专利名称：：用于糖尿病治疗的模板化的胰岛细胞和小胰岛细胞簇的制作方法：在美国，糖尿病病例的增加已经被称作流行性的。糖尿病是第三大疾病致死原因，仅次于心脏病和癌症成为美国公民的主要杀手。由于无法解释的原因，I型糖尿病的发生在世界上日益增加，在过去的十年中发病年龄已经下降了3-5年，所以许多儿童现在在入学以前发生糖尿病。结果是，许多糖尿病患者将在他们的大部分寿命中面临发生与I型糖尿病有关的慢性并发症的风险。由于大部分与糖尿病有关的慢性并发症的发生风险与血糖控制有关，大量注意指向新颖的疗法(诸如胰岛移植)，以改善血糖控制。在二十世纪八十年代首次尝试了胰岛移植。胰岛移植在人类中的最初成功率是令人失望的，仅5%的接受移植物的患者取得部分功能。参见Sutherland等人，Evolutionofkidney,pancreas,andislettransplantationforpatientswithdiabetesattheUniversityofMinnesota,Am.J.Surg.166:456491(1993)。失败包括，孤立的个体成功史实现了长期反转他们的糖尿病1-2年的时段，这鼓舞研究人员继续该方案来治疗糖尿病。在2000年，使用省略糖皮质激素的抑制方案(现在称作埃德蒙顿方案)，在7位糖尿病患者上成功地进行了胰岛移植。参见Ridgway等人，Pancreaticisletcelltransplantation:progressintheclinicalsetting,Treat.Endocrinol.2(3):173-189(2003)。因而，胰岛移植结果已经限制改善。参见Shapiro等人，Clinicalresultsafterislettransplantation,J.Investig.Med.49(6):559-562(2001);Balamurugan等人，Prospectiveandchallengesofislettransplantationforthetherapyofautoimmunediabetes,Pancreas32(3):231243(2006)。然而，尽管这些结果产生了乐观，仍然存在使用胰岛移植作为糖尿病的实际治疗的屏障，考虑到大多数个体需要多个移植物来实现胰岛素独立性，一个屏障是有限数目的供体器官。许多因素可能影响移植成功，包括胰岛的物理特征。约20年前，研究人员详细地描述了胰岛的大小和形状，并确定了估测胰岛体积的方法。参见Bonnevie-Nielsen等人,Pancreaticisletvolumedistribution:directmeasurementinpreparationsstainedbyperfusioninsitu,ActaEndocrinol.(Copenh)105(3):379-84(1984)多年来，由于下述几个原因，传统上已经认为大胰岛是移植部位所希望的(1)认为大胰岛的存在是良好胰消化的标志，因为胰岛可通过过度消化而破碎，和(2)使用体积来确定移植所需的胰岛的最小数目，且因为胰岛直径的倍增等同于它的体积的8倍增加，大胰岛对制品中的胰岛等效物的数目做出巨大贡献。近年来，研究人员已经将氧、葡萄糖和胰岛素在胰岛中的运输模型化。参见Dulong等人，Contributionsofafiniteelementmodelforthegeometricoptimizationofanimplantablebioartificialpancreas,Artif.Organs26(7):5S3-9(2OO2)。如果周围细胞的氧消耗速率超过氧扩散进胰岛中的速率，氧的有限运输可以扩大胰岛核心中的细胞死亡。例如，最近的研究指示，当暴露于低氧条件时，更大的胰岛表现出增加的坏死。实际上，当胰岛直径超过100-150μm时,几乎所有的β细胞死亡。参见Giuliana等人，Centralnecrosisinisolatedhypoxichumanpancreaticislets;evidenceforpostisolationischemia,CellTransplantation14767-76(2005);MacGregor等人，Smallratisletsaresuperiortolargeisletsininvitrofunctionandintransplantationoutcomes,Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.290(5):E771_779(2006)。得到的氧化性应激可以加重细胞凋亡和对移植的免疫应答。参见Bottino等人，Responseofhumanisletstoisolationstressandtheeffectofantioxidanttreatment,Diabetes53(10):2559-68(2004)。甚至在尚未发生细胞死亡的情况下，胰岛核心中的代谢速率可能降低。葡萄糖和胰岛素的迟缓运输也会降低胰岛的功能性。与在胰岛核心中包含的那些细胞相比，在胰岛内的葡萄糖梯度会造成周围细胞接触到远远更高的葡萄糖浓度。参见Kauri等人,DirectmeasurementofglucosegradientsandmasstransportwithinisletsofLangerhans,Biochem.Biophys.Res.Commun.304(2):371-7(2003)该梯度的形状与胰岛直径和葡萄糖代谢速率直接相关。增加胰岛直径会增加在胰岛内的所有平面中的该扩散和消耗屏障。为了发现生产胰岛素的β细胞的其它来源，还已经尝试在体外培养β细胞。这些方法已经聚焦于培养来自胎儿组织的β细胞，或从生产胰岛的干细胞或祖细胞衍生出这样的细胞。参见，例如Peck等人，美国专利号6，703，017;Brothers,WO93/00411(1993);Neilsen,W086/01530(1986);Zayas,EP0363125(1990);Bone等人,Microcarriers;ANewApproachtoPancreaticIsletCellCulture,InVitroVol.18,No.2Feb.(1982)。不幸的是，这样的技术通常是耗时的，且需要珍贵的胎儿组织或干细胞作为它们的来源的可用性，并产生培养的β细胞的汇合单层。因而，仍然需要使用更有效的、可利用的且可靠的技术来建立可存活的胰岛细胞。在克服构建大完整胰岛时所遇到的扩散屏障的尝试中，发明人做出了不同的尝试来在用于植入的聚合物微球上培养多个胰岛细胞层。将图IA所示的微球工程设计成在完整胰岛的大小范围内。通过使β细胞附着于微球的外表面，理论上认为，几乎不存在或不存在由扩散屏障导致的细胞死亡。使用不同的培养环境做了多种尝试，以优化所述细胞向微球的附着，包括使用极高密度的悬浮细胞。但是，该方法会快速地耗尽营养物介质，且细胞存活较差。其它技术包括这样的细胞所述细胞缓慢地“滴”在微球上以增加细胞与微球的物理相互作用，或在微重力室中共培养细胞和微球数天。尽管有些β细胞会附着于聚合物微球上，它们的分布是不均匀的，且从未一致地实现多个附着细胞层(图1Β)。
