-
专利名称
一株淀粉酶高产菌株及其改善低次等烟品质的方法
-
发明者
刘敏, 唐兴宏, 季秀玲, 林连兵, 王毅, 马永凯, 魏云林
-
公开日
2012年7月11日
-
申请日期
2011年12月22日
-
优先权日
2011年12月22日
-
申请人
红塔烟草(集团)有限责任公司
-
文档编号
C12R1/07GK102559548SQ20111043570
-
关键字
-
权利要求
1.芽孢杆菌(Bacillus,sp)属的菌株，菌株保藏号是CGMCC No. 5312，该产酶菌株从红大陈化烟叶上分离得到，是一株淀粉酶高产菌株2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus,sp)方法，其特征在于筛选是利用产淀粉酶平板筛选培养基(g/L)初步筛选产淀粉酶菌株；然后用接种环将纯培养物接入液体LB培养基中，37°C振荡培养60h，发酵液离心取上清，采用DNS法检测各发酵液中的淀粉酶活力，复筛出产淀粉酶的菌株；所述的培养基g/L为淀粉20g，蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCL 10g, pH 7. 03.使用权利要求1所述芽孢杆菌(Bacillus,sp)菌株制备淀粉酶液的方法，其特征在于将筛选菌株接种于IOml-IOOml LB液体培养基中，置于37°C恒温摇床上培养12h，转速为 150r/min ；种子液按的量接种于500ml LB培养基中，同样条件37°C，pH 7. 0条件发酵 60h，进行超滤浓缩，5000r/min离心去除菌体，上清用10，000MWC0进行超滤浓缩，即得精制的淀粉酶粗酶液；酶活测定采用采用DNS法，取酶液100 μ 1，再加入100 μ 1 1%的可溶性淀粉，37°C恒温精确反应30min，滴加400 μ 1 DNS,沸水煮沸5min显色，测定MOnm下的吸光值，以加灭活酶液的反应系统为空白；在此反应条件下定义每min生成1 μ g葡萄糖所需酶量定义为一个酶活单位(U)，经测定65号菌株粗酶液中淀粉酶的单位酶活为826U/ml4.利用权利要求3所述的发酵淀粉酶作为对初烤烟叶进行处理的方法，其特征在于将拟处理的烟叶回潮，切丝，精确称取IOOg烟丝，分为两分，一份将制备好的酶液用无菌小型喷雾器均勻喷淋烟丝，喷施量为0. 35%酶液加上9. 65%无菌水，发酵酶液的施酶量为2. 82U/g烟叶，另一份对照组用10%无菌水处理，混勻后装入自封袋内放置于室温放置 12h，然后放入90°C的烘箱中烘20-30min，在高温条件下使酶失活，然后放入恒温恒湿培养箱(22°C，55%)中平衡烟丝Mh，评吸后明显改善低次烟品质
-
技术领域
本发明涉及一株淀粉酶高产菌株，菌株保藏号是=CGMCC No. 5312，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2011年9月四日，并利用菌株发酵液对初烤烟叶进行处理的技术领域， 具体说明了利用生物淀粉酶技术改善低次烟品质的技术方法
-
背景技术
-
具体实施例方式
本发明利用从红大陈化烟叶上分离得到的产酶菌株，编号为65，经鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的菌株，菌株保藏号是(CGMCC No. 5312)37°C，pH 7. 0条件发酵60h， 进行超滤浓缩，即得淀粉酶粗酶液，酶活测定采用采用DNS法淀粉酶酶活单位(U)定义为每Imin生成1 μ g葡萄糖所需的酶量经测定，65号菌株粗酶液中淀粉酶的单位酶活为826U/ml酶液处理烟样为品质较低的云8587初烤烟叶 (B3F)，将处理的烟叶回潮，切丝，精确称取一定量的烟丝，酶的施加量为0. 35%酶液加上 9. 65%无菌水，对照用10%无菌水处理，将稀释好的酶液用无菌小型喷雾器均勻喷淋烟丝， 将烟丝混勻后装入自封袋内置于室温放置12h，然后放入烘箱中烘20-30min，高温条件下使酶失活，然后放入恒温恒湿培养箱中平衡烟丝将平衡好的烟丝卷制成烟支，由红塔集团技术中心评吸员完成评吸，采用《玉溪优质烤烟单料烟感官质量评吸方法》(云南省地方标准，标准编号DB53/T 182. 