专利名称：：一种不含抗性标记的猪霍乱沙门氏菌双基因缺失菌及其应用的制作方法技术领域：。：猪霍乱沙门氏菌(SalmonellaCholeraesuis)是引起仔猪副伤寒的主要病原之一，常引起断奶仔猪的大批发病，给养猪业带来了巨大的损失。该菌的某些株型也可通过食物链途径感染人，引起以腹泻、败血症为主要特征的沙门氏菌病，在医学及公共卫生学上亦具有十分重要的意义。疫苗免疫预防被认为是防控该病的有效手段(M0HAMEDI.HUSSEINY,MICHAELH.2008.ConstructionofhighlyattenuatedSalmonellaentericaserovarTyphimuriumlivevectorsfordeliveringheterologousantigensbychromosomal、integrationMicrobiologicalResearch,16(3),605-615.)。近年来，人们对通过基因工程技术使沙门氏菌减毒进而将减毒沙门氏菌作为疫苗的途径愈感兴趣。沙门氏菌通过基因工程的方法减毒后，其对宿主的致病性大大降低，但仍可保留良好的侵袭力(方维焕，梁雪芽，李建荣.2003.减毒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗诱导对新城疫病毒的免疫保护，中国兽医学报，23(6):527-529)。黏膜免疫与多价疫苗是未来免疫预防传染病的重要方向，以细菌为载体的重组活疫苗是最有发展前景的研究领域之一，特别是以减毒沙门氏菌作为活疫苗表达载体的研究更是受到了广泛的关注(Spreng，DietrichG，WeidingerG.2006.RationaldesignofSalmonella-basedvaccinationstrategies,Methods,38(5):133-143.)0沙门氏菌属侵袭性胞内菌，可将外援质粒DNA直接呈递给抗原递呈细胞(APC)，携带质粒DNA的细菌在APC细胞内发生溶解或以宿主吞噬小体进入胞质，并将DNA释放到细胞核，从而使抗原基因在体内进行表达，并诱导相应的细胞免疫和体液免疫反应(唐丽华，潘志明，程宁宁，等.2007.稳定携带H5亚型禽流感病毒候选DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建及其免疫原性.微生物学报，47(4):662-666；S.0.Al-Garib,A.L.J.Gielkens,E.Gruys,etal.2003.ImmnoglobulinclassdistributionofsystemicandmucosalantibodyresponsestoNewcastleDiseaseinChickens.Avi.Dis，47:32-40)，已被证明是携带外源基因的良好载体(JINH，JOHNHL.2011.EnhancementofImmuneResponsesbyanAttenuatedSalmonellaentericaserovarTyphimuriumStrainSecretinganEscherichiacoliHeat-LabileEnterotoxinBSubunitProteinasanAdjuvantforaliveSalmonellaVaccineCandidate.ClinicalandVaccineImmunology,18(2):203-209.)。以减毒沙门氏菌作为基因工程活疫苗载体具有无可比拟的优越性(JeanClaudeSirard，FlorenceNiedergang，JeanPierreKraehenbuhl.1999.LiveattenuatedSalmonellaaparadigmofmucosalvaccines，Immunologicalreviews,171(2):5-26.)。以前，人们通常将编码某种蛋白的基因克隆到一些质粒载体上，然后将其转化入某种减毒沙门氏菌中，依此途径来获得外源基因的表达。但遗憾的是，此种方法获得的重组沙门氏菌中外源抗原表达量较低，且常常遇到的另一个问题是在体内外源基因表达的不稳定。同时，该种方法获得的重组减毒沙门氏菌往往采用了携带抗性基因的表达质粒，以期作为重组菌在体内生长的主要遗传标记。近年来，出于生物安全的考虑，此类含有抗性选择系统的质粒已不再被人们所接受。质粒平衡表达系统是解决上述问题的最佳途径。其中，效果最好、应用最多的是沙门氏菌的asd+平衡表达系统(赵战勤，徐引弟，吴斌，等.2009.猪霍乱沙门氏菌AasdC500株的生物学特性及作为活疫苗表达载体的应用，25(I):29-36.)。asd基因编码的天冬氨酸3-半乳糖脱氢酶是合成二氨基庚二酸(DAP)所必需的酶，同时，DAP又是革兰阴性菌细胞壁主要化学成分肽聚糖四肽侧链的一个组分，因此，asd基因的突变株在无外源DAP条件下不能形成完好的细胞壁，最终溶菌死亡。