专利名称：冻存和复苏脐带全细胞并分离和扩增干细胞的方法间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)来源于发育早期的中胚层和外胚 层，具有多向分化潜能、免疫调节和自我复制等特点，日益受到人们的关注。间充质干细胞 在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心 肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的 种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，尤其对治疗衰老和组织器官损伤修复 有很大的临床应用价值。MSC在骨髓中蕴含丰富，但随着年龄的老化，骨髓中的干细胞数目也会显著降低、 增殖分化能力亦大幅度衰退。另外，骨髓MSC移植给异体可能引起免疫反应，且提取干细胞 过程对患者的损伤性和在采集时遇到的其他问题，都直接影响了骨髓MSC的临床应用，使 得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要的问题。近期的研究显示，脐带组织中也含有间充质干细胞并且能成功分离。这种组织来 源的间充质干细胞不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且分离出来的干细胞更原 始，有更强的增殖分化能力。其免疫细胞的功能活性低，大大减低了触发免疫反应及引起移 植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单，对 产妇及新生儿无任何危害及损伤。以上原因足以令脐带间充质干细胞成为骨髓间充质干细 胞的理想替代物。但是，脐带组织例如脐带全细胞分离干细胞的方法和技术还不是完全成熟，而且 每一份脐带全细胞的处理和分离后的细胞培养都需要一定的时间和人员的消耗。因此将脐 带全细胞冻存并且在有需要的时候复苏进行培养和扩增的做法相对更符合成本效益。因 此，本领域需要一个简单和高效的脐带全细胞分离、冻存、复苏和扩增的方法，以满足医药、 科研、临床等领域的需求。
本发明的目的是解决现有技术冻存、复苏脐带全细胞方法的缺陷，提供一种简单 有效的脐带全细胞冻存的方法，以及相配套使用的冻存脐带全细胞复苏的方法，以及复苏 后间充质干细胞扩增的方法。本发明发现对脐带全细胞使用特定操作步骤的冻存、复苏以 及分离和扩增，可简单、有效地从脐带组织例如脐带全细胞分离原代间充质干细胞，并且可 以对原代间充质干细胞在冻存过程中有效地进行保护。本发明基于此发现而得以完成。因此，本发明第一方面提供了处理脐带全细胞的方法，该方法包括以下对脐带离 体新鲜组织全细胞进行分离和冻存的步骤(1)消毒和清洗用消毒液(例如酒精)对脐带组织表面进行消毒，将脐带剪开， 平铺，通过缓冲液(例如PBS缓冲液)清洗脐带组织，以减少脐带组织上红细胞；(2)消化处理将步骤(1)得到的脐带组织剪成组织块，将组织块放入消化酶溶 液(例如其非限制性地包含I型胶原酶、DMEM-F12)中，消化处理0. 5-3小时(例如1. 5小 时)，过滤清除组织块，加入间充质干细胞培养基以终止消化，然后对消化得到的细胞进行 细胞清洗；(3)配制脐带全细胞冻存液所述脐带全细胞冻存液中包含人血白蛋白和 DMS0 (二甲基亚砜)，配好的冷存液放在1°C至7°C (例如4°C )的温度条件下低温冷藏；(4)脐带全细胞冷存在0-15°C (例如1°C至7°C，例如4°C )的低温环境下，将步 骤(3)得到的全细胞冻存液加入步骤(2)得到的清洗后的细胞中以重悬细胞，然后将重悬 细胞加入冻存容器中，冻存容器放入程序降温装置，先在1°C至7°C (例如4°C)的温度条件 下低温冷藏0. 2-2小时(例如0. 5小时)，再在-10°C至_150°C (例如_80°C )的温度条件 下冷冻0. 25-3天(例如1天)，然后将冻存容器于液氮中冷冻，备用。根据本发明第一方面的方法，该方法还包括以下对冻存的脐带离体新鲜组织全细 胞进行复苏的步骤(5)冻存脐带全细胞复苏将步骤(4)冷冻的脐带全细胞从液氮中取出，解冻至 20%-70%(例如50%)冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基清洗细胞，以使冻存的脐带 全细胞复苏。根据本发明第一方面的方法，该方法还包括以下对复苏的脐带全细胞进行间充质 干细胞分离和扩增的步骤(6)细胞培养向步骤(5)得到的细胞中补加适量(例如1-6倍细胞悬液体积量) 的间充质干细胞培养基，放入培养容器，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第 2-7天(例如第3-6天，例如第4天，例如第5天)时将培养容器从培养箱中取出，补加适 量(例如0. 