专利名称：一种自银杏叶中提取高黄酮含量活性物质的方法银杏(Ginkgo bilobal)又名白果树，属裸子植物，树龄可达千年以上，是古代二叠 纪孑遗植物，有植物界中“活化石”之称，是现存种子植物中最古老的孑遗植物。银杏树具 有适应性强、繁殖能力强等多方面的特点。银杏果的医疗及营养保健作用早已被人们所知，而对银杏叶的开发利用要晚得 多。德国和法国是世界上最早从事银杏叶产品开发的国家，他们在七十年代中期，首先开发 了治疗心血管病的银杏叶片，此后，其他国家相继致力于银杏制品的开发。近代科学表明，银杏叶的化学成分十分复杂，迄今为止已发现170多种化合物。其 中最重要的活性成分为黄酮类化合物和萜内酯类，其他的还包括有机酸类、氨基酸、糖类、 醇类、微量元素及维生素、叶绿素、生物碱类等。现代研究表明银杏叶活性物质中黄酮类含 量最高，为2. 5% 5. 91%。银杏叶提取物有清除氧自由基、拮抗血小板活化因子引起的 血小板聚集和血栓形成作用，具有降血脂、增强中枢神经系统功能、调节神经递质和激素水 平、改善血液流变状态、抗炎、抗过敏作用。具有促进视网膜神经细胞增生，显著升高视网膜 神经细胞的膜电位，对培养的视网膜神经细胞有良好的保护作用。随着对银杏叶提取物的 深入研究，其各种制剂已广泛应用于心、脑血管疾病。活性物质中总黄酮的含量直接决定着银杏叶的药用价值，要想获得较多黄酮，关 键是改进银杏叶的提取工艺。只有提高活性物质的得率，才能为下一步获取精制银杏黄酮 铺平道路。传统的提取方法主要有水浸提法，醇提取法等，采用传统的生产工艺很难获得较 高质量的银杏叶提取物。
本发明针对现有银杏叶提取工艺得率不高、杂质较多等方面的缺陷，旨在提供一 种新的提取方法，所要解决的技术问题是提高黄酮在活性物质中的含量。本发明的技术方案以银杏叶为原料，包括粉碎、预处理、提取、分离和纯化，与现有 技术的区别是粉碎后的银杏叶经预处理后再进行提取，所述的预处理是银杏叶粉末置于PH 值8-10的氢氧化钙溶液中微波处理l-3min，银杏叶粉末(质量)与碱液(体积)的料液 比为1 3-5，微波处理结束后加入等体积浓度65-95vt% (体积百分比，下同)乙醇溶液， 软包装并密封后于200-300ΜΙ^下处理15-25min得到预处理液；卸压、拆封后对预处理液用 浓度65-95vt%乙醇溶液于pH8-ll条件下加热回流提取至少两次，过滤分离后合并滤液， 调滤液PH值至7，再离心分离，得到上清液，向上清液中加入0. 3-0. 5wt% (质量百分比，下 同)抗氧化剂维生素E，搅拌均勻后得到上液样；所述的纯化就是对上液样用AB-8型大孔 吸附树脂振荡吸附分离纯化，即将AB-8型大孔吸附树脂浸泡于上液样中振荡吸附不少于 12h，吸附后分离，将树脂浸入60-70vt%乙醇溶液中振荡解析不少于ld，分离得到解析液。解析液减压脱溶回收乙醇，进一步浓缩成稠膏，真空冷冻干燥得到银杏叶高黄酮 含量的活性物质。具体操作步骤如下(1)银杏叶粉末制备将干银杏叶粉碎，过60目筛得到银杏叶粉末。(2)银杏叶的预处理取粉碎好的银杏叶粉末，加入一定量的pH为8-10的氢氧化钙溶液，置于微波功 率800W下处理1. 0-3. Omin。将微波处理后的银杏叶悬浮液置于聚乙烯袋中并加入等体积 65-95vt%乙醇溶液，密封。将密封好的聚乙烯袋子置于200-300Mpa高压下处理15_25min 得到预处理液后取出，静置，备用。