生产次丹参酮二烯的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用的制作方法[0002]次丹参酮二烯(Miltiradiene)是重要药用植物丹参中提取的脂溶性二萜成分，为丹参酮类化合物共同的前体物质(Wei Gao et al., 2009, Organic Letters, 11:5170-5173)。这类化合物(如隐丹参酮、丹参酮IIA、丹参酮IIB、二氢丹参酮)在抗炎，心脑血管，抗肿瘤等方面有非常好的应用前景，目前与其相关的产品中，已有复方丹参片、复方丹参滴丸等销售额上数亿人民币的王牌产品上市。注射用丹参酮IIA磺酸钠已广泛用于治疗冠心病、心肌梗死等疾病，就目前丹参酮IIA的原料市场情况来看，含量20 %的4500元/kg ;含量50%的8000元/kg ;含量为98%的高达3.6万元/kg。可见整个与丹参酮类化合物相关的产业有巨大的市场需求，经济效益也非常可观。目前丹参酮类化合物的主要来源是通过中药材丹参中直接提取，但随着开垦荒地、荒山伐林丹参野生资源的生长环境遭到严重破坏，丹参资源日趋减少；人工种植过程中也遇到品种退化，大量的土地和人力成本等因素。丹参酮类化合物产量已经远不能满足社会的需求，严重影响了丹参的临床应用和丹参酮类制药原料中间体的开发和应用，亟待需要提供新的资源途径。[0003]目前利用合成生物学的原理，设计和改造微生物菌株来生产天然产物已被国际认为是一种最有潜力的方法，如在大肠杆菌中生产紫杉醇的前体紫杉二烯已达到1000mg/L(ParayiI Kumaran Ajikumar et al.,2010, Science, 330:70-74);银杏内酯类(Ginkgolides)前体左旋海松二烯(Levopimaradiene),在改造后的大肠杆菌工程菌中达到 700mg/L 的 产量(EffendiLeonard et al.,2010, PNAS, 107(31):13654-13659);在酵母工程菌中生产青蒿素(Artemisinin)的前体青蒿酸(Artemisinic acid)最高达到IOOmg/L (Dae-Kyun Ro et al.,2006, Nature, 440:940-943);目前国内在青蒿素和紫杉醇等药物分子的生物合成方面有相关研究。[0004]次丹参酮二烯为植物丹参体内萜类合成途径的产物，由丹参细胞中线粒体、细胞溶质和内质网存在的甲羟戊酸(MVA Pathway)代谢途径与在质体中存在的丙酮酸/磷酸甘油醛(MEP Pathway)代谢途径共同合成。其中前体物质栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸(GGPP)为异戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)经过栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合酶(GGPS)催化得到，GGPP可以被丹参柯巴基焦磷酸合酶(SmCPS)和次丹参酮二烯合酶(SmKSL)共同催化为次丹参酮二烯，图1。微生物大肠杆菌中存在丙酮酸/磷酸甘油醛途径，在前面的研究中，高伟等人研究策略采用了文献报道的大肠杆菌表达系统，以商用双表达载体pACY⑶uet共同表达基因SmCPS和SmKSL，但效果不理想，只能获得了毫克级的次丹参酮二烯(Wei Gao et al.，2009，Organic Letters，11:5170-5173)。然而，作为传统发酵工艺中常用菌株:酿酒酵母，在其体内存在生产萜类成分的甲羟戊酸途径，其中产萜类成分麦角甾酉享(Ergosterol)能达到生物量的 4.6% (Arnezeder, C.et al., 1990, Biotechnollett.,12:277-282) ;二萜香叶酰香叶酰醇(GGOH)也能达到 283mg/L (Tokuhiro，K.et al.，2009，Appl Environ Microbiol.,75:5536-5543)，由此利用酵母的优化的甲羟戊酸途径生产次丹参酮二烯具有很大潜力。
[0005]本发明的一个目的是提供高产次丹参酮二烯酿酒酵母工程菌株ZD-Tans-001。[0006]本发明所提供的酿酒酵母工程菌株ZD-Tans-ΟΟΙ，其保藏号为CGMCC N0.5296。
[0007]本发明的另一个目的是提供一种基因工程菌的构建方法。
[0008]本发明所提供的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤:
[0009]在出发酿酒酵母中引入外源的柯巴基焦磷酸合酶和次丹参酮二烯合酶，得到重组酿酒酵母，记作重组酿酒酵母I。
[0010]所述方法还包括以下步骤:
[0011]在所述重组酿酒酵母I中提高3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶和萜类调控因子蛋白UPC2的活性，得到重组酿酒酵母，记作重组酿酒酵母II。
[0012]在所述重组酿酒酵母I中提高栊牛儿栊牛儿基焦磷酸合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重组酿酒酵母，记作重组酿酒酵母III。
