专利名称：一株生产耐碱耐盐木聚糖酶的海洋绿色产色链霉菌菌株及其应用的制作方法利用廉价生物质资源生产高附加值产品是生物技术的重要研究内容。木聚糖是自然界中的一种丰富的可再生资源，是最具代表性的半纤维素成分，占半纤维素的1/3-1/2， 是除纤维素外自然界中最丰富的多糖。因此，如何利用木聚糖成为目前国内外研究的热点。木聚糖是由D-木糖主链(以β _1，4键相连)和L-阿拉伯糖分枝(α-1，2和 α -1，3相连)所组成的聚合物,与木质素和纤维素以4-0-methyl-D-glucuronic acid键相连，形成了交联复杂的结构，为降解半纤维素带来困难。目前，工业降解木聚糖常用的方法有酸法、碱法和酶法，其中酸法、碱法应用较为广泛，但酸碱水解液中含有较多的有毒物质， 对于后期微生物发酵有抑制作用；另外，采用酸法或碱法降解木聚糖，生产环保压力很大， 因此受到国家的限制，故从长期生产效果来看，酶法降解木聚糖将是未来木聚糖降解的主要的方式。木聚糖酶是木聚糖水解酶系中最关键的水解酶。木聚糖被降解时，起主要作用的酶是β-1,4-内切木聚糖酶和β-D-木糖苷酶。β-1，4-内切木聚糖酶以内切方式作用于木聚糖主链内部的β_1，4木糖苷键，其主要水解产物为低聚木糖、木寡糖、木二糖等； β -D-木糖苷酶通过水解低聚木糖、木寡糖等的非还原性末端来催化释放木糖残基。木聚糖酶在饲料工业、食品工业、造纸工业、能源工业等众多领域具有巨大的应用价值和广阔的应用前景。例如，在纸浆漂白的初始阶段，向纸浆中加入木聚糖酶可以增加纸浆的光亮度和水解度，从而减少了在后期漂白中氯化物的用量，降低了对环境的污染；在面包烘烤过程中，向面团中加入木聚糖酶，可缩短面团的发酵时间，改善面包心的弹性和硬度，增加面包的体积和比容，有效地改善面包焙烤品质；向饲料中添加木聚糖酶可以显著提高畜禽的生产性能。木聚糖酶可以破坏植物细胞壁结构，提高各种类型饲料的利用率，减少畜禽肠道疾病，增进畜禽健康，提高畜禽成活率；减少粘粪，降低空气中氨气和硫化物浓度， 减少环境污染，减少粘粪排出和脏蛋，使畜禽体重均匀。因此，伴随着人类对于可持续性发展和环境的重视，木聚糖酶在工业上的应用将更加受到人们的重视。海洋放线菌主要分布在海底沉积物、海洋生物表面以及海水中。海洋环境的特殊性造就了海洋放线菌独特的代谢方式和代谢产物。近年来人们不断从各种海洋环境中寻找到能产生具有新型作用机制的抗生素、酶制剂(蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等)、维生素 (Β12)和有机酸的放线菌。在海洋高压、低温、高盐的生命极限环境中，海洋放线菌拥有独特的代谢途径和合成能力，这不仅确保其在极端环境中生存，也提供了产生特殊代谢产物的潜力。海洋微生物生产的酶一般具有与其生存环境相关的特性，例如，耐盐性、耐高温性、适冷性等，这些特性在工业极端条件下有广阔应用前景。此外，放线菌的遗传操作简单，便于进行遗传改造，与霉菌相比更具有生物安全性。
本发明的目的在于提供一株生产耐碱耐盐木聚糖酶的海洋绿色产色链霉菌(Mll) 菌株及其应用，该菌株具有寡营养、pH、NaCl耐受性性质，可用于发酵制备耐碱耐盐木聚糖酶；上述的耐碱耐盐木聚糖酶所具有的独特酶学性质，使之可广泛应用于工业生产中。本发明涉及一株生产耐碱耐盐木聚糖酶的海洋绿色产色链霉菌(Mll)菌株，分类命名为Streptomyces viridochromogenes,所述菌株的登记入册编号为CGMCC No. 5565, 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2011年12月9日。所述海洋绿色产色链霉菌(以下省略Ml I)菌株可生产耐碱耐盐木聚糖酶，适合在造纸、饲料、食品、酿酒以及能源工业中使用。所述菌株在Bennett固体培养基上生长时，菌落为圆形，致密，经过2_3天菌落表面生长出白灰色孢子，基底为墨绿色，产生黑色色素，生长速度较快。该菌株具有较好的寡营养性、pH、NaCl耐受性，在pH值为11的极端碱性条件下，菌株依然生长良好；在1%的 NaCl中生长最佳。本发明菌株可在以木聚糖为唯一碳源的培养基中生长，所产生的发酵液具有降解木聚糖的能力。发酵7天时发酵酶活最高，可达68. 9U/ml。所述菌株所生产的木聚糖酶同时具有较好的pH稳定性、NaCl耐受性和热稳定性等特性。本发明筛选到的绿色产色链霉菌所生产的木聚糖酶，其最适PH值为6. 