2-2倍细胞液体积量)间充质干细胞培养基，继续培养，在第8-11天(例如第 9天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次全换液，继续培养，往后每1-3天(例如2 天)进行一次全换液；(7)细胞传代当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40%_70%(例如60%)以后，利 用消化酶(例如TrypLe Express)将贴壁细胞脱离容器底部，离心，抽走上清液，加入充质 干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行传代并进行扩增培养，此后每1-3天 (例如每2天)换液一次，直至融合率达到70-90%(例如80%)后，即得脐带间充质干细胞， 必要时进行传代；以及任选的下列一个或多个步骤(8)对针对步骤(7)所得脐带间充质干细胞，检测以下项目的至少一项细胞活 性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；(9)将步骤(7)所得传代后的脐带间充质干细胞于液氮中冷冻，备用。根据本发明第一方面的方法，该方法包括(A)以下对脐带离体新鲜组织全细胞进行分离和冻存的步骤(1)消毒和清洗用消毒液(例如酒精)对脐带组织表面进行消毒，将脐带剪开， 平铺，通过缓冲液(例如PBS缓冲液)清洗脐带组织，以减少脐带组织上红细胞；(2)消化处理将步骤(1)得到的脐带组织剪成组织块，将组织块放入消化酶溶 液(例如其非限制性地包含I型胶原酶、DMEM-F12)中，消化处理0. 5-3小时(例如1. 5小 时)，过滤清除组织块，加入间充质干细胞培养基以终止消化，然后对消化得到的细胞进行 细胞清洗；(3)配制脐带全细胞冻存液所述脐带全细胞冻存液中包含人血白蛋白和 DMS0 (二甲基亚砜)，配好的冷存液放在1°C至7°C (例如4°C )的温度条件下低温冷藏；(4)脐带全细胞冷存在0-15°C (例如1°C至7°C，例如4°C )的低温环境下，将步 骤(3)得到的全细胞冻存液加入步骤(2)得到的清洗后的细胞中以重悬细胞，然后将重悬 细胞加入冻存容器中，冻存容器放入程序降温装置，先在1°C至7°C (例如4°C)的温度条件 下低温冷藏0. 2-2小时(例如0. 5小时)，再在-10°C至_150°C (例如_80°C )的温度条件 下冷冻0. 25-3天(例如1天)，然后将冻存容器于液氮中冷冻，备用；(B)以下对冻存的脐带离体新鲜组织全细胞进行复苏的步骤(5)冻存脐带全细胞复苏将步骤(4)冷冻的脐带全细胞从液氮中取出，解冻至 20%_70%(例如50%)冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基清洗细胞，以使冻存的脐带 全细胞复苏；(C)以下对复苏的脐带全细胞进行间充质干细胞分离和扩增的步骤(6)细胞培养向步骤(5)得到的细胞中补加适量(例如1-6倍细胞悬液体积量) 的间充质干细胞培养基，放入培养容器，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第 2-7天(例如第3-6天，例如第4天，例如第5天)时将培养容器从培养箱中取出，补加适 量(例如0. 2-2倍细胞液体积量)间充质干细胞培养基，继续培养，在第8-11天(例如第 9天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次全换液，继续培养，往后每1-3天(例如2 天)进行一次全换液；(7)细胞传代当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40%_70%(例如60%)以后，利 用消化酶(例如TrypLe Express)将贴壁细胞脱离容器底部，离心，抽走上清液，加入充质 干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行传代并进行扩增培养，此后每1-3天 (例如每2天)换液一次，直至融合率达到70-90%(例如80%)后，即得脐带间充质干细胞， 必要时进行传代；以及任选的(D)下列一个或多个步骤(8)对针对步骤(7)所得脐带间充质干细胞，检测以下项目的至少一项细胞活 性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；(9)将步骤(7)所得传代后的脐带间充质干细胞于液氮中冷冻，备用。根据本发明第一方面的方法，其中所述脐带是脐带的新鲜离体组织。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所述脐带组织是在生物安全柜内进行处理。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所述平铺的步骤是将脐带组织平铺在 培养平皿内，所述培养平皿直径为5-20cm的培养平皿，优选培养皿直径为10cm的培养平 皿。根据本发明第一方面的方法，其中所述酒精的浓度为25%_95%，优选75%。根据本发明第一方面的方法，其中所述PBS缓冲液是磷酸的钠盐和/或钾盐配制 的，其pH为5. 0-8. 0，优选pH为5. 5-76，优选pH为6. 0-7. 0。在一个实施方案中，所述PBS 缓冲液中磷酸根的浓度为0. 01-0. 5M，优选0. 02-0. 1M。在本发明下文试验中，所用PBS缓 冲液是磷酸钠盐，其中磷酸根的浓度为0.025M，pH为6. 5。需要说明的是，本发明人发现， 在上述范围内的PBS缓冲液浓度和pH值对于本发明方法的效果影响不大。根据本发明第一方面的方法，其中所述消化酶溶液是将I型胶原酶加入 DMEM-F12，通过过滤器过滤得到的，其消化酶为0. 05g-0. 5g，优选消化酶为0. 08g-0. 2g，优 选消化酶为 0. lg，其 DMEM-F12 为 50-500ml，优选 DMEM-F12 为 80_200ml，优选 DMEM-F12 为 100ml，其过滤器为5-50 u m过滤器，优选20 y m过滤器。