3-2006)(表 1)主要对香韵、香气量、香气质等10项进行评价，总分100分，最终以综合得分衡量感官质量水平经评吸发现，菌株65处理的烟丝均衡性较好，烟气延绵感较好，口感较舒适，杂气较轻韵、香气质、干净度、回味等都得到明显改善，杂气减轻，烟丝感官评价良好实施例1 产淀粉酶菌株的筛选及鉴定从优质玉溪优质烟叶红花大金元叶上的产酶菌株，编号为65利用产淀粉酶平板筛选培养基(g/L)(淀粉20g，蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCL 10g，pH 7.0)初步筛选产淀粉酶菌株然后用接种环将纯培养物接入液体LB培养基中，37°C振荡培养60h，发酵液离心取上清，采用DNS法检测各发酵液中的淀粉酶活力，复筛出产淀粉酶的菌株DNS法的原理淀粉在淀粉酶的作用下水解为葡萄糖，葡萄糖是还原糖，在一定条件下加热被3，5- 二硝基水杨酸氧化成糖酸及其它产物，3，5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸在一定范围内，还原糖的量和棕色物质颜色的深浅成正比例关系，在540nm波长下测定吸光值，查对标准曲线(图1)并计算，便可求出样品中葡萄糖的含量利用16S rRNA基因的一对通用引物进行PCR扩增，连接载体转化并进行测序，结果提交NCBI，通过BLAST进行序列同源性检索分析，然后用CLUSTAL X软件进行多序列比对并计算供试菌株与参比菌株之间的序列相似性，采用邻位相接法(Neighbor-Joining)， 应用MEGA4软件构建系统进化树对该菌株进行测序分析，将其初步鉴定为芽孢杆菌属 (Bacillus sp. 65)的菌株,菌株保藏号是(CGMCC No. 5312)实施例2 淀粉酶液的制备利用菌株进行发酵，制得粗酶液将筛选菌株接种于小量LB液体培养基中，置于 37°C恒温摇床上培养12h，转速为150r/min种子液按1 %的量接种于500ml LB培养基中， 同样条件发酵60h，5000r/min离心去除菌体，上清用10，000MWC0进行超滤浓缩，即得精制的粗酶液采用DNS法，取酶液100 μ 1，再加入100 μ 1 1%的可溶性淀粉，37°C恒温精确反应 30min，滴加400μ 1 DNS，沸水煮沸5min显色测定MOnm下的吸光值以加灭活酶液的反应系统为空白在此反应条件下定义每min生成Iyg葡萄糖所需酶量定义为一个酶活单位(U)经测定，65号菌株粗酶液中淀粉酶的单位酶活为826U/ml实施例3 淀粉酶对烟丝的处理及烟丝的感官质量评价处理烟样为云8587初烤烟叶(B3F)，将烟叶回潮，切丝，精确称取IOOg烟丝，将制备好的酶液用无菌小型喷雾器均勻喷淋烟丝，喷施量为0. 35%酶液加上9. 65%无菌水，65 发酵酶液的施酶量为2. 82U/g烟叶，对照用10%无菌水处理，混勻后装入自封袋内置于室温放置12h，然后放入90°C的烘箱中烘20-30min，在高温条件下使酶失活，然后放入恒温恒湿培养箱(22°C，55% )中平衡烟丝Mh将平衡好的烟丝卷制成烟支，由红塔集团技术中心评吸员完成评吸，采用《玉溪优质烤烟单料烟感官质量评吸方法》(云南省地方标准，标准编号DB53/T 182. 3-2006)(表 1)主要对香韵、香气量、香气质等10项进行评价，总分100分，最终以综合得分衡量感官质量水平评吸结果(表2)描述如下对照烟气浓度较高，丰富性好，杂气略显，回味稍差， 酸、涩，略有毛刺感，质粗糙，烟丝烟气细腻、柔绵，烟气浓度较高，对质感有改善从打分情况来看(表幻，菌株65发酵酶液处理的烟丝感官质量评价总分要比对照高出1.5分，从评吸结果看，对烟气的香气量、杂气、口感、质感都有较好的改善发酵培养基LB对香韵基本无影响，可以继续使用表1 红塔集团单体烟叶感观质量评价方法及指标