在一个实施方案中，本发明涉及一种可植入的装置，其包括基本上平面的由生物材料构成的支架，所述支架具有主表面；和以多层附着于生物材料支架的表面的单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇。所述单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇优选地衍生自成年完整胰岛。可以将细胞粘附分子(例如整联蛋白、钙粘着蛋白、选择素和免疫球蛋白)附着于支架，以促进单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇向所述支架的附着。此外，可以受控地从所述支架释放出一种或多种血管生成因子、免疫抑制剂(包括自身免疫抑制剂)、抗生素、抗氧化剂、抗-细胞因子或抗-内毒素，以提高胰岛细胞和小胰岛细胞簇的生存力。在另一个方面，所述生物材料支架是柔性的生物材料，且可以由生物相容的和/或可生物降解的聚合物构成，诸如聚(DL-丙交酯-共聚-乙交酯)(PLG)、聚乳酸(PLA)或聚(乳酸-共聚-羟乙酸)(PLGA)。在另一个方面，所述多层包含生产胰岛素的β细胞和其它胰岛细胞类型的组合。所述多层优选地是约1-2至5个细胞厚，并形成约10-50μm厚的多层。所述多层优选地具有基本上均匀的厚度，使得细胞厚度在生物材料支架的表面上变化不超过1-2个细胞。在另一个方面，从完整成年胰岛衍生出所述单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇，其中使用酶消化和/或在钙清空的培养基中培养。本发明也提供了一种形成可植入的装置的方法。具体地，提供了从完整胰岛衍生出单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇的技术(例如酶消化、钙清空或它们的组合)。另外，提供了用于附着单个胰岛细胞和/或小胰岛细胞簇的方法，所述方法包括离心细胞悬浮液，和使用细胞粘附分子来改善向支架表面的附着。在另一个方面，本发明提供了一种使用本发明的可植入装置来治疗糖尿病的方法。描述了用于植入所述装置的方法和用于治疗糖尿病的技术。在一个实施方案中，本发明是用于培养细胞的表面，所述表面包括具有基本上平面的顶部表面的基质，其中所述表面包括多个凹坑(divot)。每个凹坑包括内部底部表面和内部侧壁表面。所述底部表面是圆形的，且每个凹坑的具有100-200μm的直径(±20)和50-150μm的深度(±20)。在另一个实施方案中，本发明是一种用于培养细胞的装置，所述装置包括上述的表面，并另外包括用于支持所述平面表面的系统。所述系统形成底部表面和内部侧壁表面和内部体积，所述底部和侧壁基本上不透过液体。当使用所述装置时，将细胞和培养基分布进内部体积中。在一个优选的实施方案中，所述细胞是胰岛细胞。在另一个优选的实施方案中，所述细胞是选自下述的非胰岛细胞干细胞、细胞培养系、新鲜分散的细胞或原代细胞。在另一个优选的实施方案中，所述细胞是胰岛细胞，且所述凹坑具有100μπι(±20%)的直径和60μm(土20%)的深度。在另一个实施方案中，本发明是一种用于培养细胞的方法，所述方法包括将细胞引导至包括多个凹坑的表面，其中每个凹坑具有100-200μm的直径(±20%)和50-150μm的深度(±20%)，并将所述装置暴露于细胞培养条件。在一个优选的实施方案中，所述细胞是胰岛细胞，且所述细胞在暴露于所述装置和支持性培养条件以后再聚集成小胰岛。在一个优选的实施方案中，所述细胞以每I个凹坑大约20-150个细胞的比率沉降在凹坑中。在另一个优选的实施方案中，已经从胰岛培养物分散所述细胞，且将非天然分子工程设计成得到的小胰岛。在另一个优选的实施方案中，所述非胰岛细胞选自干细胞、细胞培养系、新鲜分散的细胞或原代细胞。在另一个实施方案中，本发明是一种用于测试多个细胞样品对导入的化学品的反应的方法，所述方法包括下述步骤(a)在包括多个凹坑的装置中培养细胞，其中每个凹坑具有100-200μm的直径(±10%)和50-150μm的深度(±10%)，(b)将测试化学品引导至每个凹坑，和(c)分析所述细胞对所述测试化学品的反应。在另一个实施方案中，本发明是分离的胰岛群体，其中所有胰岛中的至少80%具有低于90μm的直径，且其中所述胰岛具有比天然大胰岛低的扩散屏障。优选地，所述胰岛具有比天然小胰岛和大胰岛高的细胞生存力，且胰岛的胰岛素生产特征在于，水平是天然的分离的胰岛大于10倍。在一个优选的实施方案中，大多数胰岛是球形的。在一个优选的实施方案中，所述胰岛包含胰腺α细胞、胰腺β细胞和胰腺δ细胞。在一个优选的实施方案中，所述胰岛中的至少85%是可存活的。在一个优选的实施方案中，所有胰岛中的至少80%具有小于50μm的直径。在一个优选的实施方案中，所述胰岛中的至少50%具有小于·37μm的直径。在一个优选的实施方案中，与分离自天然小胰岛或天然大胰岛的β细胞相t匕，所述胰岛β细胞生产更大量的胰岛素。本专利或申请文件含有至少一幅彩色绘制的图。在请求并支付必要的费用后，含有彩图的该专利或专利申请公开文本的复制件将由美国专利和商标局提供。图IA和B解释了以前在微球聚合物上培养β细胞的尝试，所述微球聚合物用于植入患者中。在该照片中，显示了附着于用聚氨基葡糖聚合物包被的PLGA微球上的细胞的不均匀分布。在长期温育β细胞以后，仅可以得到部分细胞单层。图2的图对比了培养的大鼠大胰岛(大于125μm)、小胰岛(小于125μm)和分散的β细胞的随时间而变化的细胞生存力。在第3天以后，大胰岛的降低的生存力是统计上显著的(Ρ〈0·05)ο图3Α和B总结了小胰岛(小于125μm)或大胰岛(大于125μm)向糖尿病大鼠中的移植的结果。当使用小胰岛时，在约80%的时间内观察到向血糖正常的成功恢复，但是当移植大胰岛时，移植物没有成功地恢复正常血糖水平。通过证实在移植后60天每组动物的血糖水平，可以最好地解释该现象。接受大胰岛的动物在移植后仍然是高血糖的，而接受小胰岛的大鼠是血糖正常的。*指示0.01的显著差异。图4是在移植后约8周从肾囊取出的胰岛移植物，并针对胰岛素进行免疫标记。左图的照片显示了使用小胰岛(小于125μπι)时相对更多的胰岛素免疫标记(红色)和在移植物中建立的毛细管网络。相比而言，大胰岛(大于125μπι)的移植物表现出极微小的胰岛素免疫标记和显著的纤维化(右图)。所述照片是4只不同动物的代表。图5显示了为了鉴别β细胞用双硫腙染色的大鼠小胰岛细胞簇。因为为极端薄的Z切片设置共焦孔，在亚基内、但是低于焦点平面的细胞是模糊的，且没有显示红色。但是，共焦平面向那些细胞的调节指示，它们也显然被双硫腙染色。图6(图Α)显示了使用酶促分散从完整成年胰岛制备的小胰岛细胞簇的活/死染色。该小胰岛细胞簇具有大约40μm的直径。在图6的右上图(图B)中，显示了用钙清空的培养基培养完整胰岛所衍生出的小胰岛细胞簇。所述小胰岛细胞簇被展开或打开，所以培养基能够环绕簇中的细胞。在图6(图C)中，显示了使用钙清空和酶促分散衍生出的小胰岛细胞簇。片段的直径是大约15μπι。图6(图D)显示了通过钙清空和酶消化的组合、随后手工移液所衍生出的单个胰岛细胞。红色指示死细胞，绿色的细胞是活细胞。在图B中的比例条适用于图A-C。图7是根据本发明生产贴剂的示意图，所述贴剂具有与其附着的胰岛细胞多层。图8是β细胞向㈧聚氨基葡糖(Mw=IOOkDa)和⑶层粘连蛋白的附着的光学显微照片。插图显示了在层粘连蛋白上的β细胞的光学和荧光显微照片，其中用细胞色素B(cytochB,绿色)进行肌动蛋白染色。图9显示了当将胰岛细胞铺层在由50:50ALGA_羧基(5.5kDa)制成的聚合物贴剂上时的结果。使用共焦显微镜，光学地观察所述贴剂的断面。提供照片，以得到显示的Z断面切片。上图解释了具有一层或两层细胞的贴剂，然后添加显示的额外细胞层。通过将它们在板式离心机中在约3500rpm离心约10分钟，将细胞铺层在支架上。在重复冲洗以后，所述层仍然附着于聚合物支架上。图10的示意图描绘了具有凹坑的微型模具(micro-mold)的一般设计。在该实施例中，PDMS是构成微型模具的外壳的材料，且蚀刻的玻璃是在其中蚀刻凹坑的基质。图11的显微照片显示了微型模具中的空凹坑的俯视图；这里描绘的凹坑的图案是微型模具设计B的代表。图12是由面形测定器产生的图，其解释了单个凹坑的深度和所述凹坑的圆底形状。图13的示意图解释了用于微型模具生产的台架。微型模具的组件和用于构建微型模具的台架是[I]大铜管；[2]小铜管；[3]PDMS聚合物，其构成容纳具有凹坑的表面的系统；[4]扁平的表面，诸如被包围在铝箔中的大玻璃正方形，其用作在上面构建所述微型模具的基质；[5]微型模具外壳的垂直壁；[6]微型模具的基质，在这里显示为达到2mm的深度；和[7]蚀刻的玻璃，它是具有凹坑的基质。图14的显微照片显示了在第2和5天在微型模具的凹坑内的胰岛细胞再聚集。图15的显微照片显示了与凹坑区域邻近的、具有凹坑的基质的未形成凹坑的边缘；凹坑含有小的再聚集的胰岛细胞，但是落在未形成凹坑的表面上的那些细胞已经再聚集成大的巨型胰岛(mega-islets)。图16的显微照片显示了聚集在可商业得到的平板的孔的边缘处的活胰岛细胞；胰岛细胞的再聚集不象在微型模具中一样是球形的，所述再聚集的胰岛细胞群远远大于在微型模具中形成的90μm胰岛。