在一个实施方案中，所述消化酶溶 液是将0. lg的I型胶原酶加入到100ml的DMEM-F12中，混匀，过滤(例如用20um过滤器 过滤)得到的。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)是将脐带组织转移至另一个细胞培养 平皿中，然后进行脐带组织剪成组织块的，所述培养平皿直径为5-20cm的培养平皿，优选 培养皿直径为10cm的培养平皿。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，组织块的大小约为0. 2-2. 5立方厘 米，优选约为0. 5-1. 5立方厘米，优选约1立方厘米的立方形块状。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，组织块大小在0. 5-1. 5立方厘米， 优选0. 5-1. 0立方厘米，特别是大小约1立方厘米时是非常优选的。尽管预期组织碎块小 有利于本发明方法的实现，然而本发明人在试验中发现在0. 2立方厘米、0. 5立方厘米、1立 方厘米三种状态下，它们对消化酶的消化处理效果基本一致，而体积大于1. 5立方厘米以 后对消化酶的消化效果有显著不利影响，该不利影响可以通过延长消化时间在一定程度上 弱化。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，消化处理的时间为0. 5-3小时，优 选1-2. 5小时，优选1. 5-2小时。本发明人发现在1-2. 5小时的消化处理时间内，对组织块 的消化处理效果是最佳的，既可保证组织块得到充分的消化处理，也能避免细胞被破坏。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，消化处理是在人体体温附近的温 度范围内进行的，优选34-40 V，优选36-38 V，优选37 °C。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，消化处理是在恒温摇床里进行的。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，过滤清除组织块是通过滤网进行 的，所述滤网为50-150 V- m滤网，优选100 u m滤网。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，终止消化的间充质干细胞培养基 是按照2:广1:2的比例加入，优选1:1的比例，所述比例为体积比。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，细胞清洗的具体步骤是离心5-15 分钟，去除上清液，加入PBS缓冲液重悬细胞，再离心5-15分钟，去除上清液。离心转速为 800-2000rpm，优选1250rpm，离心时间为优选10分钟。根据本发明第一方面的方法，其中所述间充质干细胞培养基中包含FBS、 L-Glutamine (L-谷氨酸)、Gentamicin (庆大霉素)和DMEM-F12。在一个实施方案中，所 述间充质干细胞培养基中含有10-20%的FBS。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养 基中含有约15%的FBS。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有0. 5-2%的L-Glutamine0在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约1%的L-Glutamine。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约O. 05%的Gentamicin。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约O. 05%的Gentamicin。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有80-90%的DMEM-F12。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约84%的DMEM-F12。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约15重量份的FBSJ^] I重量份的L-Glutamine、约O. 05重量份的Gentamicin和约84重量份的DMEM-F12。本发明人发现，含有约15重量份的FBSj^ I重量份的L-GlutamineJ^ O. 05重量份的Gentamicin和约84重量份的DMEM-F12的间充质干细胞培养基是特别优选的，比之于使该培养基的任一成分含量变化10%以上的配方在增加脐带组织贴壁、减短贴壁细胞从组织爬出的时间等效果方面具有显著优势。根据本发明第一方面的方法，其中所述脐带组织冻存液中包含人血白蛋白和DMSO0在一个实施方案中，所述脐带组织冻存液中含有55-95重量份的人血白蛋白。在一个、实施方案中，所述脐带组织冻存液中含有70-90重量份的人血白蛋白。在一个实施方案中，所述脐带组织冻存液中含有80重量份的人血白蛋白。