同时，由于哺乳动物组织中不含DAP，因此突变菌在动物体内均被降解。将含有asd基因的质粒转化本发明所构建的猪霍乱沙门氏菌C7822，质粒上的asd基因可与缺失突变菌可形成互补，从而解决了突变菌不能在DAP阴性环境中生存的问题。同时，含有asd基因的质粒可以携带外源基因转化C7822，因此，C7822是潜在的携带外源基因表达的受体菌株。crp基因编码cAMP受体蛋白，其突变株影响碳水化合物的合成及菌毛和鞭毛的合成。缺失crp基因可明显降低沙门氏菌的毒力，但仍保留了其免疫原性(⑶RTISSRIII，NAKAYAMAK,KELLYSM.1989.RecombinantavirulentSalmonellavaccinestrainswithstablemaintenanceandhighlevelexpressionofclonedgenesinvivo.ImmunolInvest,18(1-4):583-596.)。本发明中的C7821缺失了crp基因，消除了毒力返强的风险，在此基础上进一步缺失了重要的营养代谢基因asd基因，得到了双基因缺失突变菌AcrpAasdC78_2。
本发明的目的在于获得一种遗传背景清晰、安全性强、无抗性标记的猪霍乱沙门氏菌AcrpAasd双基因缺失菌。本发明的第二个目的是利用猪霍乱沙门氏菌AcrpAasd双基因缺失株稳定携带和表达外源抗原基因，尤其是在体内的表达。本发明的第三个目的是利用不含抗性标记的猪霍乱沙门氏菌AcrpAasd双基因缺失菌作为含有asd基因质粒的受体菌。为了达到上述目的，本发明的技术方案采用了一种不含抗性标记的猪霍乱沙门氏菌双基因缺失突变菌，其特征在于该菌株是猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis)C7822，于2011年11月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNOM2011402。所述菌株是在已构建的猪霍乱沙门氏菌crp基因菌株C7821(SalmonellacholeraesuisC7821，其保藏号为CCTCCNOM2010102)的基础上，缺失了猪霍乱沙门氏菌的一个重要营养代谢基因asd基因。所述的猪霍乱沙门氏菌C7822能与表达asd基因的质粒形成互补表达系统。进一步地，本发明的技术方案提供了一种不含抗性标记的猪霍乱沙门氏菌双基因缺失菌株在作为外源抗原表达菌或载体菌方面的应用。本发明的基本构建方法是利用基因工程技术将猪霍乱沙门氏菌已缺失crp基因的C7821株的asd基因缺失掉，构建成缺失突变株AcrpAasdC78-2,将该新菌株命名为C7822。通过大量的生物学实验数据证明本发明制备的双缺失菌安全、高效，可用于携带外源抗原基因表达相应抗原，包括下列步骤(I)猪霍乱沙门氏菌C78_2crpasd双基因突变株的构建首先从猪霍乱沙门氏菌C78-2基因组中扩增出asd基因的上下臂片段(2112bp和2069bp)，并通过中间载体pBluescriptIISK将其克隆至自杀性质粒pRE112上，从而构建含缺失1443bpasd基因的重组自杀性质粒pREAasd。运用重组自杀性质粒介导的等位交换技术原理筛选C78-2的crpasd缺失菌株；(2)猪霍乱沙门氏菌C7822的生物学特性通过表型鉴定、遗传稳定性、生长特性研究其生物学特性；(3)猪霍乱沙门氏菌缺失菌株C7822的毒力测定通过腹腔感染6_8周龄BALB/c小鼠计算其LD50，从而评价缺失菌株C7822对小鼠的毒力情况；猪霍乱沙门氏菌缺失菌株C7822对猪的安全性评价感染4周龄断奶仔猪10头及妊娠母猪10头，从而评价缺失菌株C7822对猪的安全性；，该基因缺失株C7822丧失了合成二氨基庚二酸(diaminopimelicacid,DAP)的能力，故在DAP阴性环境中不能存活,将含有asd基因的质粒转化C7822后，质粒中的asd基因可与asd基因缺失株C7822形成互补基因，可使其恢复在DAP阴性环境中存活的能力。本发明所得到的双基因缺失株C7822遗传背景清晰、安全性强、无抗性标记，携带、表达外源抗原稳定，是一种良好的外源抗原携带载体和表达菌，具有广阔的应用前景。本发明具有以下优点(I)本发明的猪霍乱沙门氏菌双基因突变株消除了猪霍乱沙门氏菌野毒的毒力，具有安全、对免疫猪无任何不良副作用，因此，可用该菌株携带外源基因表达相应蛋白，具有潜在的、广阔的市场应用前景。(2)本发明的猪霍乱沙门氏菌双基因菌株可与含asd基因的质粒可形成互补基因，可以克服以往质粒携带外源基因不稳定的问题。(3)本发明的猪霍乱沙门氏菌双基因菌株不含抗性标记，若用于生物工程疫苗，完全符合疫苗生物安全性的要求。