图17A和B的一组示意图显示的微型模具的2种可能的凹坑图案；图17A是这样的设计其中凹坑彼此靠近，当尝试使在单个微型模具中形成的再聚集体的数目最大化时，这是有用的；图17B是这样的设计其中凹坑彼此隔开，当操作单个凹坑中的细胞处理时，这是有用的。图18的显微照片显示了被包含在单个凹坑内的2个再聚集的胰岛。图19A和B的一组显微照片显示了在再聚集的胰岛中的生存力染色；红色指示死细胞。图19A表明，再聚集在微型模具内的胰岛含有非常少的死细胞，在上边的胰岛中仅一个死细胞被染色，而在下边的胰岛中没有细胞死亡的证据。图19B显示了在微型模具的未形成凹坑的表面上形成的巨型胰岛，其中在视图的共焦平面中存在至少23个死胰岛细胞。图20的图将天然小胰岛和天然大胰岛的生存力与再聚集的胰岛进行了对比。所有胰岛取自同一只大鼠，并将一部分分离的胰岛分散成胰岛细胞用于再聚集。在第5天，从微型模具取出再聚集的胰岛，并将所有胰岛暴露于活/死生存力染料。在再聚集的胰岛中的活细胞百分比高于天然的大或小胰岛。图21显示了在微型模具凹坑中再聚集以后6天的2个代表性的胰岛，它们已经经过三重染色，以鉴别β细胞(绿色)、α细胞(红色)和S细胞(蓝色)。上边的胰岛测得43χ55μm的直径(在X和Y方向测量)，下面的胰岛测得48x65μm的直径。图22显示了在微型模具凹坑中形成的第6天再聚集的胰岛，其已经经历针对胰岛素(绿色)和胰岛素原(红色)的染色。该胰岛具有45x54μm的直径(在X和Y方向测量)O图23的图描绘了暴露于不同的葡萄糖条件的3类胰岛中的胰岛素分泌。将天然小胰岛和在微型模具凹坑中再聚集的胰岛暴露于低葡萄糖条件(3mM);收集分泌进培养基中的胰岛素，并定量，如Y轴所示。将天然小胰岛、天然大胰岛和在微型模具凹坑中再聚集的胰岛暴露于高葡萄糖条件(20mM);收集分泌进培养基中的胰岛素，并定量，如Y轴所示。图24的示意流程图解释了使用本发明的微型模具来再聚集最佳地限定尺寸的胰岛的一般方法。图25的示意流程图解释了本发明的微型模具用于高处理量药物试验的一种示例性用途。图26显示了在含有2-[N-(7-硝基苯基_2_氧杂_1，3_二唑_4_基)氨基]_2_脱氧-D葡萄糖(2-NBDG;20mM)的培养基中的再聚集的胰岛。圆圈指示胰岛的位置。2-NBDG(一种荧光葡萄糖类似物)完全掺入每个再聚集的胰岛中。图27显示了负印章(negativestamp)(由金属或SU-8制成)的设计,其可以用于建立生物聚合物模具。终产物具有与在玻璃模具中建立的那些类似的凹坑。图28A和B解释了这样的负印章设计其包括标记，以鉴别每个凹坑在每个微型模具的凹坑区域内的位置。如图28A所示，可以以比玻璃蚀刻方法高的精确度为凹坑底部设计不同的形状。图28B显示了最终的生物聚合物模具的一部分，其含有具有区分标记的凹坑。图29A和B对比了具有大约相同尺寸的2个胰岛。图29A是球形再聚集的胰岛的一个实例。图29B描绘了天然小胰岛。2个胰岛的形状、大小和光滑的囊样外缘是类似的。具体实施例方式A.一般描述在本说明书中引用的所有专利申请、专利和出版物通过引用整体并入本文。在不一致的情况下，以本公开内容(包括定义)为准。本文使用的术语“朗格汉斯岛”或“胰岛”表示，胰腺中的一组专门化的细胞，所述细胞生产和分泌激素。胰岛通常含有一种或多种下述细胞类型(I)生产胰高血糖素的α细胞，所述胰高血糖素会升高血液中的葡萄糖(糖)的水平；(2)生产胰岛素的β细胞；(3)生产生长激素抑制素的S细胞，所述生长激素抑制素会抑制体内的众多其它激素的释放；(4)生产胰腺肽的PP细胞；(5)分泌血管活性肠肽的Dl细胞；或(6)分泌胰泌素、促胃动素和P物质的EC细胞。本文使用的术语“胰岛细胞”表示在胰岛中发现的任意细胞。在本发明中使用的胰岛细胞优选地是生产胰岛素的β细胞与其它胰岛细胞类型的组合。本文使用的术语“小胰岛细胞簇”或“胰岛片段”表示，结合到一起的胰岛细胞集合，通常在簇中含有小于约25个胰岛细胞。小胰岛细胞簇优选地具有这样的形态其使得簇内的任意细胞的(例如营养物、氧、葡萄糖等的)扩散屏障不超过约7个细胞。通常，所述扩散屏障是小于约5个细胞，且可以低至4、3或2个细胞。“小胰岛细胞簇”优选地包含β细胞作为优势细胞类型，且可以任选地包括一种或多种其它胰岛细胞类型。所述小胰岛细胞簇可以具有多种形状(例如，通常是球形的、伸长的或以其它形状不对称的)。小胰岛细胞簇的实例显示在图5和6(A)、6(Β)和6(C)中。优选地，通过分散从供体胰腺分离出的完整的更大的胰岛而衍生出“小胰岛细胞簇”。本文使用的术语“天然胰岛”表示从动物胰腺衍生出的胰岛。天然胰岛可以表征为，具有大于125μm、优选地大于150μm的直径的“天然大胰岛”,或具有小于125μm的直径的“天然小胰岛”。本文使用的术语“巨型胰岛”表示具有大于约300μm的直径的再聚集的胰岛。本文使用的术语“成年完整胰岛”表示从成年哺乳动物胰腺衍生出的天然大胰岛或天然小胰岛，其中所述胰岛已经被分离。本文使用的术语“分散的胰岛细胞”表示细胞悬浮液，优选地如下衍生出破碎大胰岛，使得胰岛细胞均匀地分布在悬浮液中。优选地，悬浮液中不小于90%的胰岛细胞是单个细胞，其它胰岛细胞形成双联体(结合到一起的2个细胞)和三联体(结合到一起的3个细胞)和非常少的彼此结合的更大的细胞集合。本文使用的术语“再聚集的胰岛”表示结合到一起的胰岛细胞集合，其优选地如下衍生出将大胰岛破碎成单个胰岛细胞，并将那些单个胰岛细胞一起成群地培养，以形成胰岛。优选地，单个胰岛细胞再聚集成胰岛会受到微型模具中的凹坑的物理尺寸的影响。用于形成再聚集的胰岛的单个胰岛细胞的数目取决于所述胰岛产物的希望大小。本文使用的术语“扩散屏障”表示，分子从高浓度区域(例如，在细胞外的氧或葡萄糖浓度)向低浓度区域(例如，在细胞内的氧或葡萄糖浓度)的运动的抑制。大胰岛表现出相对较高的氧扩散屏障，这会限制它们的生存力和移植实用性。在微型模具中再聚集的胰岛比天然大胰岛更小，并表现出相对较低的扩散屏障，这会促进在再聚集的胰岛内的细胞生存力。本文使用的术语“细胞生存力”表示，基于总细胞样品，活的或死的细胞的量的量度。本文定义的高细胞生存力表示这样的细胞群其中所有细胞中的大于85%是可存活的，优选地大于90-95%，且更优选地，通过高细胞生存力表征的群体含有超过99%的可存活的细胞。本文使用的意图接触生物流体或组织(诸如通过植入或移植进受试者中)的材料称作“生物材料”。希望的是，生物材料会诱导所述材料和生理环境之间的最小反应。在下述情况下，认为生物材料是“生物相容的”:在放入生理环境中以后，存在微小的炎症反应，没有过敏反应的证据，且在生物材料表面上存在最小限度的细胞生长。在植入宿主哺乳动物中以后，生物相容的生物材料不会引起足以有害地影响微囊功能的宿主反应；这样的宿主反应包括在生物材料上或周围的纤维变性结构的形成，生物材料的免疫学排斥，或有毒的或热原性的化合物从生物材料中释放进周围的宿主组织中。本文使用的术语“蚀刻”表示，使用酸在基质中建立凹坑的化学过程。本文使用的术语“凹坑”是指，在基质中的局限性的孔或室，其包括底部表面和侧壁(即挖空的空间，其具有宽度和深度)。在一个实施方案中，为了胰岛的再聚集，凹坑具有小于100μm的直径和小于60μm的深度。例如，所述凹坑可以具有80μm的直径和48μm的深度。在其它实施方案中，在希望再聚集胰岛的情况下，所述凹坑具有80-120μm的直径和48-72μm的深度。为了其它目的，诸如培养用于药物试验的微型肿瘤，最佳凹坑具有100-200μm的直径和60-100μm的深度。本文使用的术语“具有凹坑的基质”表示，已经被修饰成含有分散的单个凹坑的固体支持物或任意材料。本文使用的术语“微型模具”表示，具有由多个凹坑构成的表面的装置，其中所述凹坑具有100-200μπι的直径。微型模具中的凹坑的物理图案可以由微型模具的生产商指定。所述微型模具优选地包含2个主要部分i)具有凹坑的基质，和ii)用于容纳具有凹坑的基质并在其中含有细胞和培养基的系统。所述微型模具用于引导或决定置于其中的细胞的生长或再聚集。本文使用的术语“模具外壳”表示这样的结构所述结构用于支持具有凹坑的基质和加入其中的任意液体和细胞材料。本文使用的术语“外壳支架”表示，在构建所述微型模具的过程中，用于支持和影响材料形式的临时框架。