在一个实施方案中，所述脐带组织冻存液中含有4-20重量份的DMS0。在一个实施方案中，所述脐带组织冻存液中含有7-15重量份的DMS0。在一个实施方案中，所述脐带组织冻存液中含有10重量份的DMS0。在一个实施方案中，所述脐带组织冻存液中含有约80重量份的人血白蛋白、约10重量份的DMS0。上述实施方案中，脐带组织冻存液中各组分含量的总和为100%。本发明人发现，含有约80重量份的人血白蛋白、约10重量份的DMSO的脐带组织冻存液(即其中人血白蛋白与DMSO的重量比是80 10)是特别优选的，比之于使该脐带组织冻存液的任一成分含量变化10%以上的配方在保护脐带组织不受冷冻过程破坏等效果方面具有显著优势。在本发明中，由于冻存液中还可能含有本领域技术人员通用的其它配液溶剂或溶质，因此上述以“重量份”表不的人血白蛋白和DMSO的量是一种相对量，其可以是晕克、克、千克等。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)所述将步骤(3)得到的全细胞冻存液加入步骤(2)得到的清洗后的细胞以重悬细胞，重悬细胞后抽取小样进行细胞计数。全细胞冻存液的加入量为细胞液体积量的1-4倍，例如2倍。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)所述低温环境为0_15°C，优选1°C至7°C，优选 4°C。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)所述冻存容器为冻存管。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)所述每一冻存容器(冻存管)中加入的重悬细胞冻存液的体积为O. 5-3ml，优选1ml。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)所述的细胞在冻存容器中的密度以确保任一细胞均有足够的DMSO提供保护为上限，所述密度是指单位空间内的细胞个体数，优选IXIO3-IXiO8每管，优选IXlO6每管。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)所述的程序降温装置是程序降温盒。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)所述的低温冷藏和低温冷冻是将程序降温装置(例如程序降温盒)放入冰箱实现的。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)所述的样本冷藏流程为在1°C至7V的温度条件下低温冷藏O. 2-2小时。在一个实施方案中，所述低温冷藏是在21至61的温度条件下。在一个实施方案中，所述低温冷藏是在3°C至5°C的温度条件下。在一个实施方案中，所述低温冷藏是在5°C的温度条件下。在一个实施方案中，所述低温冷藏时间为O. 3-1. 5小时。在一个实施方案中,所述低温冷藏时间为O. 4-1小时。在一个实施方案中，所述低温冷藏时间为O. 5小时。本发明人发现，在4°C的温度条件下低温冷藏O. 5小时是特别优选的，能够确保DMSO和脐带全细胞充分融合。上述其他冷藏温度条件和冷藏时间也能使DMSO和脐带全细胞融合，其融合效果可以满足本发明的基本需求，但4°C的温度条件下低温冷藏O. 5小时的融合效果最充分，具有明显优势。根据本发明第一方面的方法，其中步骤⑷所述的样本冷冻流程为在-10°C至-150°C的温度条件下冷冻O. 25-3天。在一个实施方案中，所述冷冻是在_30°C至_120°C的温度条件下。在一个实施方案中，所述冷冻是在_50°C至_100°C的温度条件下。在一个实施方案中，所述冷冻是在-80°C的温度条件下。在一个实施方案中，所述冷冻时间为O. 4-2 天。在一个实施方案中，所述冷冻时间为O. 8-1. 5天。在一个实施方案中，所述冷冻时间为I天。本发明人发现，在-80°C的温度条件下冷冻I天是特别优选的，比之于使该冷冻流程的任一温度、时间变化10%以上的冷冻流程在保护脐带组织不受冷冻过程破坏等效果方面具有显著优势。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)所述解冻是在恒温水浴中进行。根据本发明第一方面的方法，其中所述间充质干细胞培养基中包含FBS、L-Glutamine>Gentamicin和DMEM-F12。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有10-20%的FBS。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约15%的FBS。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有O. 5-2%的L-Glutamine。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约1%的L-Glutamine (L-谷氨酰胺)。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有O. 02-0. 1%的Gentamicin (庆大霉素)。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约O. 05%的Gentamicin。