专利名称：一株淀粉酶高产菌株及其改善低次等烟品质的方法烟叶发酵是改善烟叶品质的重要工序，未经发酵处理的烟叶不能直接用于卷烟生产，只有经过发酵处理，才可以不同程度地克服新烟和低次烟的不良品质因素，减少或消除新烟带有的青色，减少刺激性和异味，使吸味和顺，增加烟叶的弹性和燃烧性。烟叶发酵过程中微生物和酶起到非常重要的作用。微生物在烟叶发酵过程中的作用与酶促反应是密不可分的，因为微生物在其生长发育过程中可以向胞外分泌不同种类的酶，这些酶可以催化烟叶中某些物质的分解或合成。在烟叶中当以淀粉形式存在的糖类含量过多时，在燃吸烟支时会影响燃烧速度和燃烧完全性，燃烧时产生糊焦气味，会使烟草香味变坏，所以淀粉含量决定着在某种程度上决定着烟叶的内在品质和吸食味的好坏。据研究我国烤烟淀粉含量比国外优质烟叶要高出3%左右。烟叶中残留的淀粉是由于采收时成熟度不够及烟叶在加工过程中淀粉的降解程度不够造成的。烟叶中淀粉的分解、转化、消耗、积累都将会对烟叶的外观及内在品质产生很大的影响。为了降低烟叶中淀粉的含量，可以利用添加外源淀粉酶的方法，以降低烟叶中淀粉的含量，提高烟叶品质。在一定条件下向烟叶中施加一定量的淀粉酶，可使烟叶总体质量得到提高。
本发明旨在提供一株淀粉酶高产菌株，利用产酶菌株发酵液改善低次等烟叶感官品质，提高低次烟的工业可用性及处理初烤烟的方法。本发明的技术方案如下1、芽孢杆菌(Bacillus, sp)属的菌株，菌株保藏号是 CGMCCNo. 5312，该从产酶菌株红大陈化烟叶上分离得到，是一株淀粉酶高产菌株。筛选是利用产淀粉酶平板筛选培养基(g/L)初步筛选产淀粉酶菌株；然后用接种环将纯培养物接入液体LB培养基中，37°C振荡培养60h，发酵液离心取上清，采用DNS法检测各发酵液中的淀粉酶活力，复筛出产淀粉酶的菌株；所述的培养基g/L为淀粉20g，蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCL 10g, pH 7. 0。将筛选菌株接种于IOml-IOOml LB液体培养基中，置于37°C恒温摇床上培养12h， 转速为150r/min ；种子液按的量接种于500ml LB培养基中，同样条件37°C，pH 7. 0条件发酵60h，进行超滤浓缩，5000r/min离心去除菌体，上清用10，000MWC0进行超滤浓缩，即得精制的淀粉酶粗酶液；酶活测定采用采用DNS法，取酶液100 μ 1，再加入100 μ 1 1 %的可溶性淀粉，37°C 恒温精确反应30min，滴加400 μ 1 DNS，沸水煮沸5min显色，测定MOnm下的吸光值，以加灭活酶液的反应系统为空白；在此反应条件下定义每min生成1 μ g葡萄糖所需酶量定义为一个酶活单位 (U)，经测定65号菌株粗酶液中淀粉酶的单位酶活为826U/ml。将拟处理的烟叶回潮，切丝，精确称取IOOg烟丝，分为两分，一份将制备好的酶液用无菌小型喷雾器均勻喷淋烟丝，喷施量为0. 35%酶液加上9. 65%无菌水，发酵酶液的施酶量为2. 82U/g烟叶，另一份对照组用10%无菌水处理，混勻后装入自封袋内放置于室温放置12h，然后放入90°C的烘箱中烘20-30min，在高温条件下使酶失活，然后放入恒温恒湿培养箱(22°C，55% )中平衡烟丝Mh，评吸后明显改善低次烟品质。本发明的具有如下优点1.直接利用烟叶上分离的淀粉酶高产菌株进行发酵，由于来自烟叶的菌株产生的酶比较适应烟叶环境，作用于烟叶上的底物，能更好的改善烟叶品质。2.本发明的发酵培养基为LB培养基，发酵时间为60小时，操作简单，易于控制，酶液处理烟叶为质量较差的云8587初烤烟叶，菌株65处理的烟叶感官质量的改善效果明显， 且发酵培养基对烟叶的吸食品质没有影响。图1本发明葡萄糖标准曲线。
本发明公开了一株淀粉酶高产菌株芽孢杆菌属65菌株(Bacillus sp.65)，以及利用发酵淀粉酶对初烤烟叶进行处理，改善低次烟品质的技术方法。淀粉酶单位酶活为806U/ml，施酶量为2.82U/g烟叶，处理后评吸结果表明烟丝烟气细腻、柔绵，烟气浓度较高，对烟气的香气量、杂气、口感、质感都有较好的改善。本方法工艺简单，成本低。