(3)银杏叶活性物质的提取向银杏叶预处理液加入65-95vt%乙醇溶液，液料比(乙醇溶液体积mL 银杏叶粉 末质量g)为20 1，调pH为8-11，回流60min，静置，过滤，残渣加入65-95vt%乙醇溶液， 调pH值8-11，加热回流提取60min，静置，过滤，合并滤液，滤液即为粗提液。(4)离心处理调节粗提液的pH至7，10000r/min离心10_20min得到上清液；(5)上清液处理上清液中添加0. 3-0. 5wt% (以上清液质量计)抗氧化剂维生素E，得上液样。(6) AB-8型大孔吸附树脂吸附DAB-8型大孔吸附树脂预处理称取10_20g AB-8型大孔吸附树脂用4_5倍 75vt%的乙醇溶液浸泡树脂30min，倒出乙醇，水洗至无味，再用4_5倍4-8wt%碱和酸分别 处理30min。碱洗后水洗至pH 8_9;酸洗后水洗至pH 5_6。最后，将处理好的树脂装入容 器，用蒸馏水浸泡，得到预处理AB-8型大孔吸附树脂。2)振荡吸附移取银杏叶上液样置于装有AB-8型大孔树脂的锥形瓶中，盖上瓶塞，室温下不时 振荡吸附12h。3)振荡解吸已吸附树脂用50mL65Vt%的乙醇溶液浸泡震荡ld，分离收集解吸液。(7)浓缩并干燥解吸液减压浓缩成稠膏，回收乙醇，真空冷冻干燥得银杏叶活性物质成品。(8)黄酮含量的测定采用芦丁络合物分光光度法测定提取液中总黄酮含量。精确称取干燥至恒重的芦 丁(标准对照品)40mg置于IOOmL容量瓶中，加入75vt %乙醇溶液定容至IOOmL,即得芦 丁标准溶液。分别取5、10、15、20、25mL芦丁标准溶液用蒸馏水稀释至50mL，准确吸取5mL 于IOmL试管中，各加入IOwt %亚硝酸钠溶液0. 3mL，摇勻，放置6min ；加IOwt %硝酸铝溶 液0. 3mL，摇勻，放置6min ；加氢氧化钠溶液4mL，再用蒸馏水定容至刻度，摇勻，放置 15min。用蒸馏水作空白，在51 Onm处测定吸光度。准确称取干燥的活性物质IOOmg置于IOOmL容量瓶中，在最优条件下测定银杏叶 提取物吸光度，代入标准曲线方程中求出滤液中黄酮的浓度，然后计算出活性物质中总黄酮的含量。以银杏叶计，活性物质提取率可达25%，活性物质中黄酮含量达22%。本发明运用碱性条件下微波-高压联合辅助提取并结合非极性AB-8型大孔树脂 静态饱和吸附-解析法从银杏叶中提取活性物质的方法，微波促进了银杏叶有效活性物质 从细胞中溶出，高压促使细胞壁破裂，细胞内的提取物(活性物质)可以迅速溢出，与提取 剂本体(氢氧化钙溶液)混合，从而大大提高提取率。提取的银杏叶活性物质中黄酮含量 较高，本发明银杏叶中总活性物质提取率高达25%，活性物质中黄酮含量高达22% ；AB-8 型大孔吸附树脂对黄酮有良好的吸附-解析效果，吸附率可达80%以上，且成本较低，易再 生。四图1是芦丁标准曲线图。五
静置，备用。(3)银杏叶活性物质的提取向银杏叶预处理液中加入75vt%乙醇溶液，液料比(体积mL 质量g)为20 1， 调PH为8，加热回流60min，静置，过滤，残渣在上述条件下回流提取60min，静置，过滤，合并 滤液，滤液即为粗提液。(4)离心处理调节粗提液的pH值至7，10000r/min离心15min得到上清液。(5)上清液处理上层清液中添加0. 3wt%抗氧化剂维生素E，得上液样。(6) AB-8型大孔吸附树脂吸附1) AB-8型大孔吸附树脂预处理称取10. OOOgAB-8型大孔吸附树脂用4倍75vt% 的乙醇溶液浸泡树脂30min，倒出乙醇，水洗至无味，再用4倍6wt %碱和酸分别处理30min。 碱洗后水洗至PH 8;酸洗后水洗至pH 5。最后，将处理好的树脂装入容器，用蒸馏水浸泡， 得到预处理AB-8型大孔吸附树脂。2)振荡吸附移取上液样置于装有AB-8型大孔树脂的锥形瓶中，盖上瓶塞，室温下不时振荡吸 附 12h ；3)振荡解吸