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有80-90%的DMEM-F12。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约84%的DMEM-F12。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约15重量份的FBSJ^] I重量份的L-Glutamine、约O. 05重量份的Gentamicin和约84重量份的DMEM-F12。本发明人发现，含有约15重量份的FBSj^ I重量份的L-Glutamine、约O. 05重量份的Gentamicin和约84重量份的DMEM-F12的间充质干细胞培养基是特别优选的，比之于使该培养基的任一成分含量变化10%以上的配方在增加脐带组织贴壁、减短贴壁细胞从组织爬出的时间等效果方面具有显著优势。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)所述间充质干细胞培养基是通过点滴法清洗细胞。点滴法可有效地将组织内的DMSO清洗出来，从而避免在复苏过程中细胞存活率的流失。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)所述细胞悬液与间充质干细胞培养基的体积比为1:2-1:5，优选体积比为1:3。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(6)所述培养容器为T25细胞培养瓶。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(6)所述培养箱中CO2浓度为3-7%，优选浓度为5%，培养箱温度控制在人体体温附近范围内，优选34-40°C，优选36-38°C，优选37°C。根据本发明第一方面的方法，在步骤(8)中，所述细胞活性检测是利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。根据本发明第一 方面的方法，在步骤(8)中，所述细胞污染检测利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。在一个实施方案中，所述细胞污染检测是利用病原学方法，检测细胞是否受到选自下列的一项或多项的感染乙肝两对半、丙肝、艾滋病毒、巨细胞病毒、EB 病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-l/2Ab、CMV-IgM和 EBV-IgA、TRUST。根据本发明第一方面的方法，在步骤(8)中，所述遗传病检测是利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。根据本发明第一方面的方法，在步骤⑶中，所述HLA-ABC/DR配型是检测细胞HLA-ABC/DR 表型。根据本发明第一方面的方法，在步骤(9)中，所述脐带间充质干细胞是经程序降温过程冻存于液氮中。根据本发明第一方面的方法，在步骤(9)中，所述脐带间充质干细胞存在于细胞冻存液中。在一个实施方案中，该细胞冻存液包含DMEM-F12、二甲基亚砜和人血白蛋白。在一个实施方案中，该细胞冻存液包含约65份的DMEM-F12、约10份的二甲基亚砜、约15份的人血白蛋白。在一个实施方案中，该细胞冻存液包含50%低糖DMEM培养液、40%FBS、10% 二甲基亚讽。根据本发明第一方面的方法，该方法包括以下步骤(I)消毒和清洗在生物安全柜中，用酒精对脐带组织表面进行消毒，将脐带从中间剪开，平铺在无菌IOcm细胞培养平皿上，利用PBS清洗组织，以减小组织上面的红细胞；(2)消化处理将O. Ig的I型胶原酶加入IOOml的DMEM-F12，然后用20 μ m过滤器过滤得到消化液，将步骤(I)得到的脐带组织转移至另一个IOcm细胞培养平皿中，将脐带组织剪成Icm3大小的组织块，将组织块放入已配好的消化液里，在37°C的恒温摇床里消化I. 5小时，利用IOOym滤网清除余下的组织块，按1:1的体积比加入间充质干细胞培养基(15%FBS+l%L-Glutamine+0. 05%Gentamicin+84%DMEM-F12)以终止消化，然后以转速1250rpm离心10分钟，将上清液去掉并加入PBS重悬细胞后再以转速1250rpm离心10分钟；(3)配制脐带组织冻存液所述脐带组织冻存液中包含80重量份的人血白蛋白和10重量份的DMSO (二甲基亚砜)，配好的冷存液放在4°C冰箱保存直至使用；(4)脐带全细胞冷存将2ml步骤(3)得到的冻存液加进步骤(2)得到的清洗后的细胞中以重悬细胞，抽取小量样本进行细胞计数，然后重悬细胞以每一管Iml,细胞密度I X IO6每管加入冻存管里，此过程需在4°C的低温条件下进行，将冻存管放入程序降温盒里，先在4°C的温度条件下低温冷藏O. 5小时，再-80°C的温度条件下冷冻I天，然后将冻存管于液氮中冷冻，备用。进一步地，可以包括与冻存方法配套使用的复苏方法(5)冻存脐带全细胞复苏将步骤(4)冷冻的脐带全细胞从液氮中取出，放在恒温水浴里解冻至一半冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基(其例如包含15%FBS+1%L-Glutamine+0. 05%Gentamicin+84%DMEM-F 12)进行点滴法清洗胳带全细胞。