本文使用的术语“溅射”是指，用于将薄膜包衣沉积在基质上的气态沉积方法。B.附着成多层的胰岛细胞在一个实施方案中，本发明涉及一种生产用于植入的可存活的单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇的方法。在一个方面，分离自非胎儿供体胰腺的单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇以多层附着于合适的生物材料支架的表面。在一个方面，单个胰岛细胞(优选地β细胞)附着于生物材料支架上。在另一个方面，不同胰岛细胞类型的组合附着于生物材料支架上。在另一个方面，由2、3、4、5、6、7、8、9或10个细胞构成的小胰岛细胞簇附着于生物材料支架上。在另一个实施方案中，1_2、3、4或5层胰岛细胞的多层附着于生物材料支架上。在所述生物材料支架上的胰岛细胞和小胰岛细胞簇形成约10-50μm厚、最优选约20-40μm厚的细胞多层。在一个方面，所述胰岛细胞多层优选地具有基本上均匀的厚度，使得细胞厚度在生物材料支架的表面上变化不超过1-2个细胞。在一个方面，所述单个胰岛细胞和/或小胰岛细胞簇直接地分离自供体成年受试者的胰腺，并从完整胰岛中分离出。适合将所述胰岛分成单个细胞和/或小胰岛细胞簇的方法包括酶消化和基于金属的分散(钙清空)或它们的组合。在另一个方面，所述生物材料支架由这样的材料构成所述材料会提供合适的单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇向所述支架的附着。预见到，不同类型的材料(包括无机和有机材料)可以用作本发明的生物材料支架。这些材料的非限制性实例包括聚(原酸酯)、聚(酸酐)、聚(磷酸酯)、聚(磷腈)和其它。其它非限制性的材料包括，例如，多糖、聚酯(诸如聚(乳酸)、聚(L-赖氨酸)、聚(羟乙酸)和聚(乳酸-共聚-羟乙酸))、聚(乳酸-共聚-赖氨酸)、聚(乳酸-接枝-赖氨酸)、聚酸酐(诸如聚(脂肪酸二聚体)、聚(富马酸)、聚(癸二酸)、聚(羧基苯氧基丙烷)、聚(羧基苯氧基己烷)、这些单体的共聚物等等)、聚(酸酐-共聚-酰亚胺)、聚(酰胺)、聚(原酸酯)、聚(亚氨基碳酸酯)、聚氨酯、聚(有机磷腈)、聚(磷酸酯)、聚(乙烯醋酸乙烯酯)和其它酰基取代的醋酸纤维素和它们的衍生物、聚(己内酯)、聚(碳酸酯)、聚(氨基酸)、聚(丙烯酸酯)、聚缩醛、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(苯乙烯)、聚(氯乙烯)、聚(氟乙烯)、聚(乙烯基咪唑)、氯磺酸酯化的聚烯烃、聚氧化乙烯、共聚物、聚苯乙烯和它们的混合物或共聚物)。在某些优选的方面，生物材料包括多糖、海藻酸盐、羟丙基纤维素(HPC)、N异丙基丙烯酰胺(NIPA)、聚乙二醇、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯亚胺、聚氨基葡糖(CS)、甲壳质、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸软骨素、明胶等和它们的衍生物、共聚物及混合物。其它合适的生物材料包括在下述文献中描·述的那些尼龙、透明质烷、聚四氟乙烯、聚乙烯基甲酰胺和其它材料=Vats等人，Scaffoldsandbiomaterialsfortissueengineering:areviewofclinicalapplications,Clin.Otolaryngol.AlliedSci.28(3):165-72(2003);Wang等人，Anencapsulationsystemfortheimmunoisolationofpancreaticislets,Nat.Biotechnol.15(4):358-62(1997);Orive等人,Cel!encapsulation:promiseandprogress,Nat.Med.9(1):104-7(2003),它们通过引用并入。在优选的方面，所述生物材料支架由可生物降解的材料构成。合适的可生物降解的生物材料包括聚(DL-丙交酯-共聚-乙交酯)(PLO)、聚乳酸(PLA)或聚(乳酸-共聚-羟乙酸)(PLGA)。PLG是一种经过充分研究的用于药物递送的聚合物，并被FDA批准用于多个体内用途。参见Berkland等人，FabricationofPLGmicrosphereswithpreciselycontrolledandmonodispersesizedistributions,J.Control.ReleaseMay18，73(1):59-74(2001),它通过引用并入。在另一个方面，所述生物材料支架全部或部分地包有包衣，所述包衣会增加胰岛和β细胞附着。示例性的包衣包括纤连蛋白、聚乙二醇乙酸酯、层粘连蛋白、聚乙烯醇(PVA)、乙烯-马来酸交替共聚物(PEMA)和聚氨基葡糖(CS)。所述支架也可以具有附着于其上面的一种或多种胰岛细胞粘附分子(“CAM”)，以促进单个细胞向所述支架的附着和/或小胰岛细胞簇向所述支架的附着。在其它用途中，以前已经证实CAM会促进细胞向用于组织工程的聚合物的附着(Dunehoo等人，Celladhesionmoleculesfortargeteddrugdelivery,J.Pharm.Sci.95:1856-1872(2006))。细胞粘附分子(CAM)包括，但不限于整联蛋白(例如，3>3、&>5、^^-1、￥1^-4)、钙粘着蛋白(例如，E-、P-和N-钙粘着蛋白)、选择素(例如，E-、L-和P-选择素)、免疫球蛋白超家族(例如，ICAM-I、1CAM-2、VCAM-I和MadCAM-I)、细胞外基质蛋白(例如，纤连蛋白、玻璃体结合蛋白、纤维蛋白原、胶原、层粘连蛋白和vonWillebrand因子)、线性和环状细胞粘附肽和衍生自RGD肽、ICAM-I肽、VCAM-I肽、钙粘着蛋白肽和LFA-I肽的肽拟似物。CAM是组织再生、细胞形态、移位、有丝分裂、胞质分裂、吞噬作用和维持细胞极性的必需分子。CAM是存在于细胞表面上的糖蛋白，其起细胞-与-细胞和细胞-与-细胞外基质(ECM)附着的受体的作用。以前已经证实，细胞粘附分子(诸如R⑶肽)可以帮助组织工程、组织再生、伤口愈合、再建性外科手术、神经再生、骨移植和器官移植的过程。另外，已经证实，E-钙粘着蛋白在β_细胞附着中是重要的(Hauge-Evans等人，Pancreaticbeta-cell-to-beta-cellinteractionsarerequiredforintegratedresponsestonutrientstimuli:enhancedCa2+andinsulinsecretoryresponsesofMINEpseudoislets,Diabetes,48:1402-1408(1999))。在一个方面，所述细胞粘附分子使用共价键锚定在所述聚合物上，所述共价键包括、但不限于肽、硫醚、二硫化物或酯键。可以将间隔分子添加在细胞粘附分子和所述聚合物之间，以允许在所述聚合物上的粘附分子和在细胞表面上的细胞附着受体之间的自由相互作用。将不同细胞附着于布满R⑶肽的聚合物上的研究已经证实，就细胞表面受体对RGD肽的最佳识别而言，聚合物和RGD肽之间的最佳间隔物是约11-46埃。所述间隔物可以由下述材料制成，但不限于聚乙二醇(PEGS)、聚氨基酸(例如，聚-Gly、聚-Lys、聚-Ala)、聚氨基己酸(聚-Aca)和2种或3种氨基酸重复的组合(例如，聚-Aca-Gly)。除了共价键以夕卜，可以如下附着所述细胞粘附分子首先将可以吸附进贴剂的聚合物网络中(例如静电地、疏水地或通过其它非共价相互作用)的细胞粘附分子附着到所述聚合物上，然后附着所述胰岛细胞。在另一个方面，所述生物材料支架具有促进所述单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇向它的表面的附着的形状。所述支架通常具有基本上平面的表面，诸如在贴剂或圆盘上的表面。在所述优选的实施方案中，所述生物材料支架包含基本上平面的柔性贴剂材料。所述生物材料支架具有适合附着单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇的尺寸。