图I为本发明制备的转移质粒pREAasd的物理图谱；图2为本发明制备的转移质粒pREAasd构建的流程图；图3为本发明中不含抗性标记的猪霍乱沙门氏菌asd基因突变菌株AcrpAasdC78-2的PCR检测电泳图谱；图3A:AcrpAasdC78-2突变株PCR鉴定图(Pa5/Pa6)，图中M为DNAmarker(DL2,000);1为标准菌株C78-2(1803bp);2为筛选的AcrpAasdC78_2突变株(315bp);3为H2O对照；图3B:AcrpAasdC78-2突变株PCR鉴定图(Pa7/Pa6)，图中M为IKbDNAmarker;1为标准菌株C78-2对照(3717bp);2为筛选的AcrpAasdC78-2突变株(2229bp);3为pRE112质粒对照;4为H2O对照；图4为基因突变株C7822与野生菌C78-2在含和不含I%麦芽糖的麦康凯琼脂培养基上的生长情况，图4A为C78-2在含有I%麦芽糖的麦康凯培养基上；图4B为C78-2在麦康凯培养基上；图4C为C7822缺失株在含有I%麦芽糖和DAP(50ug/mL)的麦康凯培养基上；图4DC7822突变株在含DAP(50ug/mL)的麦康凯培养基上；图5为本发明中的不含抗性标记的猪霍乱沙门氏菌双基因突变菌C7822的生长特性试验结果；图6为本发明中一种不含抗性标记的猪霍乱沙门氏菌双基因突变菌C7822的遗传稳定性实验结果；图6中，A为引物Pa5/Pa6对缺失菌株AcrpAasdC78-2的PCR鉴定图，图中M:DNAmarker(DLI,000);1为H20对照；27为I、10、20、30、40和50代缺失菌株模板的扩增结果。B为引物Pa7/Pa6对缺失菌株AcrpAasdC78-2的PCR鉴定图，图中M:IKbDNAmarker;I6为I、10、20、30、40和50代缺失菌株模板的扩增结果；7为H20对照；图7为C7822-0RF5的SDS-PAGE检测，图中M:蛋白质分子质量标准；I:C7822-PYA3493对照；2_3:C7822_0RF5表达；图8为小鼠血清中表达蛋白的westernblot检测M:蛋白质分子质量标准1A组小鼠血清中表达蛋白的westernblot检测；2:B组小鼠血清中表达蛋白的westernblot检测。具体实施例方式实施例I猪霍乱沙门氏菌C78_2crpasd基因缺失菌株C7822的构建I、asd相关引物设计参照文献(徐引弟，等.猪霍乱沙门氏菌C500株AcrpAasd缺失株平衡致死载体系统的构建及鉴定.生物工程学报，2006,22(3):366-372)及http://www.ncbi.nlm.nih.rov/登录的鼠伤寒沙门氏菌LT2株的asd基因序列(GenBankNoAE006468.I)设计I条asd相关引物(见图I、表1)，用于猪霍乱沙门氏菌C78-2(购自中国兽医药品监察所国家兽医微生物保藏中心商业菌株)和双基因缺失菌株AcrpAasdC78-2的构建与鉴定。各引物均由上海生工生物公司合成。表IPCR引物权利要求1.一种不含抗性标记的猪霍乱沙门氏菌双基因缺失突变菌，其特征在于该菌株是猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis)C7822,保藏于中国典型培养物保藏中心,其保藏号为CCTCCNOM2011402。2.根据权利要求I所述的不含抗性标记的猪霍乱沙门氏菌双基因缺失菌，其特征在于所述菌株是在已构建的猪霍乱沙门氏菌crp基因菌株C7821(SalmonellacholeraesuisC7821，其保藏号为CCTCCNOM2010102)的基础上，缺失了猪霍乱沙门氏菌的一个重要营养代谢基因asd基因。3.根据权利要求I或2所述的不含抗性标记的猪霍乱沙门氏菌双基因缺失菌，其特征在于所述的猪霍乱沙门氏菌C7822能与表达asd基因的质粒形成互补表达系统。4.一种不含抗性标记的猪霍乱沙门氏菌双基因缺失菌在作为外源抗原表达菌或载体菌方面的应用。全文摘要本发明涉及一种不含抗性标记的猪霍乱沙门氏菌双基因缺失菌株SalmonellacholeraesuisC7822(其保藏号为CCTCCNOM2011402)。该菌株是在已缺失crp毒力基因的猪霍乱沙门氏菌C7821(SalmonellacholeraesuisC7821，其保藏号为保藏编号为CCTCCM2010102)的基础上缺失了猪霍乱沙门氏菌的一个重要营养代谢基因asd基因。该基因缺失株C7822丧失了合成二氨基庚二酸(diaminopimelicacid，DAP)的能力，故在DAP阴性环境中不能存活。将含有asd基因的质粒转化C7822后，质粒中的asd基因可与C7822形成互补基因，使C7822恢复了在DAP阴性环境中存活的能力。本发明所得到的双基因缺失株C7822遗传背景清晰、安全性强、无抗性标记，携带、表达外源抗原稳定，是一种良好的外源抗原携带载体和表达菌，具有广阔的应用前景。文档编号C12N1/20GK102732442SQ20111041484公开日2012年10月17日申请日期2011年12月12日优先权日2011年12月12日发明者张明亮,张春杰,李正,王慧,程相朝,赵战勤,郁川申请人:河南科技大学