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已吸附树脂用50mL65vt %的乙醇溶液浸泡静置振荡ld，收集解吸液。(7)、黄酮含量的测定采用芦丁络合物分光光度法测定提取液中总黄酮含量。(8)、浓缩并干燥解吸液减压浓缩成稠膏，回收乙醇，真空冷冻干燥得银杏叶活性物质1. 1991g。活 性物质中黄酮含量19.5%。实施例2 (1)银杏叶粉末制备将干银杏叶粉碎，过60目筛得到银杏叶粉末。(2)银杏叶的预处理取粉碎的银杏叶粉末5g，加入20mL pH为9的氢氧化钙溶液，置于微波功率800W 下处理3. Omin。将微波处理后的银杏叶悬浮液置于聚乙烯袋中并加入等体积90vt%乙醇 溶液，密封。将密封好的聚乙烯袋子置于300Mpa高压下处理15min得到预处理液后取出，
静置，备用。(3)银杏叶活性物质的提取向银杏叶预处理液中加入75vt%乙醇溶液，液料比(体积mL 质量g)为20 1， 调PH为8，加热回流60min，静置，过滤，残渣在上述条件下回流提取60min，静置，过滤，合并 滤液，滤液即为粗提液。(4)离心处理调节粗提液的pH值至7，10000r/min离心15min得到上清液。(5)上清液处理上层清液中添加0. 3wt%抗氧化剂维生素E，得上液样。(6)AB-8型大孔吸附树脂吸附1) AB-8型大孔吸附树脂预处理称取10. 000gAB-8型大孔吸附树脂用4倍75vt% 的乙醇溶液浸泡树脂30min，倒出乙醇，水洗至无味，再用4倍6wt %碱和酸分别处理30min。 碱洗后水洗至PH 8;酸洗后水洗至pH 5。最后，将处理好的树脂装入容器，用蒸馏水浸泡， 得到预处理AB-8型大孔吸附树脂。2)振荡吸附移取上液样置于装有AB-8型大孔树脂的锥形瓶中，盖上瓶塞，室温下不时振荡吸 附 12h ；3)振荡解吸已吸附树脂用50mL65Vt%的乙醇溶液浸泡静置振荡ld，收集解吸液。(7)、黄酮含量的测定采用芦丁络合物分光光度法测定提取液中总黄酮含量。(8)、浓缩并干燥解吸液减压浓缩成稠膏，回收乙醇，真空冷冻干燥得银杏叶活性物质1. 2506g。活 性物质中黄酮含量22. 1%。实施例3 (1)银杏叶粉末制备
将干银杏叶粉碎，过60目筛得到银杏叶粉末。(2)银杏叶的预处理取粉碎的银杏叶粉末5g，加入20mL pH为10的氢氧化钙溶液，置于微波功率800W 下处理3. Omin。将微波处理后的银杏叶悬浮液置于聚乙烯袋中并加入等体积90vt%乙醇 溶液，密封。将密封好的聚乙烯袋子置于300Mpa高压下处理15min得到预处理液后取出，