例如，在一个方面，所述平面贴剂通常具有约0.2-3厘米量级的尺寸。所述贴剂的厚度通常是约50μm至I厘米的量级。在另一个方面，所述生物材料支架可以受控地释放一种或多种生长因子、免疫抑制剂、抗生素、抗氧化剂、抗-细胞因子、抗-内毒素、T-细胞附着阻滞剂、血管生成因子、营养物或它们的组合。示例性的生长因子包括，表皮调节素、表皮生长因子(“EGF”)、内皮细胞生长因子(“ECGF”)、成纤维细胞生长因子(“FGF”)、神经生长因子(“NGF”)、白血病抑制因子(“LIF”)和骨形态发生蛋白_4(“BMP-4”)、肝细胞生长因子(“HGF”)、血管内皮生长因子-A(“VEGF-A”)、胆囊收缩素八肽、胰岛素-样生长因子和甚至胰岛素本身。通常参见Miao等人，Invitroandinvivoimprovementofisletsurvivalfollowingtreatmentwithnervegrowthfactor,TransplantationFeb27;81(4):519-24(2006);Ta等人,Thedefinedcombinationofgrowthfactorscontrolsgenerationoflong-termreplicatingisletprogenitor-likecellsfromculturesofadultmousepancreas,StemCells,Mar23(2006);Johannson,Isletendothelialcellsandpancreaticbeta-cellproliferation:studiesinvitroandduringpregnancyinadultrats,EndocrinologyMay;147(5):2315-24(2006)，EpubJan26(2006);Kuntz等人,Effectofepiregulinonpancreaticbetacellgrowthandinsulinsecretion,GrowthFactorsDec23(4):285-93(2005);Vasadava,Growthfactorsandbetacellreplication,Int.J.Biochem.CellBiol.38(5-6):931-50(2006)，EpubAug31Review(2005);Kuntz等人，Cholecystokininoctapeptide:apotentialgrowthfactorforpancreaticbetacellsindiabeticrats,J0P,Nov10;5(6):464-75(2004)。示例性的免疫抑制剂是众所周知的，且可以是留体类或非留体类。优选的留体类试剂是泼尼松。优选的非留体类试剂包括在所谓的埃德蒙顿方案中的那些西罗莫司(雷帕鸣，Wyeth-AyerstCanada)、他克莫司(Prograf,FujisawaCanada)和抗-IL2R达珠单抗(赛尼哌，RocheCanada)。其它免疫抑制剂包括15-脱氧司加林、环孢菌素、雷帕霉素、雷帕鸣(西罗莫司/雷帕霉素)、FK506或利索茶碱(LSF)。可用于实践本发明的示例性抗生素包括、但不限于阿莫西林、青霉素、磺胺药物、红霉素、链霉素、四环素、克拉霉素、ciproflozacin、特康唑、阿奇霉素等等。各种抗氧化剂是本领域技术人员众所周知的。特别优选的是包括硫醇基团的分子，诸如还原的谷胱甘肽(GSH)或它的前体、谷胱甘肽或谷胱甘肽类似物、谷胱甘肽单酯和N-乙酰基半胱氨酸。其它合适的抗氧化剂包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、维生素Ε、ΤιΙοχ、硫辛酸、拉扎洛依、丁羟基茴香醚(BHA)、维生素K等等。例如，可以使用在约2至约IOmM的浓度范围内的谷胱甘肽。参见，例如，美国专利号5，710，172,5,696，109和5，670,545。合适的抗-细胞因子是本领域众所周知的，且包括二甲基硫脲(约10mM)、西替沃酮(约5mM)、普伐他汀钠(PRAVACH0L，约20mg/kg)、L-NG-单甲基精氨酸(L-NMMA，2mM)、乳铁蛋白(约100μg/ml)、4-甲基泼尼松龙(约20μg/ml)等等。抗-内毒素也是本领域已知的，且包括L-Ne-单甲基精氨酸(L-NMMA，约2mM)、乳铁蛋白(约100ug/ml)、N-乙酰基半胱氨酸(NAC，约ImM)、腺苷受体拮抗剂诸如苄胺茶碱(茶碱)和抗-脂多糖化合物诸如棘霉素(约IOnM)等等。在另一个方面，将T-细胞附着阻滞剂提供给含有胰岛细胞的植入的生物聚合物，以抑制免疫反应。这些阻滞剂的添加会预防胰岛移植的排斥。已经证实，T-细胞附着阻滞剂会抑制器官移植和自身免疫疾病中的T-细胞活化和免疫应答(参见Yusuf-Makagiansar等人,inhibitionofLFA-1/1CAM-1andVLA-4/VCAM-1asatherapeuticapproachtoinflammationandautoimmunediseases,MedicinalChemistryReviews22，146-167(2002);AndersonandSiahaan,TargetingICAM-1/LFA-Iinteractionforcontrollingautoimmunediseases:Designingpeptideandsmallmoleculeinhibitors,Peptides24，487-501(2003))。T-细胞附着阻滞剂包括、但不限于(a)针对ICAM-ULFA-UB7、⑶28、⑶2和VLA-4的单克隆抗体，(b)可溶性的蛋白和它的片段诸如ICAM-I、VCAM-I、MadCAM-I，(c)RGD肽和肽拟似物，(d)VCAM-1肽和肽拟似物，(e)ICAM-1肽和肽拟似物，和(f)LFA-I肽和肽拟似物。另外，已经证实，衍生自谷氨酸脱羧酶65(GAD65)和GAD双功能肽抑制剂(GAD-BPI)的肽(例如GAD2(I8_217)会诱导免疫耐受性并抑制T-细胞的胰岛浸润(胰岛炎)。已经证实，GAD2Q8_217在非肥胖糖尿病(NOD)小鼠中会阻断攻击β细胞的T-细胞的活化，这通过在T-细胞APC相互作用过程中调节TCR-MHC-Ag复合物形成(Signal-I)而实现(Tisch等人，InductionofGAD65_specificregulatoryT—cellsinhibitsongoingautoimmunediabetesinnonobesediabeticmice,Diabetes47:894-899(1998))。优选的GAD-BPI包含与LFA-I肽的一部分相连的GAD2(I8_217(序列EIAPVFVLLE-[Ac-G-Ac-G-Ac]-ITDGEATDSG)，且已经被证实会在NOD小鼠中阻断T-细胞活化和胰岛炎，如在下述文献中所述Murray等人，标题为“Signal-1/signal_2bifunctionalpeptideinhibitors”的公开的美国专利号2005/0107585，它通过引用并入。因而，这些分子可以共同施用，以预防胰岛移植物的排斥。这些分子也可以经由控释机制来递送，以预防胰岛移植物的排斥。因而，可以将所述分子捕集在所述生物材料支架内，然后使β细胞附着所述支架。使用在下述文献中阐述的方案，可以实现这样的试剂的控释=Raman等人，Modelingsmall-moleculereleasefromPLGmicrospheres:effectsofpolymerdegradationandnonuniformdrugdistribution,J.Control.Release.Mar2;103(I):149-58(2005);Berkland等人，PrecisecontrolofPLGmicrospheresizeprovidesenhancedcontrolofdrugreleaserate,J.Control.Release.Jul18;82(I):137-47(2002);Schwendeman,RecentadvancesinthestabilizationofproteinsencapsulatedininjectablePLGAdeliverysystems,Crit.Rev.Ther.DrugCarrierSyst.19(1):73-98(2002);Sershen等人，Implantable,polymericsystemsformodulateddrugdelivery,Adv.DrugDeliv.Rev.5;54(9):1225-1235(2002),它们都通过引用并入。