0，在pH5-9 的范围内维持80%以上的酶活性；最适温度为70°C，在45°C下处理60min，酶活性维持在 88%以上；在601下处理60min，酶活性维持在在75%以上；本发明中的木聚糖酶最适底物为山毛榉木聚糖，无纤维素酶活性；该木聚糖酶具有很好的NaCl耐受性，当NaCl终浓度为 lmol/L时，木聚糖酶酶活维持在86. 6%;当NaCl终浓度为2M时，残留酶活70. 4%;当NaCl 终浓度为5mol/L时，残留酶活46. 8%。本专利所描述的具有这些特性的木聚糖酶还未见报道。所述菌株所生产的木聚糖酶可降解多种农业废弃物及廉价生物质，对菊芋秸杆的降解效果最佳。此外，对海洋来源的海带纤维也具有较好的降解性能，表明该木聚糖酶在利用海洋大型海藻生产高值产品方面有应用价值。所述木聚糖酶在pH为9时，残留酶活为最大酶活性的83. 3%，表现了较好的耐碱性，且在60°C下保持较高的酶活力，能够满足造纸中的生物漂白工艺，一定程度上水解纸浆中的半纤维素，使纸张成色、硬度、质量有所提高。更重要的是，代替或部分降低了氯化物的使用量，减少对环境的污染。本发明中木聚糖酶还可应用于酿酒工业，降低物料粘度，提高淀粉的利用率，增加酒精的产率。本发明中的木聚糖酶在能源工业中也显示出巨大的应用潜力，该酶在45°C下可长时间维持较高酶活，与目前同步糖化工艺温度一致，且可降解农业废弃物中的半纤维素为单糖，供下游工艺发酵利用，产生清洁可再生能源。本发明的有益效果是该菌株分离自大连海泥样品中，2011年12月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为5565。该菌株在pH值为11的极端碱性环境下正常生长，并表现了良好的耐受寡营养的特性，能降解多种含半纤维素的生物质，包括玉米秸杆、 稻草、菊芋秸杆、海带纤维等，在利用廉价生物质资源生产生物基化学品方面具有广阔的应用前景。该菌株在最适条件下生产木聚糖酶，木聚糖酶酶活最高可达68. 9U/ml。生产的木聚糖酶具有以下性质最适pH值6. O,最适温度70°C,最适底物为山毛榉木聚糖,所产木聚糖酶无纤维素酶活性，具有良好的PH稳定性、热稳定性，且可耐受高浓度NaCl。做为一种海洋来源的酶制剂，可广泛用于造纸、食品、饲料、酿酒、能源等工业。图I是海洋绿色产色链霉菌寡营养耐受性。a.对照；b.稀释2倍；c.稀释3倍； d.稀释5倍。图2是海洋绿色产色链霉菌pH耐受性。a. pH = 5 ；b. pH = 7 ；c. pH = 9 ；d. pH = 11。图3是海洋绿色产色链霉菌NaCl耐受性。a.对照；b. I % NaCl ；c. 2% NaCl ；d. 3% NaCl。图4是海洋绿色产色链霉菌液体发酵生产木聚糖酶结果。图5是海洋绿色产色链霉菌木聚糖酶最适温度结果。图6是海洋绿色产色链霉菌木聚糖酶热稳定性结果。图7是海洋绿色产色链霉菌木聚糖酶最适pH结果。图8是海洋绿色产色链霉菌木聚糖酶pH稳定性结果。图9是海洋绿色产色链霉菌木聚糖酶NaCl耐受性结果。体，离心后重复一次清洗。2)向洗涤后的菌体中，加入100 μ L裂解液悬浮菌体，100°C煮沸15min后冷却至室温。3)加入65°C预热好的抽提液O. 5ml，轻微震荡。4)加等体积Tris饱和酹/氯仿溶液,强烈震荡lmin, 10000r/min离心5min,小心
吸取上清液，转移至干净的离心管。5)向上清液中加入等体积的异丙醇，轻轻倒转混合两次，_20°C静置2小时。6) 12000r/min 离心 5min, 70% 的乙醇洗漆一次，10000r/min 离心 5min,开口挥发至无醇味，干燥后溶于20 μ LTE缓冲液中，制得总DNA。16SrDNA序列的获得16SrDNA PCR 引物如下Pl :5，一 ATTCGGCACACAGAAAC 一 3 ‘P2 :5，一 AGAGGAGAACCGIAGAC 一 3 ‘PCR反应条件如表I所示表IPCR反应条件


一株生产耐碱耐盐木聚糖酶的海洋绿色产色链霉菌菌株及其应用，属于生物技术领域。该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为5565。该菌株在pH11的极端碱性环境下正常生长，并表现了良好的耐受寡营养的特性，能降解多种含半纤维素的生物质，包括玉米秸秆、稻草、菊芋秸秆、海带纤维等，在利用廉价生物质资源生产生物基化学品方面具有广阔的应用前景。该菌株在最适条件下生产木聚糖酶，木聚糖酶酶活最高可达68.9U/ml。生产的木聚糖酶具有以下性质最适pH值6.0，最适温度70℃，最适底物为山毛榉木聚糖，所产的木聚糖酶无纤维素酶活性，具有良好的pH稳定性、热稳定性，且可耐受高浓度NaCl。作为一种海洋来源的酶制剂，可广泛用于造纸、食品、饲料、酿酒、能源等工业。