静置，备用。(3)银杏叶活性物质的提取向银杏叶预处理液中加入75vt%乙醇溶液，液料比(体积mL 质量g)为20 1， 调PH为8，加热回流60min，静置，过滤，残渣在上述条件下回流提取60min，静置，过滤，合并 滤液，滤液即为粗提液。(4)离心处理调节粗提液的pH值至7，10000r/min离心15min得到上清液。(5)上清液处理上层清液中添加0. 3wt%抗氧化剂维生素E，得上液样。(6)AB-8型大孔吸附树脂吸附1) AB-8型大孔吸附树脂预处理称取10. OOOgAB-8型大孔吸附树脂用4倍75vt% 的乙醇溶液浸泡树脂30min，倒出乙醇，水洗至无味，再用4倍6wt %碱和酸分别处理30min。 碱洗后水洗至PH 8;酸洗后水洗至pH 5。最后，将处理好的树脂装入容器，用蒸馏水浸泡， 得到预处理AB-8型大孔吸附树脂。2)振荡吸附移取上液样置于装有AB-8型大孔树脂的锥形瓶中，盖上瓶塞，室温下不时振荡吸 附 12h ；3)振荡解吸已吸附树脂用50mL65Vt%的乙醇溶液浸泡静置振荡ld，收集解吸液。(7)、黄酮含量的测定采用芦丁络合物分光光度法测定提取液中总黄酮含量。(8)、浓缩并干燥解吸液减压浓缩成稠膏，回收乙醇，真空冷冻干燥得银杏叶活性物质1. 2101g。活 性物质中黄酮含量20. 1%。实施案例4 (1)银杏叶粉末制备将干银杏叶粉碎，过60目筛得到银杏叶粉末。(2)银杏叶的预处理取粉碎的银杏叶粉末5g，加入20mL pH为10的氢氧化钙溶液，置于微波功率800W 下处理3. Omin。将微波处理后的银杏叶悬浮液置于聚乙烯袋中并加入等体积90vt%乙醇 溶液，密封。将密封好的聚乙烯袋子置于300MPa高压下处理15min得到预处理液后取出，
静置，备用。(3)银杏叶活性物质的提取向银杏叶预处理液中加入75vt%乙醇溶液，液料比(体积mL 质量g)为20 1，调PH为8，加热回流60min，静置，过滤，残渣在上述条件下回流提取60min，静置，过滤，合并 滤液，滤液即为粗提液。(4)离心处理调节粗提液的pH值至7，10000r/min离心15min得到上清液。(5)上清液处理上层清液中添加0.3wt%抗氧化剂维生素E，得上液样。(6)AB-8型大孔吸附树脂吸附1) AB-8型大孔吸附树脂预处理称取10. 000gAB-8型大孔吸附树脂用4倍75vt% 的乙醇溶液浸泡树脂30min，倒出乙醇，水洗至无味，再用4倍6wt %碱和酸分别处理30min。 碱洗后水洗至PH 8;酸洗后水洗至pH 5。最后，将处理好的树脂装入容器，用蒸馏水浸泡， 得到预处理AB-8型大孔吸附树脂。2)振荡吸附:移取上液样置于装有AB-8型大孔树脂的锥形瓶中，盖上瓶塞，室温下不时振荡吸 附 12h ；3)振荡解吸已吸附树脂用50mL65Vt%的乙醇溶液浸泡静置振荡ld，收集解吸液。(7)、黄酮含量的测定采用芦丁络合物分光光度法测定提取液中总黄酮含量。(8)、浓缩并干燥解吸液减压浓缩成稠膏，回收乙醇，真空冷冻干燥得银杏叶活性物质1. 1241g。活 性物质中黄酮含量18.7%。


一种自银杏叶中提取高黄酮含量活性物质的方法，将银杏叶粉末置于pH值8-10的氢氧化钙溶液中微波处理1-3min，银杏叶粉末质量与氢氧化钙溶液体积的料液比为1∶3-5；微波处理后加入等体积的65-95vt％乙醇溶液，软包装密封后于200-300MPa下处理15-25min得到预处理液；预处理液用浓度65-95vt％乙醇溶液于pH8-11条件下加热回流至少两次，合并滤液并调滤液pH至7，再离心分离得到上清液；向上清液中加入0.3-0.5wt％维生素E搅拌均匀得到上液样；上液样用AB-8型大孔吸附树脂吸附-解析，分离得到解析液，解析液经浓缩和真空冷冻干燥得到银杏叶活性物质。活性物质得率高达25％，其中黄酮含量高达22％。