要求1-11中至少一项所述的细胞与含碳源的介质接触， II)在可以使细胞从所述碳源形成鼠李糖脂的条件下培养细胞，以及 III)任选地分离形成的鼠李糖脂13.利用权利要求12所述的方法获得的鼠李糖脂用于生产化妆品、皮肤制剂或药物制齐U、用于生产植物保护制剂以及用于生产护理和清洁剂以及表面活性剂浓缩物的用途14.分离的核酸，其在每种情况下都含有选自[Al-Gl]、[A2-G2]和[A3-G3]三组中的至少一个序列，其中 组[A1-G1]由以下序列组成 Ala) Seq ID No.1的序列，其中该序列编码蛋白，所述蛋白能够将3_羟基癸酰基-ACP经由3-羟基癸酰基-3-羟基癸酰基-ACP转化为3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸， Bla)无内含子的序列，其来源于Ala)的序列，并与Seq ID No.1的序列编码相同的蛋白或肽， Cla)编码包含Seq ID No. 2的氨基酸序列的蛋白或肽的序列， Dla)与组Ala)_Cla)之一的序列有至少70%相同性的序列， Ela)与组Ala)_Dla)之一的序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与所述互补链杂交的序列， Fla)通过组Ala)_Ela)之一的序列的至少一个碱基的取代、添加、倒位和/或缺失获得的衍生物，Gla)组Ala)-Fla)之一的序列的互补序列， Alb) Seq ID No. 17的序列，其中该序列编码蛋白，所述蛋白能够将3_羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烧酸， Blb)无内含子的序列，其来源于Alb)的序列，并与Seq ID No. 17的序列编码相同的蛋白或肽， Clb)编码包含Seq ID No. 18的氨基酸序列的蛋白或肽的序列， Dlb)与组Alb)-Clb)之一的序列有至少70%相同性的序列， Elb)与组Alb)-Dlb)之一的序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与所述互补链杂交的序列， Flb)通过组Alb)-Elb)之一的序列的至少一个碱基的取代、添加、倒位和/或缺失获得的衍生物,和 Glb)组Alb)-Flb)之一的序列的互补序列，以及 组[A2-G2]由以下序列组成 A2a)Seq ID No. 3的序列，其中该序列编码蛋白，所述蛋白能够将dTDP-鼠李糖和3_羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为a -L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸， B2a)无内含子的序列，其来源于A2a)的序列，并与Seq ID No. 3的序列编码相同的蛋白或肽， C2a)编码包含Seq ID No. 4的氨基酸序列的蛋白或肽的序列， D2a)与组A2a)_C2a)之一的序列有至少80%相同性的序列， E2a)与组A2a)_D2a)之一的序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与所述互补链杂交的序列， F2a)通过组A2a)_E2a)之一的序列的至少一个碱基的取代、添加、倒位和/或缺失获得的衍生物， G2a)组A2a)_F2a)之一的序列的互补序列， A2b)Seq ID No. 19的序列，其中该序列编码蛋白，所述蛋白能够将dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为a -L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸， B2b)无内含子的序列，其来源于A2b)的序列，并与Seq ID No. 19的序列编码相同的蛋白或肽， C2b)编码包含Seq ID No. 20的氨基酸序列的蛋白或肽的序列， D2b)与组A2b)-C2b)之一的序列有至少70%相同性的序列， E2b)与组A2b)-D2b)之一的序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与所述互补链杂交的序列， F2b)通过组A2b)-E2b)之一的序列的至少一个碱基的取代、添加、倒位和/或缺失获得的衍生物,和 G2b)组A2b)-F2b)之一的序列的互补序列，以及 组[A3-G3]由以下序列组成 A3a) Seq ID No. 5的序列， 其中该序列编码蛋白，所述蛋白能够将dTDP-鼠李糖和a -L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为a -L-吡喃鼠李糖基-(1-2)- a -L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸， B3a)无内含子的序列，其来源于A3a)的序列，并与Seq ID No. 5的序列编码相同的蛋白或肽， C3a)编码包含Seq ID No. 6的氨基酸序列的蛋白或肽的序列， D3a)与组A3a)_C3a)之一的序列有至少80%相同性的序列， E3a)与组A3a)_D3a)之一的序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与所述互补链杂交的序列， F3a)通过组A3a)_E3a)之一的序列的至少一个碱基的取代、添加、倒位和/或缺失获得的衍生物， G3a)组A3a)_F3a)之一的序列的互补序列， A3b)Seq