C.在凹坑化的微型模具上生产胰岛本发明也涉及可存活的小胰岛的体外生产方法。在一个方面，将分离自非胎儿供体胰腺的分散的胰岛细胞成群地放入微型模具的单个凹坑中，并培养以形成再聚集的胰岛，所述胰岛的形状和尺寸都受凹坑尺寸的影响。所述微型模具的凹坑具有适合形成小胰岛的大小。例如，在一个方面，所述微型模具通常具有直径在约30-35mm量级的尺寸，但是该尺寸不受生产方法的限制，且可以放大至30x30cm。所述凹坑通常具有直径在约100-200μm(±20%)和深度在60-100(±20%)μπι量级的尺寸。优选地，为了生产胰岛，所述凹坑具有100μm(土20%)的直径和60μm(土20%)的深度。在另一个方面，所述微型模具可以用于制备适合移植或体外研究的最佳地成形的且设定大小的胰岛群体。例如，在一个方面，在微型模具中产生的胰岛群体具有50μm或更小的平均直径。在其它方面，所述群体的特征在于至少85%的可存活的细胞、优选地大于90%或95%的可存活的细胞，更优选地所述群体的特征在于大于99%的可存活的细胞。在另一个方面，在微型模具中产生的胰岛群体可以以高胰岛素分泌水平为特征。例如，在微型模具中再聚集的小胰岛的特征在于，与天然小胰岛相比，更大的胰岛素分泌水平，优选地多了超过20倍的胰岛素分泌，更优选地多了超过100倍的胰岛素分泌。例如，再聚集的胰岛测得大约10ng/IE的分泌，如图23所示。这是来自Crim等人(2010)的最佳计算值的41倍。对比实验室之间的胰岛素分泌数据的一个困难是，许多研究人员没有报道单位胰岛体积的胰岛素分泌。在Crim等人的情况下，他们报道了每50个胰岛的胰岛素分泌，但是没有指示所述胰岛的平均大小。因而，仅仅可以假定，它们的50个胰岛各自等同于以前定义的I胰岛当量(IE)的胰岛体积。我们的实验室总是报道通过除以IE而关于胰岛和细胞的总体积标准化的胰岛素分泌。利用关于Crim论文所做的假定，与Crim等人报道的最佳条件相比，本文所述的再聚集的胰岛响应于高葡萄糖而释放出超过40倍的胰岛素。在本发明的一个实施方案中，所述微型模具将用于建立可用于体外测试和其它体外用途的细胞。在该实施方案中，所述微型模具表面优选地由玻璃制成，模具侧壁(外壳系统)由PDMS制成。在另一个实施方案中，建立可植入的且由生物相容的材料制成的微型模具。在该实施方案中，优选的材料是以前描述的任意数目的生物聚合物。在另一个方面，将所述微型模具凹坑设计成为非胰岛细胞提供最佳的物理再形成条件。预见到，可以在本发明的凹坑中形成不同类型的细胞。非限制性实例包括，长神经元途径、肾小球样滤器、血管、替换胞室等。干细胞或重新程序化的细胞在小的界限清楚的形状(诸如微型模具)中的聚集，也是本发明的适当用途。优选的细胞类型包括这样的细胞其中3-D结构对于细胞功能而言是重要的。一般而言，图24是显示本发明的方法的示意图。将取自胰腺或其它胰岛源的天然大胰岛簇分散成单个胰岛细胞，并加载到具有凹坑的微型模具上。“分散的细胞”是指，大多数(通常至少90%)的细胞是单个细胞，更少比例的细胞结合到一起成为双联体或三联体。以导致分散的细胞群体沉降到每个凹坑中的方式，将分散的细胞放入所述微型模具中。优选地，30-150个细胞沉降在每个凹坑中。实施例5公开了一种将胰岛分散成单个细胞并在微型模具中温育所述细胞的优选方法。优选地，所述解离是在KU糖尿病研究实验室(KUDiabetesResearchLaboratory)中配制的培养基混合物中。该混合物包括9份不含钙-镁的汉克平衡盐溶液和I份木瓜蛋白酶(50单位/ml)。相比而言，使用胰蛋白酶或除了木瓜蛋白酶以外的酶，实现大部分胰岛解离。所述解离在37°C在旋转下进行。最后，如下将胰岛分散成单个细胞手工地抽吸它们，并用血球计数器观察，直到至少90%的细胞分离成单个细胞。实施例5也公开了用于在所述微型模具中再聚集胰岛细胞的优选条件。一般而言，所述细胞保持作为单个细胞或松散附着的细胞群体至第2天，如图14所示。但是，在第5天或第6天之前，在凹坑中的那些相同细胞已经重组成3D结构，所述结构经常是球形(例如参见图18-19A和21)。通常，在第5天之前，再聚集的胰岛可以耐受从模具中取出，并作为独立的胰岛起作用。在该时段内，所述细胞呈现天然胰岛的三维形状。在所述凹坑中形成的胰岛的平均直径小于50μπι。实施例5描述了在所述微型模具中形成的小胰岛的形态性质。在本发明的一个实施方案中，可以将以低浓度分散的细胞加入所述微型模具中，使得少至2或3个细胞落入每个凹坑中，并使得在凹坑内的细胞能够生长和分裂。以此方式在凹坑中培养的细胞团的形状和大小会受所述凹坑的物理尺寸的影响。优选地，给微型模具加载浓缩的胰岛细胞，使得少至2或3个胰岛细胞占据每个凹坑，其中胰岛细胞生长和聚集在一起，以形成小胰岛，优选地具有30-40μm的直径。在本发明的另一个实施方案中，可能希望在再聚集时将化学品或生物分子掺入工程设计的胰岛中。这些分子包括生长因子、细胞因子、趋化因子、DMARD(缓解疾病的抗风湿性药物)、抗炎药和抗生素。可以将增加在移植部位处的氧张力的分子或微型装置掺入再聚集的胰岛中，特别当使用可植入的微型模具基质时。可以在再聚集时添加的其它非限制性的分子类别包括用于诱导胰岛素释放的药物、小分子、肽、蛋白、抗体(例如针对CDlla、CDllb、CDllc、CD18)和核酸(例如DNA或RNA)。通常可以在加载进所述微型模具中时将这样的分子掺入胰岛中。将所述分子加入含有分散的细胞的培养基中，使得它们在聚集过程中被细胞摄入或附着于细胞上。或者，可以在再聚集之前，经由标准的转染方法修饰所述细胞，这会导致用户的靶蛋白的生产增加或减少。在形成再聚集体以后，用携带化学品诸如免疫抑制剂或其它目标分子(诸如生长因子)的生物聚合物包囊新形成的胰岛。或者，使用可植入的微型模具，可以用候选分子浸溃所述模具。可以将本发明的方法设计成形成细胞聚集体，用于随后的移植或用于药物或装置测试。实施例5描述了用于再聚集移植和药物筛选所用的细胞的优选方法和实现该目的的优选方法。在另一个方面，本发明也涉及一种用于高处理量筛选药物、化学品或其它小分子的方法。预见到，在本发明的微型模具中的凹坑的图案和尺寸可以设计成适应每个凹坑中的单个插入。在另一个方面，从适合移植进动物宿主中的生物聚合物，制备所述凹坑化的微型模具。我们预见到，再聚集进可植入的微型模具中的细胞可以附着或未附着于具有凹坑的基质上。对于体外工作，非粘附的基质表面(诸如玻璃)是优选的。但是，对于可植入的模具或生物聚合物贴剂，粘附基质会增加移植过程的效率，减少移植过程中和以后的胰岛损失。已经测试了所述细胞向生物聚合物的附着，并描述在表I和图8中。本发明的其它方面以及附带的优点和新颖的特征将在下面的描述和实施例中部分地阐述，且在本领域技术人员审查下述内容以后会部分地显而易见，或可以从本发明的实践中获知。借助于在所附的权利要求中具体地指出的手段和组合，可以实现和获得本发明的目标和优点。实施例I:胰岛的大小影响生存力和移植成功本实施例研究了胰岛大小如何影响在大鼠中的移植成功。在该实施例中，描述了用于分离胰岛的技术，并测量了细胞生存力。移植了大胰岛(大于125μπι)和小胰岛(小于125μπι)，以便评估胰岛大小对移植成功的影响。如下面讨论的，小的大鼠胰岛在体外功能和体内移植结果方面优于大胰岛。这些实验也描述在MacGregor等人，Smallratisletsaresuperiortolargeisletsininvitrofunctionandintransplantationoutcomes,Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.May;290(5):E771_9(2006)中，它通过引用整体并入。大鼠胰岛分离为了分离大的和小的胰岛，通过腹膜内注射氯胺酮和赛拉嗪的混合物，麻醉成年雄性DA大鼠。