进一步地，可以包括复苏后间充质干细胞分离和扩增的方法(6)细胞培养将步骤(5)得到的细胞Iml补加6ml的间充质干细胞培养基，转移到T25培养瓶，再将T25培养瓶放进CO2浓度为5%的37°C培养箱中进行培养，培养至第5天时将T25培养瓶从培养箱中取出，补加3ml间充质干细胞培养基，继续培养，在第9天时将T25培养瓶从培养箱中取出，进行第一次全换液,继续培养,往后每2天进行一次全换液；(7)细胞传代当T25培养瓶里面的贴壁细胞融合率达到80%左右，可利用消化酶(TrypLE Express)将贴壁细胞脱离T25培养瓶底部，离心后移除上清液，并加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，接种于T25细胞培养瓶进行传代，并进行扩增培养；此后每两天换液一次直至融合率达到80%后，即得，必要时再进行传代。进一步地，可以针对以上步骤(8)所得脐带间充质干细胞，检测以下项目的至少 一项细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。进一步地，可以将以上步骤(8)所得传代后的脐带间充质干细胞于液氮中冻存，备用。进一步地，可以将传代后的细胞于液氮中冻存并记录相关胎儿信息，并进行细胞的生物学特性及多向分化潜能鉴定，以及对细胞进行分子遗传学诊断，保存细胞的所有相关数据，建立脐带干细胞的数据库并与冻存细胞进行关联。因此本发明在一个方面中，提供了建立脐带干细胞数据库的方法，其包括本发明第一方面分离和扩增脐带间充质干细胞的步骤，以及如下步骤将传代后的细胞于液氮中冻存并记录相关胎儿信息，并进行细胞的生物学特性及多向分化潜能鉴定，以及对细胞进行分子遗传学诊断，保存细胞的所有相关数据，建立脐带干细胞的数据库并与冻存细胞进行关联。此外，在本发明的第一方面，提供了对脐带全细胞冻存、复苏以及复苏后干细胞分离和扩增的方法。因此本发明第二方面提供了一种脐带间充质干细胞。根据本发明第二方面的脐带间充质干细胞，其是根据本发明第一方面任一实施方案所述方法获得的。根据本发明第二方面的脐带间充质干细胞，其细胞纯度大于90%，例如大于95%。在一个实施方案中，所述脐带间充质干细胞经3代以上传代后，细胞纯度大于90%，例如大于 95%。下面对本发明作进一步的说明。本发明所引用的文献，以及该文献中所引用的文献，它们的全部内容通过弓I用并入本文。在本发明中，本发明任一方面的任一技术方案中，其任一技术特征同样适用于本发明的任一方面的任一实施方案，只要它们不会引起矛盾，并且这种相互适用在必要时可以作适当的修改。在本发明中，术语“脐带间充质干细胞”是指来源于脐带的间充质干细胞。因此在本发明中，特别是涉及本发明的语境中，术语“脐带间充质干细胞”可以与“脐带干细胞”、“干细胞”、“间充质干细胞”互换使用，除非另有明确指明。在本发明中，术语“PBS缓冲液”或者“PBS”是指磷酸盐缓冲液。本领域技术人员熟知在本发明情形下使用的PBS的一般性配方和配制方法以及它们的一般性质例如pH值或pH范围。在本发明中，术语“脐带”是指新生儿脐带，特别是指产后4小时之内的脐带。间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(Caplan Al. Mesenchymal stem cells. JOrthop Res. 1991, 9:641-650. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC,et al. Multilineagepotential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999;284:143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很 高的感染机会；由于人体骨髓中MSC的含量极其稀少，每IO5 IO6个单个核细胞中大约只有I个，而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。起源于胚胎发育期胚外中胚层的脐带是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分。最新的研究表明脐带中含有丰富的干细胞，从脐带中分离培养出这些多能干细胞将为实验研究和临床应用开辟一个崭新而丰富的来源。现有的分离干细胞从而建立干细胞库的方法尚有诸多缺点，例如纯度不足、和/或数量不高，进而显示出这些方法尚不能满足人们的期待。例如CN 101270349A(中国专利申请号200810061267. 6，

公开日2010年4月14日)公开的题为“一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法”的发明；CN 102146359A(中国专利申请号201110005964. 1，