[0013]所述方法还包括以下步骤:`[0014]在所述重组酿酒酵母III中提高3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶和萜类调控因子蛋白UPC2的活性，得到重组酿酒酵母，记作重组酿酒酵母IV。
[0015]所述方法还包括以下步骤:
[0016]克隆及人工改造萜类合成途径中功能基因:酿酒酵母3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因I (tHMGl)、酿酒酵母萜类调控因子蛋白UPC2基因(UPC2.1)、酿酒酵母栊牛儿栊牛儿基焦磷酸合酶基因(BTSl)和酿酒酵母法呢基焦磷酸合酶基因(ERG20);全人工合成嗜酸热硫化叶菌的栊牛儿栊牛儿基焦磷酸合酶基因(SaGGPSsyn)。克隆营养缺陷型筛选标记:亮氨酸营养缺陷筛选基因元件LEU2、组氨酸营养缺陷筛选基因元件HIS3、尿嘧啶营养缺陷筛选基因元件URA3 ;抗生素型筛选标记基因素(G418)抗性基因元件KanMX和潮霉素抗性基因元件hphNTl等功能元件。
[0017]所述方法还包括以下步骤:
[0018]克隆调控元件酿酒酵母的3-磷酸甘油酸激酶启动子(PGKl)、酿酒酵母的翻译延伸因子I启动子(TEFl)、酿酒酵母的乙醇脱氢酶I启动子(ADHl)、酿酒酵母的半乳糖激酶I启动子(GALl)、酿酒酵母细胞色素C终止子(CYClt)和酿酒酵母的乙醇脱氢酶I终止子(ADHlt)。
[0019]所述引入外源的柯巴基焦磷酸合酶和次丹参酮二烯合酶是通过转化入携带外源柯巴基焦磷酸合酶和次丹参酮二烯合酶基因的质粒，或在酿酒酵母染色体上整合外源柯巴基焦磷酸合酶和次丹参酮二烯合酶基因。
[0020]所述提高3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶和萜类调控因子蛋白UPC2的活性是通过转化入携带3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶和萜类调控因子蛋白UPC2基因的质粒，或在酿酒酵母染色体上整合3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶和萜类调控因子蛋白UPC2基因。[0021]所述提高栊牛儿栊牛儿基焦磷酸合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性是通过转化入携带栊牛儿栊牛儿基焦磷酸合酶和法呢基焦磷酸合酶基因的质粒，或在酿酒酵母染色体上整合栊牛儿栊牛儿基焦磷酸合酶和法呢基焦磷酸合酶基因。
[0022]所述在酿酒酵母染色体上整合基因是整合在SDNA位点。
[0023]所述携带柯巴基焦磷酸合酶和次丹参酮二烯合酶基因的质粒，复制位点为2MICR0N,筛选标记为尿嘧啶营养缺陷筛选标记URA3，柯巴基焦磷酸合酶和次丹参酮二烯合酶基因的启动子均为酿酒酵母的半乳糖激酶I启动子GAL1。
[0024]所述携带3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶和萜类调控因子蛋白UPC2基因的质粒，复制位点为2MICR0N和CEN6/ARSH4中的一种，筛选标记为亮氨酸营养缺陷筛选标记LEU2和基因素(G418)抗性筛选标记KanMX中的一种，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的启动子为酿酒酵母的乙醇脱氢酶I启动子ADH1，萜类调控因子蛋白UPC基因的启动子为酿酒酵母的翻译延伸因子I启动子TEF1。
[0025]所述携带栊牛儿栊牛儿基焦磷酸合酶和法呢基焦磷酸合酶基因的质粒，复制位点为2MICR0N和CEN6/ARSH4中的一种，筛选标记为组氨酸营养缺陷筛选标记HIS3和潮霉素筛选标记hphNTl中的一种。一种栊牛儿栊牛儿基焦磷酸合酶基因和法呢基焦磷酸合酶基因融合在一起，启动子为酿酒酵母的乙醇脱氢酶I启动子ADH1，另一种栊牛儿栊牛儿基焦磷酸合酶基因的启动子为酿酒酵母的3-磷酸甘油酸激酶启动子PGK1。
[0026]所述柯巴基焦磷酸合酶为丹参的柯巴基焦磷酸合酶。
[0027]所述次丹参酮二烯合酶为丹参的次丹参酮二烯合酶。
[0028]所述萜类调控因子蛋白UPC2为酿`酒酵母固醇调控因子蛋白UPC2的突变。
[0029]所述3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶为酿酒酵母的3-羟基_3_甲基戊二酰辅酶A还原酶I截取5’部分序列的功能蛋白。
[0030]所述栊牛儿栊牛儿基焦磷酸合酶一种为酿酒酵母的栊牛儿栊牛儿基焦磷酸合酶；另一种为密码子优化的嗜酸热硫化叶菌的栊牛儿栊牛儿基焦磷酸合酶，其编码基因为序列表中序列I所示DNA。所述法呢基焦磷酸合酶为酿酒酵母的法呢基焦磷酸合酶。
[0031]所述出发酿酒酵母为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY4742。
[0032]由所述方法构建得到的重组酿酒酵母也属于本发明的保护范围。
[0033]所述酿酒酵母菌ZD-Tans-OOl或所述酿酒酵母菌在生产次丹参酮二烯中的应用也属于本发明的保护范围。