暴露腹腔，并夹住与肠相连的胰腺导管。经由胆总管，在原位给胰腺插入套管，并通过将冷的胶原酶溶液抽入导管中进行扩张。以450U/ml，将胶原酶(CLS-1,WorthingtonBiochemicalCorp,Lakewood,NJ)溶角军于20mlLeibovitzL15中。随后，切离扩张的胰腺，转移至50ml离心管，并在轻轻翻转下在37°C培养箱中温育约20-30分钟。在温育以后，轻轻摇动所述试管，以逐出胰岛。将所述试管的内容物放入含有10%新生小牛血清的稀释的冰冷的汉克平衡盐溶液(“HBSS”)中。在Ixg沉降消化物，并去除上清液。加入更多的HBSS/血清，并重该过程。使洗涤的消化物穿过500微米不锈钢筛，并在冷冻离心机中在300xg沉降约I分钟。将沉淀物与IOmLI.110克/mL的Histopaque(密度=1.1085,SigmaDiagnosticsInc.,St.Louis,Missouri)相混合，并在800xg离心10分钟。梯度收集胰岛漂浮物，并分别沉降，然后放入含有10%胎牛血清的Ham氏F12培养基中，并放入含有5%C02的37°C培养室中。产率为了产率测量，检查每批胰岛的一式三份样品，每份样品包含大约2%的胰岛级分。计数单个胰岛，并测量它们的直径。对于不规则形状的胰岛，在胰岛的不同位置做3-4次直径测量，并使用平均值。计算胰岛体积，并转化成样品和整个胰岛级分的胰岛当量。将小胰岛定义为，与具有约125μm或更大直径的大胰岛相比，具有小于约125μm的直径的那些。为了使小胰岛与大胰岛分离，将新鲜的胰岛或培养过夜的胰岛沉降，然后放入l-2mlL15培养基中。然后在5%BSA于L15中的单阶梯度中，使所述胰岛快速地分层。在Ixg沉降经验地设定的时间段，直到在试管的底部观察到大胰岛。在此时，抛弃顶部的2毫升(不含有BSA)梯度，小心地取出除了底部2ml以外的全部，以限定小胰岛群体。将沉降的胰岛和在底部2毫升中的那些组合成大胰岛级分。如果必要的话，重复所述梯度，以优化大和小胰岛的分离。沉降最终的胰岛级分，并放入Ham氏F12和无葡萄糖的RPMI1640(葡萄糖=5mM)的1:1混合物中培养，直到进行葡萄糖灵敏度实验。牛存力为了测试生存力，将胰岛放入500μI体积的含有活/死荧光团、Sytox(MolecularProbes,IμΜ)和I丐黄绿素(MolecularProbes,O.5μΜ)的L-15培养基中，并在37°C温育约15-30分钟。用由下述物质(mM)组成的磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗胰岛137NaCl、2.7KC1、4.3Na2HP04和I.4KH2P04、pH7.4,并放入位于糖尿病研究实验室中的OlympusFluoview300共焦显微镜上的Attofluor室(MolecularProbes)中。使用40X或60X物镜，获取照片。在从培养基中取出胰岛的20分钟内，收集所有照片。使用He:Ne和氩激光，收集每个胰岛的3个同时照片和第三个明视野照片。如图2所示，在仅4天以后，维持在培养物中的不论人的还是大鼠的大完整胰岛(大于125μπι)通常表现出显著百分比的坏死的(12.6%)和细胞凋亡的(6.3%)细胞，细胞死亡随时间增加。更小的胰岛(小于125μπι)表现出延长的生存力，但是在更晚的时间点(超过I周)仍然表现出急剧的细胞死亡。跟踪这些小胰岛的生存力最多I周，并发现，它们维持99-86%的高生存力百分比。这与10个完整的大胰岛形成对比，所述大胰岛在培养几天以后具有下降至低于50%的生存力水平。如图2所示，单个地分散的胰岛细胞在培养物中维持与小完整胰岛类似的高生存力特性。通过鉴别在所述视野中的胰岛，并包围目标区域，完成活/死分析。从所有照片中减去背景荧光。通过使用Phot0Shop(Adobe)从目标视野中形成色调直方图，并计算绿色色调(活的)和红色色调(死的)中的总像素，计算生存力百分比。将代表活细胞除以总胰岛面积的比率计算为活的百分比值。使用Scion软件计算胰岛直径和周长，使得可以根据胰岛的大小分类生存力值。移棺研究还研究了胰岛大小对移植成功的影响。在所述实验中，通过腹膜内地注射链脲霉素(65mg/kg)(I次注射)，在受体动物中诱导糖尿病。当血糖水平大于250mg/dl连续3天时，认为大鼠患有糖尿病。用戊巴比妥45mg/kg麻醉大鼠。将大鼠剃毛并用聚维酮碘擦洗清洁以后，在左侧腹上在体壁中制作切口。将肾递送进伤口中，并在肾囊中制作小切口。使用小内径移液器，将大或小胰岛放在所述囊下面。将所述肾放回原始位置，并用创伤夹封闭切口。在胰岛移植后3天，给受体施用牛/猪锌-胰岛素(NPI-IIletinI)注射剂(2次/天)，以减少高血糖症对新移植的胰岛的应激。结束大的或小的大鼠胰岛的移植(n=10移植/组)。链脲霉素诱导的糖尿病的DA大鼠在肾囊下接受大的(大于150μm)或小的(小于125μm)同源胰岛的边缘块(1000IE)。监测血糖水平8周。图3(A)和3(B)显示了来自每组的前5次移植的结果。所有大胰岛受体在移植后保持高血糖(10/10)。相比而言，10个小胰岛受体中的8个在移植后7-10天具有与正常水平接近或在正常水平的血糖水平，它们在整个8周时段内保持正常。在移植后8周，从肾囊取出胰岛移植物。固定所述组织，并关于胰岛素进行免疫标记。图4(左图)显示了来自接受小胰岛移植的动物的移植物，并血糖正常持续8周。在所述移植物中，存在胰岛素的大量染色。相比而言，图4(右图)显示了接受大胰岛移植的动物，所述动物继续高血糖持续8周时段，并在所述移植物中几乎没有表现出胰岛素的免疫T己O总之，前述实验证实，更小的胰岛(小于125μπι)在生存力、体内功能试验和移植结果方面优于大胰岛(超过125μπι)。另外，小胰岛的平均胰腺产率是大胰岛的约3倍，且更小的胰岛具有高大约20%的可存活性。最重要的是，当移植进糖尿病动物中时，小胰岛远远胜过大胰岛。实施例2:大胰岛向单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇的转化本实施例解释了将完整胰岛破碎或分散成小胰岛细胞簇(诸如图5所示的簇)和单个胰岛细胞的方法。使用常规酶消化，建立图6(A)中的小胰岛细胞簇，而用分级的钙清空形成图6(B)中的小胰岛细胞簇。如图6(A)中的照片所解释的，酶促分散会将所述胰岛破碎成小胰岛细胞簇，但是它不会“打开”所述簇，所以在所述簇内部的细胞具有几个细胞厚的扩散屏障。相比而言，就使用钙清空形成的小胰岛细胞簇而言(图6(B))，所述簇具有“打开的”形态学，所以当小胰岛细胞聚簇时，每个细胞具有更小的扩散屏障。预见到，酶消化和钙清空的组合也可以用于将完整胰岛转化成小胰岛细胞簇，如图6(C)所示。a.酶消化不同的酶混合液可以用于将完整胰岛破碎成小胰岛细胞簇和单个胰岛细胞。示例性的酶消化方法参见美国专利号6，783，954，它通过引用并入。在该实例中，使用的12种酶混合液取得不同程度的成功，包括I种含有木瓜蛋白酶的混合液。为了分离胰岛，通过腹膜内注射氯胺酮和赛拉嗪，麻醉Sprague-Dawley大鼠。暴露腹腔，并夹住与肠相连的胰腺导管。经由胆总管，在原位给胰腺插入套管，并通过将冷的胶原酶溶液抽入导管中进行扩张。随后，切离扩张的胰腺，转移至离心管，并在轻轻翻转下在37°C温育约30分钟。使洗过的消化物穿过筛，并在冷冻离心机中沉降。将沉淀物与Histopaque(密度=1.1085,SigmaDiagnosticsInc.,St.Louis,MO)相混合，并离心。然后将胰岛放入含有10%胎牛血清的Ham氏F12培养基中，并放入含有5%C02的37°C培养室中。β细胞分离的标准方案包括在含有4.8mMHepes的Hanks平衡盐溶液(“HBSS”)中温育完整胰岛(使用本文所述的技术分离)。参见Balamurugan等人，Flexiblemanagementofenzymaticdigestionimproveshumanisletisolationoutcomefromsub-optimaldonorpancreata.Am.J.Transplant3(9):113542(2003)。对于酶消化，将最后的9ml含有Iml木瓜蛋白酶(50单位/ml)的Hanks平衡盐溶液加入所述胰岛中。