公开日2011年8月10日)公开的题为“从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法”的发明。这些方法在提取物的纯度和/或回收率方面是有待进一步改善的。由于脐血中含有丰富的造血干细胞，人们建立脐血库将脐血造血干细胞这一重要的生物资源储存起来，为多种血液系统疾病和免疫系统疾病提供一种治疗手段。同样脐带间充质干细胞作为一种更加重要的干细胞资源，我们运用常规的细胞冻存方法将其冷冻在-196摄氏度的深低温液氮中长期保存，建立脐带干细胞库，为日后的干细胞治疗保存种子。根据本发明的方法，脐带组织冻存液的配方和样本冷冻的流程能成功并有效的对脐带全细胞在冷冻的过程中进行保护。根据本发明的方法，利用点滴法将培养基加入复苏的冻存脐带全细胞，不但可以将全细胞中的DMSO清洗出来，还可以避免使用离心的步骤，从而避免在离心过程中细胞的流失，进而达到有效提高复苏细胞的存活率的效果。根据本发明的方法，其中间充质干细胞培养基配方能成功并有效的对脐带间充质干细胞进行体外扩增。根据本发明的方法，其中换液时间的设定缩短了贴壁细胞达到指定融合率的时间。本发明操作简单，方便实用，能有效保护冻存的脐带全细胞，避免复苏过程中细胞存活率流失，能得到大量的间充质干细胞，分化性能好，具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、神经细胞等细胞分化的能力。与现有方法的比较目前MSC主要采用手术法抽取供者骨髓或灌流法分离脐带，贴壁培养获得。该法分得细胞数量少，而且供者在取髓中和取髓后均有感染的可能。本发明成功自脐带中分离获得大量纯度较高的间充质干细胞，并运用此法建立脐带干细胞库来储备这种极具应用前景的干细胞。该法简便易行，且由于脐带与脐血一样，细胞成份较幼稚，来源广泛，方便易得，因此本发明的方法在干细胞的临床应用上将具有广泛的前景。

参考实施例I的方法进行。复苏后的脐带全细胞在培养的第12天开始有贴壁细胞出现，培养至第23天细胞融合率达到80%。实施例5、脐带全细胞冻存、复苏以及复苏后干细胞分离和扩增的方法参考实施例I的方法进行。复苏后的脐带全细胞在培养的第14天开始有贴壁细胞出现，培养至第23天细胞融合率达到80%。
实施例6、脐带MSC的传代培养及其冻存将实施例1-5任一项获得的细胞进行消化，消化后取I X IO6细胞加入到Iml细胞冻存液(含65份DMEM-F12+10份二甲基亚砜+15份人血白蛋白)中，经过程序降温最后进入到液氮罐中冻存。实施例7、脐带MSC的生物学特性鉴定I、细胞生长及其形态学特点通过实施例I和实施例6的分离培养，脐带单个核细胞培养72小时后在显微镜下可明显见到梭形贴壁细胞，10天左右会形成涡轮状细胞克隆，消化传代后会形成80%左右融合的贴壁层。培养过程中，发现这种细胞形态相对均一，增殖速度快，贴壁速度快，易被胰酶消化，传代至5-15代，其形态及生长特点亦无明显改变。2、流式细朐术鉴定MSC表面标志分别取第3、6、9、12、15代细胞，流式细胞术检测细胞表面标志，动态观察培养过程中细胞表面标志的变化。消化收集细胞，计数后取8X IO6个细胞，分装16管；PBS洗一次，1500rpm离心IOmin ;弃上清，残留100 200 μ 1，吹打混匀细胞；加入PE标记的⑶14、CD29、CD31、CD34、CD44、CD54、CD73、CD80、CD86、CD166 抗体以及 FITC 标记的 CD45、CD105、HLA-ABC, HLA-DR、UEA-I抗体各10 μ 1，并设一管为空白对照；在4°C下，避光反应30min ；PBS洗一次，1500rpm离心IOmin ;直接标记的细胞弃上清，加入200 μ I PBS吹打混匀细胞，200 μ I的1%多聚甲醛固定，置4°C待测，3天内上流式细胞仪检测。流式细胞仪检测细胞的表面标志，动态观察第3、6、9、12、15代的细胞，无明显改变。不表达造血细胞表面标志即⑶14、⑶31、⑶34 (HSPC及内皮细胞阳性)、⑶45 (白细胞阳性)、CD54 (ICAM-I)、CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2)、HLA-DR(MHC-II 类分子)持续阴性，CD29 和⑶44 (纤维蛋白和透明脂酸盐的受体，基质细胞表达)、⑶73 (即SH-3、4)、⑶105 (即SH-2)、CD166 (间充质细胞表达)、HLA-ABC (MHC-I类分子)和UEA-I (内皮细胞的表面标志)持续为阳性。经3代以上传代后，细胞成分均一，纯度在95%以上。3、流式细胞术检测脐带MSC的细胞周期细胞长至80%左右融合时，消化收集细胞约I X IO6个，PBS洗一次，加入70%的乙醇固定，4°C待测。检测时，先离心去乙醇，再用PBS洗一次，加入RNase I 500u，37°C反应30min，PBS洗一次，加入碘化丙啶(PI，终浓度50 μ g/ml) 1ml，室温避光反应20min，上机检
测细胞DNA含量。经测定第3代和第6代细胞的DNA含量，细胞周期分析，G0ZG1期、S期和G2M期所占比例分别为96. 35%,96. 66%，I. 11%,O. 09%，和2. 54%,3. 25%。结果表明体外培养的细胞具有典型的干细胞增殖特点，即只有少数细胞处于活跃的增殖期(I. 11%、0. 09%)，大部分的细胞处于静息期(96. 35%、96. 66%)。4、脐带MSC牛长曲线的绘制及对数牛长期倍增时间的测定