[0034]本发明的又一个目的是提供一种生产次丹参酮二烯的方法。
[0035]本发明所提供的生产次丹参酮二烯的方法，包括以下步骤:
[0036]发酵所述酿酒酵母ZD-Tans-OOl或所述酿酒酵母，得到次丹参酮二烯。
[0037]所述发酵的温度为25°C -37°C或25°C或30°C或32°C或37°C ；
[0038]所述发酵的体系的pH值为3.0-8.0或3.0或4.0或5.0或6.0或7.0或8.0 ;
[0039]所述发酵的时间为24-168小时或24小时或48小时或72小时或96小时或120小时或144小时或168小时；
[0040]所述发酵的接种量的体积百分比为0.01% -10%或0.01%或0.3%或I %或10% ；
[0041]所述发酵的培养基由以下成分组成:[0042]酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、基因素(G418)、潮霉素
[0043]以上成分在所述发酵培养基中的浓度分别为:
[0044]酵母膏l-20g/L、蛋白胨 l_40g/L、葡萄糖 5_50g/L、G41810_500mg/L、潮霉素10_600mg/L。
[0045]本发明所构建的酿酒酵母ZD-Tans-OOl在好养氧条件下，发酵6天时可生产487.91mg/L的次丹参酮二烯。
保藏说明
菌种名称:酿酒酵母
拉丁名:Saccharomyces cerevisiae
菌株编号:ZD-Tans-OO I
保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 保藏机构简称=CGMCC
地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所 保藏日期:2011年9月28日 保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.5296



[0046]图1次丹参酮二烯生物合成途径
[0047]图2携带基因元件的质粒示意图(营养缺陷型筛选标记)
[0048]图3携带基因元件的质粒示意图(抗生素型筛选标记)
[0049]图4次丹参酮二烯GC-MS分析图A:次丹参酮二烯标准品TIC图(Rt =19.922min) ；B:样品TIC图(Rt = 19.919min) ；C:次丹参酮二烯标准品MS图；D:次丹参酮二烯样品MS图
[0050]图5菌株发酵结果:与ZD-T-OOO相关菌株
[0051]图6菌株发酵结果:与ZD-T-010及转入营养缺陷筛选标记型功能质粒相关菌株
[0052]图7菌株发酵结果 与ZD-T-010及转入抗生素筛选标记型功能质粒相关菌株
[0053]图8ZD-Tans_001菌株高密度发酵结果

[0054]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0055]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0056]实施例1、基因元件的克隆
[0057]基因元件的克隆分为以下五个步骤:
[0058](I)酵母DNA提取
[0059]挑取菌斑(Saccharomycescerevisiae BY4742)于 YPD 液体培养基(配方:1%Yeast Extract (酵母膏)，2% Peptone (蛋白腺)，2% Dextrose (葡萄糖)中，3CTC, 200rpm,培养24h。10000g，5分钟收集菌体于1.5ml离心管中，水清洗两次，菌体重悬于酵母破壁液中(25ul酵母破壁酶，470ul山梨醇缓冲液，5ul β -ME)，30°C温浴Ih后离心；菌体用500ulTENTS 缓冲液(IOmM Tris_HCl，pH 7.5 ；ImM EDTA，pH8.0 ；IOOmMNaAc ；2% triton-100 ；1%SDS)重悬，60°C水浴Ih ;酚/氯仿抽提2次；上清液加3倍体积的EtOH，1/10倍体积的3MNaAc，-20°C冰箱放置2h ; 13000g，4°C，离心lOmin，倒掉上清，沉淀用70% EtOH,洗剂沉淀2次后吹干，双蒸水溶解，_20°C保存备用。
[0060](2) PCR扩增及克隆
[0061]以酵母基因组DNA为模板，用引物列表1中引物，扩增tHMGl、UPC2、δ DNAUδ DNAl ；以质粒YES2.0DNA为模板扩增营养缺陷型筛选标记URA3 ；以质粒pRS313DNA为模板扩增营养缺陷型筛选标记HIS3 ；以质粒pRS42?NA为模板扩增营养缺陷型筛选标记LEU2 ；以质粒pRS41KDNA为模板扩增抗生素型筛选标记KanMX ；以质粒pRS42HDNA为模板扩增抗生素型筛选标记hphNTl。扩增体系为:NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP (IOmM each dNTP) lul、DNA 模板 20ng、弓丨物(IOuM)各 Iul、Phusion High-FidelityDNA Polymerase (2.5U/ul) 0.5ul、补加蒸懼水至总体积 50ul。
[0062]引物列表1
[0063]