ID No. 21的序列，其中该序列编码蛋白，所述蛋白能够将dTDP-鼠李糖和a -L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为a -L-吡喃鼠李糖基-(1-2)- a -L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰-3-羟基十四烷酸， B3b)无内含子的序列，其来源于A3b)的序列，并与Seq ID No. 21的序列编码相同的蛋白或肽， C3b)编码包含Seq ID No. 22的氨基酸序列的蛋白或肽的序列， D3b)与组A3b)-C3b)之一的序列有至少60%相同性的序列， E3b)与组A3b)-D3b)之一的序列的互补链杂交的序列，或者考虑到遗传密码子的简并性，会与所述互补链杂交的序列， F3b)通过组A3b)-E3b)之一的序列的至少一个碱基的取代、添加、倒位和/或缺失获得的衍生物,和 G3b)组A3b)-F3b)之一的序列的互补序列15.载体，特别是表达载体或基因过表达盒，其包含选自Seq ID No. 38,Seq ID No. 40、Seq ID No. 42,Seq ID No. 45,Seq ID No. 47和权利要求14所述的核酸中的至少一种核酸序列

本发明涉及用于生产鼠李糖脂的细胞和核酸以及其用途，并且还涉及用于生产鼠李糖脂的方法现有技术 表面活性剂目前基本上以石油化学原料为基础生产由于可预见的石油化学原料的短缺以及对基于可再生原料或生物可降解的产品增加的需求，使用基于可再生原料的表面活性剂是合适的替代选择鼠李糖脂由一个(单鼠李糖脂)或两个鼠李糖基(双鼠李糖脂)以及一个或两个3_轻基脂肪酸残基组成(参见，Handbook of Hydrocarbon and LipidMicrobiology, 2010，第3037-51页)它们具有表面活性的性能，这在各种各样的作为表面活性剂的应用中是必需的(参见Leitermann et al.，2009)目前，这些脂类利用不同的人-和动物-致病菌的野生型分离菌，特别是假单胞菌属(Pseudomonas)和伯克氏菌属(Burkholderia)的代表菌来产生(参见，Handbook ofHydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010,第 3037-51 页)这些生产生物体能够导致疾病的事实大大降低了客户对常规生产的鼠李糖脂的接受度而且，由于增加的资本支出和可能的额外工作步骤，更高的安全要求也对生产成本产生了影响尽管，借助这些生产生物体在一定程度上可以实现高产物滴定度以及高时空和/或碳收率，但这需要使用植物油作为唯一的或共同的底物(参见，Handbook ofHydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010,第 3037-51 页)然而，与其他碳源相比，植物油是相对昂贵的原料，所述其他碳源诸如例如葡萄糖、蔗糖或多糖诸如例如淀粉、纤维素和半纤维素，甘油，CO, 0)2或014而且，鼠李糖脂由于它们的表面活性剂特性区分它们自身，因为它们对发酵过程中的大量泡沫是敏感的如果应用亲脂性底物，特别会这样该问题在使用水溶性底物诸如例如葡萄糖、蔗糖、多糖(粉、纤维素和半纤维素)或甘油时会被显著缓解最后，由野生型分离菌产生的鼠李糖脂的性能仅在有限程度上被影响到目前为止，这仅通过优化工艺管理(pH、氧供给、介质组成、给料策略、氮气供给、温度、底物的选择等)发生然而，对某些产物特性诸如例如不同鼠李糖脂种类的比例(鼠李糖和3-羟基脂肪酸基的数目)或3-羟基脂肪酸基的链长度和饱和度的非常具体的影响会是可取的，以便能够调节与应用有关的产物性能如果鼠李糖脂在家用、清洁、美容、食品加工、药物、植物保护和其他应用中被大范围地用作表面活性剂，鼠李糖脂必须看起来能与目前应用的表面活性剂竞争这些是高容量化学品，其能够以非常低的成本生产，对客户没有明显的健康风险，并且具有清楚定义的和可调节的产品规格因此鼠李糖脂也必须能够以尽可能低的成本生产，对客户没有健康风险并且具有尽可能明确的性能尽管鼠李糖脂已经基于方便的碳源诸如例如葡萄糖或甘油在GRAS生物体(一般被视为安全的)中被产生，但在这种情况下这些仅仅是单鼠李糖脂(Ochsner et al. Appl.Environ. Microbiol. 1995. 61(9)3503-3506)另一方面，Chaet al.1n Bioresour Technol. 2008. 99 (7) 2192-9 描述了通过导入来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的rhlA和rhlB基因，在恶臭假单胞菌(P. putida)中生产来自大豆油的单鼠李糖脂因此，对廉价以及安全(从健康的角度)地生产具有明确的和可调节性能的单-和双鼠李糖脂存在日益增加的需求例如通过减少单鼠李糖脂富集的单独酶活性的平衡供给，可以实现这种调节然而，该调节还可以通过例如利用具有某些性能的酶来实现，所述性能例如与底物特异性相关的性能，并因此例如与并入鼠李糖脂的羟基脂肪酸的链长度相关因此，本发明的目的是提供利用安全的生产宿主从易获得的碳源生产鼠李糖脂的可能性