取对数生长期细胞，消化计数，以10%FBS的LG-DMEM培养基制成细胞悬液(2X 104/ml)，24孔板中每孔接种O. 5ml, 37°C，5%C02,饱和湿度下培养。每天取3复孔，台盼蓝染色后计数活细胞数，计算平均值，连续观察7天。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制细胞生长曲线。以Patterson公式计算细胞在对数生长期的倍增时间，即Td=Tlg2/Lg(Nt/No)，Td :倍增时间(h)，T :细胞由No增至Nt所用的时间(h)，N :细胞数。通过每天细胞计数的结果绘制细胞生长曲线，计算倍增时间。由细胞生长曲线可以看出，细胞在第2-4天处于指数生长期。根据公式计算出第5代细胞在指数生长期的倍增时间在18-30小时范围内。5、脐带MSC多向分化潜能的鉴定(I)成骨诱导 3代以上MSC，按I X IO5/孔接种六孔板，放于37°C、5%C02、饱和湿度下，MSC培养基中培养24h后，换用含10%经筛选FBS的DMEM-HG并加入地塞米松O. I μ Μ、抗坏血酸磷酸盐50μΜ、β-磷酸甘油10mM，放于37°C、5%C02、在饱和湿度下培养，每3天半量换液，共诱导2-4周。碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞形成，Von Kossa染色鉴定骨结节形成。在含10%经筛选FBS的DMEM-HG，加入地塞米松O. I μ Μ、抗坏血酸磷酸盐50 μ Μ、β -磷酸甘油IOmM培养I周，细胞形态发生明显的改变，由纺锤形的成纤维细胞样变为多角形，类似于神经元细胞样，细胞周边出现长丝状突出，并可向周围延伸。继续培养2周以上后，细胞基质中出现钙化斑，矿化物逐渐出现，并且开始形成多层小结结构，至培养4周后，可见明显钙化结节。2周时碱性磷酸酶染色呈强阳性反应，达到95%以上，而未加以诱导的对照组则大部分为阴性，只有不到5%显示为弱阳性，表明细胞已向成骨细胞转化。vonKossa染色可将骨结节中沉积的钙染成黑色，诱导组可见大量的黑色骨结节，有明显的立体结构，而对照组在任何时间都没有阳性反应。(2)成脂肪诱导3代以上MSC，按I X IO5/孔接种于六孔板，放于37°C、5%C02、饱和湿度下，在MSC培养基中培养24h后，换用含10%经筛选FBS的高糖DMEM，并加入地塞米松I μ Μ、消炎痛60 μ M、IBMX O. 5mM、胰岛素5 μ g/ml，放于37°C，5%C02，饱和湿度下培养，每3天半量换液，共诱导2周，油红染色鉴定脂滴形成。在含10%经筛选FBS的DMEM-HG，加入地塞米松I μ Μ、消炎痛200 μ M、IBMX O. 5mM、胰岛素10 μ g/ml培养3天，细胞即发生形态改变，由纺锤形的成纤维细胞样逐渐收缩变短，90%以上细胞成为立方形或多角形；连续培养7天，镜下可见细胞内有微小脂滴出现，随着培养时间的延长，脂滴逐渐增大并融合，至培养2周时，可见融合成团的脂滴充满整个细胞。油红O染色可见细胞内产生的脂肪被特异性染成红色。(3)成软骨诱导3代以上细胞，按照每管2X IO5细胞分装到15ml聚丙烯离心管，低速离心使细胞在试管中形成微团，在含2. 5%FBS的DMEM-HG中加入胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠各6. 25 μ g/ml, BSA I. 25 μ g/ml,丙丽酸纳 ImM/L,抗坏血酸憐酸 37. 5 μ g/ml, TGF- β ^Ong/ml，放于37°C、5%C02、饱和湿度下培养，每3天半量换液，连续培养2周。诱导2周后将细胞微团打散涂片，阿辛蓝(Alcian blue)染色可见II型胶原形成细胞外基质呈蓝色，对照组无蓝染。
通过以上一系列数据指标的检测，显示出应用本发明方法分离得到的MSC，具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化的能力，证实本发明方法获得的MSC具有干细胞特性。实施例8、脐带干细胞库的建立I、细胞活性的检测利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。2、细胞污染的检测利用少量细胞培养，检 测细胞是否受到真菌和细菌的污染。利用病原学方法，检测细胞是否受到乙肝两对半、丙肝、艾滋、巨细胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg, HbsAb, HBcAb,HbeAg, HbeAb, HCVAb, HIV_l/2Ab、CMV-IgM 和 EBV-IgA、TRUST 感染。3、遗传病的检测利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。4、HLA-ABC/DR 配型检测细胞HLA-ABC/DR表型，并记录在案。5、细朐来源的调杳记录胎儿及其父母的详细资料，并记录在案。
_3] 6、脐带干细胞数据库的建立 在保存正常的脐带干细胞后，建立脐带干细胞的数据库，其中包括前五项资料，并建立与冻存细胞的关联。


本发明涉及脐带全细胞分离、冻存和复苏以及复苏后干细胞分离和扩增的方法，其包括如下步骤对脐带组织进行消毒和清洗；将组织剪成块状，消化处理1.5小时；配制脐带组织冻存液备用；将消化处理得到的全细胞和冻存液加入冻存管中，在4℃的温度条件下低温冷藏0.5小时，再-80℃的温度条件下冷冻1天，然后液氮中冷冻备用；需要时将脐带全细胞从液氮中取出，恒温水浴解冻，利用间充质干细胞培养基进行点滴法清洗，复苏的脐带全细胞可通过细胞培养和细胞传代扩增间充质干细胞。本发明方法可有效保护冻存脐带组织，且方便复苏使用，尤其适合复苏后分离和扩增间充质干细胞。

公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月21日 优先权日2012年5月21日