先用移液器轻轻上下抽吸胰岛，以确保完全冲洗。使胰岛沉降至试管的底部，并取出大部分上清液。在37°C缓慢地旋转在所述酶中的胰岛(约IOrpm)约30分钟。在此时，一些单个的分散的细胞形成小胰岛簇，并从所述溶液中取出。通常，将所述细胞转移至作为最终培养基的CMRL1066或MemphisSMF中。用双硫腙对细胞染色，用鉴别在所述簇内的β细胞，如图5和6(A)(酶)通常所/Jnοb.基于金属的破碎使用基于金属的破碎方案，也可以将完整胰岛破碎成小胰岛细胞簇和单个胰·岛细胞。基于金属的破碎的令人感兴趣的发现是，得到的小胰岛细胞簇具有更低的紧凑性，或具有“打开的”形态学。细胞粘附分子(诸如E-钙粘着蛋白)会将所述胰岛保持在一起，但是需要二价金属才能发挥功能。参见Hauge-Evans等人，Pancreaticbeta-cell-to—beta—cellinteractionsarerequiredforintegratedresponsestonutrientstimuli:enhancedCa2+andinsulinsecretoryresponsesofMIN6pseudoislets,Diabetes48(7):1402-8(1999)。因而，在无钙的培养基中培养胰岛约I小时，会产生“松散的”且破碎的胰岛结构(参见图6(B))，与此相比，使用单独的酶会产生更密集的胰岛结构(参见图6(A))。此外，在使用钙清空“松散”所述胰岛以后，剩余的β细胞簇可被传统的酶更容易地分散(参见图6(C))。基于金属的破碎的细节如下。为了得到单个胰岛细胞和小胰岛细胞簇，将胰岛放入不含钙-镁的Hanks平衡盐溶液+4.8mMHepes中。在约37°C温育约30分钟以后，移出细胞，将它们分散成小胰岛细胞簇或单个细胞。将所述细胞转移至作为最终培养基的CMRL1066。在必要时,用双硫腙鉴别小胰岛细胞簇或β细胞。参见Mythili等人，Culturepriortotransplantationpreservestheultrastructuralintegrityofmonkeypancreaticislets,J.ElectronMicrosc.(Tokyo)52(4):399-405(2003)。如图6(B)所示，通过单独的钙清空衍生出的小胰岛细胞簇具有不规则的管状排列，这对于簇核心的灌注而言可能是最佳的。另外，从基于金属的分散衍生出的簇仅需要约I小时即可生成，而酶破碎方案需要最多48小时。c.酶消化和金属分散的组合还使用酶消化和金属清空的组合作为分散技术，进行了实验。用9ml汉克平衡盐溶液(不含有钙或镁，含有4.8mMHepes)冲洗完整的胰岛。先用移液器轻轻上下抽吸胰岛，以确保完全冲洗。使胰岛沉降至试管的底部，并取出大部分上清液。重复地洗涤胰岛，以去除所有钙和镁。将最后的9ml不含有钙和镁的汉克平衡盐溶液(含有Iml木瓜蛋白酶(50单位/ml))加给所述胰岛。缓慢地旋转(IOrpm)在所述酶中的胰岛30分钟。在此时,可以从所述溶液中取出小胰岛簇。在中等速度强烈地抽吸2-3次，产生单个细胞。在1500相对离心力、25°C离心细胞5分钟。使用适当的培养基(取决于随后的试验)，重新悬浮单个细胞。在37°C和5%C02，在培养箱中储存细胞。如图6(C)所示，酶和钙清空方法的组合产生小胰岛细胞簇或单个细胞。此外，所述组合是总体上更快的分散方案，但是必须小心地避免过度消化和损伤细胞。在这些实验中，使用Y0-PR0-1和碘化丙唳(VibrantApoptotic试验，MolecularProbes)来测定坏死的和细胞凋亡的细胞。对于所述试验,将细胞与PBS—起放入OlympusFluoview300激光共焦显微镜上的Attofluor室(MolecularProbes)中。在从培养基取出细胞20分钟内，收集所有照片。使用He:Ne和氩激光，收集每个胰岛的3个同时照片和第三个明视野照片。通过使用透射光鉴别所述视野中的细胞，完成活/死分析。绿色的细胞指示细胞凋亡，而黄色/红色指示坏死性细胞死亡。缺少荧光发射的细胞是活细胞。将荧光照片与透射光照片(灰色)叠加。实施例3:将单个胰岛细胞和小胰岛簇制备在贴剂生物材料支架上前述实施例指示，小胰岛细胞簇和甚至单个β细胞应当代表用于运输氧、葡萄糖等的最高可实现的自由表面积。因而，在该实施例中，将单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇模板化在生物材料支架材料(诸如在图7中一般地显示的贴剂)上，以形成胰岛细胞多层。支架材料的筛选在该实施例中，通过测量所述胰岛细胞向所述生物材料的相对附着，研究了可用于制备本发明的支架的不同生物材料的优化。优选地，所述支架材料易于操纵，无需将所述组织和生物材料解离以实现容易的植入。表I解释了为与β细胞的相互作用而选择的多种生物材料。这些材料中的几种具有作为植入物的使用历史。在一个典型的实验中，首先制备列出的生物材料的1%储备溶液。将大多数材料溶解于在中性pH的去离子水中。聚氨基葡糖需要约5.5的更低pH来溶解(使用盐酸)，其它材料需要有机溶剂；例如在乙醇中的Cellform和在二氯甲烷中的聚(DL-乳酸-共聚-乙醇酸)(PLGA)。通常可溶于水中的聚合物(例如硫酸葡聚糖、海藻酸盐等)可以交联，以形成膜基质。将大约25μL的每种储备溶液加入96-孔平板的3个单个孔中，并蒸发或真空干燥，从而将薄生物材料膜沉积在每个孔的底部。残余的溶剂含量是微量的，不会在细胞中诱导毒性。还为细胞附着预筛选几种蛋白，所述蛋白可商业化地提供来促进在孔板上的细胞附着(例如纤连蛋白、层粘连蛋白等)。在96-孔平板中温育β细胞的稀释悬浮液过夜，并洗涤3次，以去除未结合的β细胞。β细胞悬浮液是均匀的，并假定每个孔中的相同的等分试样含有类似量的β细胞。将所有细胞计数标准化为来自不包括生物材料膜的孔的细胞计数。一般而言，轻度疏水的聚合物较好地附着β细胞(表I)。表I:选择的生物材料的相对β细胞附着生物材料相对细胞附着空孔(对照)I50:50PLGA羧基Mw=5.5kDa9.8+0.9层粘连蛋白8.7+0.6硫酸葡聚糖Mw=500kDa7.4+3.050:50PLGA-甲基酉旨iv=0.31dL/g6.8+0.7聚乙烯吡咯烷酮5.8+1.2硫酸葡聚糖MW=8kDa5.4+1.050:50PLGA-甲基酉旨iv=0.9dL/g5.2+0.850:50PLGA-甲基酉旨iv=0.58dL/g4.4+0.7Pluronic4.0+1.550:50PLGA-羧基iv=0.12dL/g3.9+0.7聚乙烯亚胺Mw=25kDa3.8+0.2纤连蛋白3.7+0.7PEG丙烯酸酯3.1+0.5聚氨基葡糖Mw=15kDa3.1±0.I胶原IV2.9+1.4PEGMw=8kDa2.8+1.I海藻酸盐2.4+1.2明胶2.0+0.2肝素I.7±0.2CellformI.7+0.7聚氨基葡糖Mw=IOOkDaI.5±0.7聚乙烯亚胺Mw=800Da1.2+1.0聚乙烯卩比略烧酮n.d.聚(乙烯醇)n.d.聚(丙烯酸)iV=固有粘度通过在涂布生物材料并洗涤3次以后24小时计数附着的细胞的数目，测定细胞附着。使用下述计算式，将所述计数标准化为附着于缺少生物材料的孔底部(参见空孔、对照)上的细胞的数目在目标孔中附着的细胞的数目/在空孔中的细胞的数目。一式三份地重复每个实验。一般而言，轻度疏水的聚合物较好地附着β细胞。光学显微照片指示，细胞形态学也受所述生物材料的影响。在聚氨基葡糖(MW=IOOkDa)上的β细胞表现出光滑的、圆形的表面，而在层粘连蛋白上的β细胞表现出伸展的且波缘的形态学(参见图8)。在层粘连蛋白基质上的β细胞中的肌动蛋白的荧光染色，强烈地揭示荧光细胞骨架焦点，这提示牢固的细胞附着。胰岛细胞贴剂的制备在该实施例中，所述胰岛细胞结合到包含PLGA的生物材料支架贴剂上。在血管化的膜岛中，平均β细胞距离血管不超过约25μm。参见Wayland,Microcirculationinpancreaticfunction,Microsc.Res.Tech.37(5-6):418-33(1997)。因为β细胞具有约IOym的直径，预期约3个细胞的细胞层厚度会最准确地模仿天然β细胞环境。一般而言，如以前所述，从大鼠胰腺分离出胰岛，并分